Исследование эффекта мутаций в гене LMNA на электрофизиологические свойства кардиомиоцитов: 2020 г. этап 3

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание


Проект направлен на решение фундаментальной проблемы медицины и биологии развития – исследование роли белков ламинов в формировании электрофизиологичеких свойств кардиомиоцитов и функционировании сердечного натриевого канала Nav1.5(SCN5A).

Мутации в гене ламина А/С (LMNA) вызывают развитие ряда тяжелых заболеваний, таких как кардиомиопатии, миодистрофии, семейные формы липодистрофий и прогерия. Ядерные ламины являются основными белками ядерной оболочки и обеспечивают прочность ядерной мембраны клетки и взаимодействие внеядерных структур с компонентами ядра клетки. Для большинства ламинопатий, таких, например, как миодистрофия Эмери-Дрейфуса, кардиомиопатии и прогерия на сегодняшний момент не существует этиотропной терапии, что ведет к ранней инвалидизации и гибели больных в раннем возрасте. Так, например, среди больных, перенесших трансплантацию сердца, примерно 10% составляют больные с кардиомиопатиями, вызванными мутациями LMNA. Несмотря на большое количество исследований, посвященных ядерным ламинам, на сегодняшний момент нет единого общепринятого представления о патогенезе данной группы заболеваний. С учетом экспрессии ламинов во всех типах дифференцированных клеток представляется неясным избирательное поражение преимущественно кардиальной, мышечной, жировой и костной тканей. Несмотря на то, что поражение сердца, проводящей системы и сосудов при ламинопатии является одним из основных признаков заболевания, публикации, посвященные функции ламина А в клетках сердечно-сосудистой системы, единичны, что, отчасти, связано с отсутствием оптимальных клеточных моделей для изучения данных типов клеток. В последнее время функции ядерных ламинов рассматривают более широко, нежели исключительно в рамках механистической теории о поддержании целостности оболочки клеточного ядра. Так, доказано участие ядерных ламинов в пространственной организации хроматина, регуляции экспрессии генов и процессах передачи сигнала. Получены единичные данные о влиянии ядерных ламинов на процессы направленной дифференцировки клеток, в частности, в мышечном и кардиомиоцитарном направлениях. Характерной чертой всех ламинопатий с поражением сердечно-сосудистой системы является вовлечение проводящей системы сердца: развитие синдрома слабости синусового узла, атриовентрикулярных блокад и нарушений ритма. При этом, детальные молекулярные механизмы поражения проводящей системы сердца под воздействием ламиновых мутаций остаются нерасшифрованными, что ограничивает применение персонифицированных подходов к терапии и сужает круг возможных фармакологических подходов. Существуют данные о структурно-молекулярной дисфункции сердечного натриевого канала Nav 1.5 (кодируемого геном SACN5A) в развитии атриовентрикулярных блокад, нарушений ритма и проводимости. Так, показана ассоциация многих врожденных аритмогенных синдромов (синдром Бругада, синдром Лева-Ленерга, аритмогненная кардиомиопатия) с мутациями в гене SACN5A. Однако, детальных исследований электрофизиологических свойств натриевого канала Nav 1.5, равно как и других ионных каналов кардиомиоцитов под воздействием мутаций в гене LMNA в доступной литературе нами не найдено. Большинство опубликованных исследований в области ламинопатий проводились в основном с использованием siRNA-нокаутных клеточных линий, где ген ламина был полностью выключен при помощи технологии siRNA, что не отражает в полной мере физиологическую ситуацию и не позволяет смоделировать патологическое состояние, возникающее при гетерозиготных мутациях в гене LMNA. Предлагаемый же в данном исследовании подход основан на технологии получения индуцированных плюрипотентных клеток (ИПК) и их исследования методом фиксированного мембранного потенциала (patch clamp). В исследовании планируется получение линий ИПК от пациентов с мутациями в гене LMNA и клиническими проявлениями кардиомиопатий и нарушений ритма, направленная дифференцировка ИПК в кардиальном направлении, исследование электрофизиологических свойств сердечного натриевого канала Nav1.5 методом фиксированного потенциала и исследование активности сингального пути Wnt-ß/cathenin в данных клетках. В дополнение, на ИПК будут проведены исследования с применением метода CRISPR/Cas9 и моделированием описанных в литературе мутаций в гене LMNA, ассоциированных с нарушениями ритма и проводимости, а также созданием изогенных ИПК по отношению к линиям, несущим мутантные варианты гена LMNA. В данных типах клеток также будут исследованы электрофизиологические свойства сердечного натриевого канала Nav1.5 и исследование активности сингального пути Wnt-ß-cathenin. Раскрытие механизмов влияния ядерных ламинов на свойства и функции ионных каналов кардиомиоцитов позволит в дальнейшем разработать фундаментальные подходы к персонифицированной терапии данной тяжелой группы заболеваний. Таким образом, изучение ламиновых мутаций на электрофизиологические свойства кардиомиоцитов представляется весьма актуальным как с точки зрения фундаментальной биологии, так и с точки зрения практического применения. Предлагаемое исследование представляет несомненный интерес и важность для Российской науки и медицины.

7.3 Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб.
1.Идентифицировать мутации в гене LMNA у пациентов с кардиомиопатиями и нарушениями ритма и методом репрограммирования создать линии ИПК (от не менее, чем двух пациентов) с последующей направленной дифференцировкой в кардиомиоцитарном направлении.
2.С применением технологии CRISPR/Cas9 создать изогенные линии ИПК с коррекции мутаций в гене LMNA.
3.Исследовать электрофизиологические свойства сердечного натриевого канала Nav 1.5 в кардиомиоцитах, полученных путем направленной дифференцировки ИПК от пациентов с мутациями в гене LMNA.
4.Исследовать активности сигнального пути Wnt-ß/cathenin и экспрессию его ключевых генов-участников в кардиомиоцитах, полученных путем направленной дифференцировки из ИПК от пациентов с мутациями в гене LMNA.

7.4 Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Научная новизна и значимость предлагаемого проекта заключается в комплексной, многосторонней характеристике клеток полученных от пациентов с мутациями в LMNA.
Достижимость решения поставленной задачи и возможность получения запланированных результатов обусловливается рядом параметров. Доступность биологических образцов человека определяется наличием в рабочей группе врачей, заинтересованных в работе над данным проектом. Предлагаемые в проекте клеточные модели (индуцированные плюрипотентные клетки и их дифференцировка в кардиомиоциты) и системы оценки электрофизиологической активности, а также системы генетической модификации клеток и тестирования активации сигнального пути Wnt уже несколько лет используются, что отражено в публикациях научного коллектива.

7.5 Современное состояние исследований по данной проблеме.
Научный интерес к ядерным ламинам - белкам внутренней ядерной оболочки - существенно возрос после открытия мутаций в гене ламина А/С в качестве причины развития целой группы заболеваний, в частности, кардиомиопатий, миодистрофии Эмери-Дрейфуса, конечностно-поясничной миодистрофии, семейной липодистрофии и прогерии Гутчисона-Гилфорда (синдром преждевременного старения). Несмотря на большую актуальность данных исследований в связи с тяжестью течения и неблагоприятным прогнозом большинства ламинопатий, механизмы, посредством которых ядерные ламины вызывают развитие столь различных, на первый взгляд, заболеваний с поражением разных систем и органов остаются нераскрытыми. Актуальность исследований в данной области продиктована также потенциальной возможностью разработки терапевтических подходов на основе выяснения основных механизмов патогенеза данных заболеваний. Ядерные ламины являются составной частью ядерной оболочки, состоящей из ядерной мембраны, комплекса ядерных пор и ядерной ламины (Worman et al., 2008). Ядерная ламина представляет собой сеть из белков ламинов – представителей группы промежуточных филаментов, выстилающую внутреннюю поверхность ядерной мембраны. Длительное время считалось, что ламины выполняют исключительно механическую роль, обеспечивая структурную целостность ядерной оболочки и ее устойчивость к деформации. Это подтверждалось выявлением структурных аномалий ядра у больных с ламинопатиями. Однако недавно проведенные исследования значительно расширили данные представления о функциях ламинов. Так, в настоящее время является общепризнанным участие ламинов в процессах пространственной организации хроматина, регуляции ДНК-репликации и транскрипции (Dechat et al, 2008). Показано участие ламинов в процессах передачи сигнала и механотрансдукции путем интеграции через ламин-ассоциированные белки с цитоплазматической системой цитоскелета (Worman et al., 2006). Обеспечение данных функций определяется взаимодействием ламинов с рядом ламин-ассоциированных белков, транскрипционных факторов и хроматином (Schrimer et al., 2007). Показано, что ряд транскрипционных факторов, взаимодействующих с ядерными ламинами, участвуют в процессе дифференцировки прогениторных клеток. Несмотря на значительные успехи в понимании роли ламинов в дифференцировке прогениторных клеток в процессах старения и пространственной организации хроматина, исследований, посвященных молекулярным мезханизмам, лежащим в основе нарушений ритма при ламинопатиях, практически не проводилось. Не изученными являются основы дисфункции ионных каналов при ламинопатиях - собственно спектр ионных каналов, имеющих дисфункцию на фоне ламинопатий, механизмы регуляции ионных каналов ядерными ламинами. Неизученной является и связь между структурными ядерными белками и ионными каналами наружной клеточной мембраны. Предположительно, данная связь реализуется через регуляцию ионных каналов посредством магистральных сигнальных каскадов, таких как Wnt-ß/cathenin сигнальный путь и Notch сигнальный каскад. Однако, детальных исследований, посвященных взаимосвязи ламиновых мутаций и электрофизиологических свойств кардиомиоцитов до настоящего момента не проводилось. Это, отчасти, связано с отсутствием релевантных клеточных линий кардиомиоцитов, сложностью репертуара их ионных каналов в дифференцированном состоянии, а также сложностью генетической модификации данного типа высокодифференцированных клеток. Именно поэтому, предлагаемый нами подход с использованием ИПК и изогенных CRISPR/Cas9-модифицированных ИПК является наиболее физиологичным, информативным и релевантным. Выбор Wnt-ß/cathenin сигнального каскада в качестве мишени обусловлен уже опубликованными данными о его вовлечении в молекулярный патогенез аритмогенной кардиомиопатии и косвенными данными о его взаимосвязи с функцией сердечного натриевого канала Nav 1.5. К настоящему времени опубликовано всего одно исследование, посвященное изучению активности данного сигнального каскада при ламинопатиях (Le Dour C, 2017), в котором авторы продемонстрировали снижение активности пути Wnt-ß/cathenin в трансгенной мышиной модели, а также эффект увеличения проводимости и экспрессии коннексина 43 под влиянием активаторов Wnt-ß/cathenin каскада. Таким образом, исследование элктрофизиологических свойств кардиомиоцитов у пациентов с ламинопатиями и их взаимосвязь с изменением активности Wnt-ß/cathenin-сигнального каскада является актуальной и обладает несомненной научной новизной, а в сочетании с применением новейших клеточных и генно-инженерных технологий (ИПК, CRISPR/Cas9) и имеющимся научным опытом и заделом коллектива авторов, обеспечит высокую вероятность публикации полученных результатов в высокорейтинговых зарубежных журналах.



7.6 Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
Мутации в гене LMNA ассоциированы с кардиомиопатиями, миопатиями, дефектами проводящей системы сердца и нарушениями ритма. При этом, остается неясным, какие именно изменения происходят на уровне электрофизиологических свойств кардиомиоцитов. Одной из самых эффективных систем изучения патогенеза заболеваний, связанных с мутациями в конкретных генах, является получение линий индуцированных плюрипотентных клеток (ИПК) от пациентов с исследуемым заболеванием в модели транеспецифичной направленной дифференцировка этих клеток. В предлагаемом проекте этот подход будет реализован в форме кардиомицитарной дифференцировки ИПК. От пациентов с верифицированными мутациями в гене LMNA будут получены линии ИПК, затем с применением протоколов специфической дифференцировки будет проведена их дифференцировка в кардиомиоцитарном направлении и проведено сравнение электрофизиологических и биохимических свойств кардиомиоцитов от пациентов с мутациями в гене LMNA со «здоровыми» кардиомиоцитами. В качестве «здоровых» линий для группы сравнения будет использованы следующие два типа клеток:
1.Линии ИПК, полученные от здоровых людей – не менее 3 линий.
2.Изогенные («вылеченные») линий ИПК. Для этого из линий ИПК, полученных от больных с мутациями, при помощи метода CRISPR/Cas9 будут получены линии c «исправленной» мутацией и сходным набором остальных генетических вариантов.
Электрофизиологическая характеристика ионных каналов нескольких типов будет осуществляться с помощью метода локальной записи фиксированного потенциала (patch-clamp) в конфигурации whole cell («целая клетка»). Предполагается использование различных протоколов подачи электрических стимулов для оценки функциональных характеристик потенциал-зависимых натриевых, калиевых и кальциевых каналов. Будут оценены следующие свойства: плотность тока, вольт-амперная характеристика, проводимость, потенциал реверсии, параметры кривых стационарной активации и инактивации.
Ранее было показано, что сигнальный путь Wnt является нарушенным при оном из наиболее изученных аритмогенных состояний человека - аритмогенной кардиомиопатии, а его дисфункция напрямую приводит к нарушению функционирования натриевого канала Nav 1.5 в кардиомиоцитах (Худяков с соавт., 2015). В данном проекте нами будет детально изучена активность данного сигнального пути в кардиомиоцитах, а также экспрессия ключевых факторов данного сигнального каскада. С использованием указанных выше клеточных моделей будет произведено сравнение линий, несущих LMNA с мутацией, с соответствующими контрольными линиями и будет проанализировано:

1. оценена общая активация сигнального пути Wnt/β-cathenin на основании анализа люциферазных репортерных лентивирусных конструкций (будут использованы репортеры Top Flash-luc);
2. оценено влияние мутантных форм ламина на экспрессию генов-мишеней сигнального пути Wnt - Axin2, Dkk, β-cathenin. В модельных экспериментах будет произведено сравнение клеток с мутацией в гене ламина A и контрольных. Будет произведен анализ дифференциальной экспрессии генов методом RNAseq для выявления тех генных кластеров, на экспрессию которых оказывает влияние мутантный ламин A.
Эти экспериментальная часть позволит судить об активности Wnt/β-cathenin в клетках, несущих мутацию в гене LMNA.

Мы предполагаем, что выполнение предлагаемого проекта позволит пролить свет на механизм, посредством которого мутации в гене LMNA могут вызывать дисфункцию клеток проводящей системы сердца, что актуально как для фундаментальной клеточной биологии, так и для формирования подходов персонифицированной терапии.
Общий план работы на весь срок выполнения проекта.
1 год. Получение и характеристика линий ИПК от пациентов с мутациями в гене LMNA. Процесс получения линий трудоемкий, а их всестороннее тестирование (проверка плюрипотентности, кариотипа и других характеристик) - длительный–процесс. Мы предполагаем получить линии ИПК от не менее, чем 2 пациентов с верифицированными мутациями в гене LMNA и клинически значимыми нарушениямиритма. Согласно международным стандартам, для каждого пациента необходимо получение как минимум 5 линий ИПК. Этап получения линий ИПК и их проверки будет происходить в течение 1 года исследований. Публикация 1 статьи (Q1) и 2 статей в журналах Scopus.
2 год. Дифференцировка полученных ИПК в кардиомиоциты и оценка электрофизиологических характеристик клеток методом patch-clamp. Характеристика активности сигнального пути Wnt/β-cathenin в клетках пациентов и здоровых людей. Создание генетических конструкций для системы CRISPR/Cas9 c целью получения «вылеченных» изогенных ИПК. Публикация 4 статей в журналах Scopus.
3 год. Получение ИПК с «вылеченным» геном LMNA, проверка данных линий ИПК; сравнение кардиомиоцитов, дифференцированных из ИПК от пациентов с мутациями в LMNA, ИПК от здоровых людей и ИПК с «вылеченным» LMNA. Публикация 1 статьи (Q1) и 2 статей в журналах Scopus

7.7 Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (в данном пункте заполняется текстовое описание задела, а размещение прочей подтверждающей информации описано.
К настоящему моменту у коллектива имеется существенный научный задел который обеспечивает выполнение заявленного проекта:

-разработаны и успешно применяются протоколы выделения, наработки и культивирования ИПК, их направленной дифференцировки в кардиальном направлении (Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2013, 8(13), стр.1)
-получены и опубликованы первые данные о изменении экспрессии основных генов сигнального каскада wnt-ß-cathenin при адипогенно и кардиогенной дифференцировке под воздействием мутаций гена ламина (Цитология. 2013. - 5: - стр. 313-317. )
-выделены и забанкированы с соблюдением всех этических требований линии мононуклеаров от пациентов с мутациями в гене LMNA
-в лаборатории отлажены все технологии работы с лентивирусами и системой CRISPR/Cas9
-отработаны протоколы секвенирования гена ламина для выявления больных с врожденной патологией сердечно-сосудистой и нервно-мышечной систем для последующего забора у них мононуклеарной фракции клеток крови

-разработаны внутрилабораторные протоколы оценки качества РНК с помощью биоанализатора для наибольшей эффективности проведения ПЦР в реальном времени;
-отработана и активно используется методика записи фиксированного мембранного потенциала (patch clamp), а также методы оценки активности сигнального пути wnt-ß-cathenin методом люциферазного анализа.

Поскольку основная лаборатория, в которой выполняется проект, находится при НМИЦ им. Алмазова, у исследователей есть постоянный доступ к большому клиническому материалу, а также к материалу от пациентов и здоровых доноров с соблюдением все этических требований. Всё это обеспечивает выполнимость проекта и его как фундаментальную, так и потенциальную клиническую значимость.

В результате выполнения предыдущего проекта, поддержанного РФФИ (14-04-01265) было проведено секвенирование нового поколения и выявлены пациенты несущие мутации в гене LMNA; у пациентов был верифицирован диагноз кардиомиопатий и забран биологический матриал для дальнейшего получения мезенхимных стволовых клеток, мононуклеаров крови и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В частности:

Пациент 1. 56 лет. Диагноз – семейная дилатационная кардиомиопатия. Конечностно-поясная мышечная дистрофия. Нарушения ритма и проводимости (AV-блокада II степени). Мутация в гене LMNA A146D . Мутация описана впервые в мире.

Пациент 2. 18 лет. Миодистрофия Эмери-Дрейфуса. Нарушение ритма и проводимости. AV-блокада II степени. Пароксизмальная форма трепетания/фибрилляции предсердий. Мутация в гене LMNA R249Q, описанная ранее как патогенная (rs59332535).

Пациент 3. 39 лет. Пароксизмальная желудочковая тахикардия. AV-блокада I степени, SА –блокада I степени. У дочери пробанда – периферическая нейропатия то типа Шарко-Мари-Тут. Слабо выраженная миопатия по данным электромиоргафии. Мутация в гене LMNA (D357V), ранее не описанная.

Пациент 4. 47 лет. Миодистрофия Эмери-Дрейфуса. Дилатационная кардиомиопатия. V Мутация в гене LMNA (R527P), ранее описанная в связи с миодистрофией и кардиомиопатией.

7.8 Детальный план работы на первый год выполнения проекта.
Получение и характеристика линий ИПК от пациентов с мутациями в гене LMNA. Репрограммирование мононуклеарной фракции крови от пациентов с верифицированными мутациями в LMNA и кардиомиопатиями. Получение репрограммированных клонов, наращивание перспективных клонов ИПК, проверка плюрипотентоности in vitro: окраска Oct Nanog, SSEA4, Tra-1-81. Щелочная фосфатаза. Проверка плюрипотнетности in vivo – инъекция суспензии клеток иммунодефицитным мышам Nude, проверка формирования производных эктодермы, энтодермы и мезодермы по гистологическим срезов опухолей. Отбор успешных клонов и проверка способности дифференцироваться в кардиомиоциты.
7.9 Ожидаемые научные и (или) научно-технические результаты (без перечисления указанных в п.п. 4.3.10, 4.3.11, 4.3.12) и их научная и общественная значимость (например, оценка соответствия запланированных результатов мировому уровню исследований, возможность практического использования запланированных результатов проекта в экономике и социально-политической сфере). Допустимо размещение всех указанных сведений в файле типа «Заявка», прикрепленном в разделе «Документы», в таком случае в данной графе указывается название файла.
Молекулярные механизмы дисфункции ионных каналов вследствие мутаций в гене ламина А/С (LMNA) могут послужить основой для подбора персонифицированной терапии и разработки новых фармакологических подходов, как с применением субстанций, воздействующих на активность ионных каналов, так и с применением веществ, избирательно и специфично модулирующих активность Wnt/β-cathenin сигнального пути в кардиомиоцитах.
Короткий заголовокGZ-2020
АббревиатураM1_2018 - 3
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания20/04/2031/12/20

Ключевые слова

  • ламин А
  • ламинопатии
  • электрофизиология
  • стволовые клетки
  • ионные каналы
  • генная инженерия