Исследование происхождения и современного состояния сортов и видов злаковых культур и их дикорастущих предков с использованием локус-специфичного секвенирования нового поколения (tag-NGS): 2020 г. этап 1

  • Родионов, Александр Викентьевич, Ботанический институт им. В.Л. Комарова (руководитель)
  • Лоскутов, И. Г. (исполнитель)
  • Чикида, Надежда Николаевна (исполнитель)
  • Ковалева, Ольга Николаевна (исполнитель)
  • Коцеруба, Виолетта Владимировна (исполнитель)
  • Мачс, Эдуард Модрисович (исполнитель)
  • Носов, Николай Николаевич (исполнитель)
  • Гнутиков, Александр Александрович (исполнитель)
  • Журбенко, Петр Михайлович (исполнитель)
  • Синяева, Екатерина Владимировна (исполнитель)

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

В условиях интенсивного земледелия все больше проявляется тенденция утраты биологического и, что особенно важно, генетического разнообразия культурных видов растений. Для всех возделываемых в условиях интенсивного земледелия сельскохозяйственным культурам характерен процесс «генетической эрозии», суть которого в обеднении разнообразия аллелей (генетического разнообразия) возделываемых и создаваемых сортов сельскохозяйственных культур из-за сужающегося круга исходного материала для селекции. Выход из кризиса видится в поиске новых перспективных аллелей в геномах диких видов, находящихся в природе (in situ), и во введении в селекционную практику староместных сортов, сохраняемых в генных банках (ex situ). Целесообразность сравнительного изучения геномной композиции перспективных староместных сортов и диких видов овса и ячменя, изучение генетического и геномного разнообразия подвидов дикорастущих предков пшеницы Aegilops tauschii и их участия в создании высокопродуктивных и устойчивых сортов пшеницы обусловлена большим интересом селекционеров к их практическому использованию. Широкий диапазон адаптаций данных форм к неблагоприятным факторам внешней среды, их приспособленности к разнообразным почвенно-климатическим условиям, устойчивости к патогенным организмам, признаков, связанных с элементами повышенной продуктивности и качества, представляет уникальный источник исходного материала для селекции.

В частности, на последней 10 Международной конференции по овсу (10IOC 2016) в Санкт-Петербурге, важнейшей конференции по селекции, генетике и геномике овса в мире, руководителями и организаторами которой были участники данного проекта, было отмечено, что наиболее актуальными направлениями расширения исходного материала для селекции являются более активное вовлечение в селекционный процесс местных, староместных сортов народной селекции и малоизученных видов рода Avena (http://oats2016.org/). Эти направления работы с селекционным материалов актуальны также для пшениц и ячменей.

Наше сравнительное исследование композиции геномов селекционных и староместных сортов и диких видов рода Hordeum (селекционные сорта, староместные сорта H. vulgare, дикорастущие подвиды H. vulgare ssp. spontaneum, которые свободно скрещиваются с культурным ячменем, дают плодовитое потомство и вид с H-геномом H. bulbosum L.), исследование вклада в геном современных сортов овсов геномов дикорастущих диплоидных и тетраплоидных видов с С- и A- геномами, многочисленных и разнообразных по композиции генома дикорастущих подвидов вида Aegilops tauschii, даст важную информацию для новых работ по селекции, поскольку использование дикорастущих видов сельскохозяйственных культур наряду с раскрытием геномного разнообразия сортов народной и промышленной селекции является наиболее перспективным направлением для борьбы с генной эрозией.

Направление нашего проекта полностью совпадает с научным направлением Стратегии НТР РФ, так как он нацелен на создание новых высокопродуктивных, высоко адаптивных и устойчивых к абиотическим факторам среды сортов ячменя, овса, пшениц.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.

Фундаментальная генетическая особенность культурных пшениц (род Triticum) и овсов (Avena) состоит в том, что это аллополиплоиды (тетраплоиды и гексаплоиды), геном ядра которых сформировался в результате объединения в одном ядре геномов двух или трех разных родов и видов злаков. Так ядерный геном гексаплоидных пшениц имеет в своем составе три генома – геномная формула AABBDD (2n=42). Геномы эти разного происхождения. Геном D, в частности, пшеницы получили от вида, близкого к Aegilops tauschii. Разные геномы принесли культурным сортам разные качества. Так гены, связанные с хлебопекарными характеристиками пшеницы, отличающими ее от других злаков, получены пшеницей с геномом D. Возник ли каждый аллополиплоидный вид культурных злаков однократно или имели место несколько независимых актов межвидовой гибридизации, происходивших в разное время, в разных участках ареала родительских видов и относились ли предки к одному или разным подвидам в настоящее время неизвестно, однако может быть выяснено, в частности, и в ходе данного исследования.

В отличие от культивируемых видов пшениц и овсов, в кариотипе ячменя Hordeum vulgare всего две копии генома (2n=14), хотя геном относительно большой - 4-5 млрд. п.н. (Bennett and Smith, 1976; Kankanpää et al., 1996). Однако, как все злаки, это палеополиплоид, в генеалогии которого имели место 3-4 раунда полногеномных дупликаций (Salse, 2017). Кроме того, какое-то участие в эволюции генома ячменей могли иметь место акты гомоплоидной межвидовой гибридизации, не сопровождавшиеся дупликацией генома. Проблема роли и места гомоплоидной гибридизации в эволюции растений и в генезисе сельскохозяйственных культур в частности, малоисследована. Гомоплоидные гибриды на ранних стадиях часто бесплодны или демонстрируют другие физические барьеры для дальнейшего развития, которые необходимо преодолеть естественным отбором для превращения гибрида в новый сорт или новый вид (Rieseberg et al. 1995; Abbott et al. 2010; Folk et al. 2018).

Актуальность планируемого нами цикла работ обусловлена тем, что исследования последнего времени показали: события межвидовой гибридизации, как правило, сопровождаются множественными изменениями генома и эпигенома, экспансией транспозонов, утратой значительной части генов одного из родителей, замещением гомеологов (скрытой анеуплоидией) (Родионов А.В. и др. Генетические последствия межвидовой гибридизации, ее роль в видообразовании и фенотипическом разнообразии растений // Генетика. 2019. Т. 55. №3. С. 255-272). Как именно сформировались геномы современных и староместных сортов злаков в настоящее время известно лишь в общих чертах, на основании сохранившихся записей селекционеров, однако может быть выяснено или верифицировано с использованием технологии локус-специфичного секвенирования нового поколения. Есть все основания думать, что генетическое и геномное разнообразие происхождения и современного состояния сортов и видов культурных злаков значительно выше, чем это считалось ранее. Выявить его в ходе настоящего проекта и использовать эти знания в дальнейшей селекционной работе – наша задача.

Научная новизна проекта состоит в том, что появившиеся относительно недавно методы секвенирования нового поколения (NGS) впервые позволили эффективно раскрывать внутригеномный полиморфизм полиплоидных видов, в частности, многократно повторенных в геноме генов 35S рРНК и их транскрибируемых спейсеров. Последние являются наилучшими для растений ДНК-идентификаторами видов (ДНК-штрихколами) (Shneyer V.S., Rodionov A.V. Plant DNA Barcodes // Biology Bulletin Reviews. 2019. Vol. 9. #4, p. 295-3900. DOI: 10.1134/S207908641904008X; Жохова Е.В., Родионов А.В., Повыдыш М.Н. и др. Современное состояние и перспективы использования ДНК-штрихкодирования и ДНК-фингерпринтинга для анализа качества лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов // Успехи современной биологии. 2019. Т. 139. №1. С. 25-40). Нами показано, что пыяив внутригеномный полиморфизм рДНК гибрида или вида гибридного происхождения можно эффективно определять происхождение гибридного генома и количественно оценивать присутствие в геномах аллополиплоидов рДНК каждого из предковых видов (Беляков Е.А., Мачс Э.М., Михайлова Ю.В., Родионов А.В. Гибридизационные процессы в рамках рода Sparganium L. подрода Xanthosparganium Holmb. по данным секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing — NGS) // Экологическая генетика. – 2019. – Т. 17. – № 4. – С. 25–33. https://doi.org/10.17816/ecogen17425-33; Rodionov A.V., Krainova L., Gnutikov A.A. и др. Intragenomic polymorphism of internal transcribed spacer ITS1 in the locus 35S rRNA of polyploid Avena species // Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology (PlantGen2019). The Fifth International Scientific Conference. Novosibirsk, –2019. – P. 166). Для объектов нашего исследования методы никогда не применялись или применялись нами и фрагментарно (Rodionov et al., 2919, цит. выше).

Использование диких видов ячменя наряду с местным сортовым разнообразием является наиболее перспективным направлением для борьбы в «эррозией генофонда» культивируемых видов ячменя, расширения генетической основы для селекции создаваемых новых сортов. Генетическая коллекция ячменя ВИР (куратор – участник проекта О. В. Ковалева) уникальна по внутривидовому разнообразию ячменя (более 18000 образцов, из них 5000 местных и стародавних сортов). Наиболее интересные из них в рамках данного проекта, будут впервые охарактеризованы с помощью усовершенствованной на основе NGS технологии ДНК-штрихкодирования (генетическая паспортизация). Впервые таким образом будут изучены староместные сорта ячменя, собранные Н.И. Вавиловым и П. М. Жуковским. Это может дать возможность выделить в составе генетической коллекции ВИР новые источники аллелей и доноры хозяйственно ценных признаков, адаптивности и устойчивости к биотическим стрессам, способные расширить генетическую основу культурного ячменя. Следует отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и NGS секвенирования ранее не проводилось.

Предполагается создание геномной коллекции (коллекции тотальной геномной ДНК, выделенной из листового или семенного материала) диких видов и староместных и селекционных сортов ячменя. Наличие подобной коллекции значительно упростит геномные исследования рода и положит начало генетической паспортизации сортов и видов овса, что имеет стратегическое значение для их идентификации и последующего использования в селекционной работе особенно во временной перспективе.

Использование диких видов овса наряду с местным сортовым разнообразием культурных видов является наиболее перспективным направлением для расширения генетической основы и уменьшения генной эрозии создаваемых новых сотов. Коллекция ВИР обладает уникальным внутривидовым и видовым разнообразием овса (более 13000 образцов, относящихся к 4 культурным видам и 26 диким видам овса), для наиболее интересных из них (на этом этапе исследований) мы впервые предлагаем провести генетическую паспортизацию по маркерным последовательностям ДНК, используемым при ДНК-штрихкодировании. В ходе этого исследования впервые будут изучены староместные сорта овса, собранные в 20-е годы ХХ столетия. Это путь к выявлению новых источников и доноров хозяйственно ценных признаков продуктивности, адаптивности и устойчивости к абиотическим стрессам, расширяющих генетическую основу культурного овса, для использования в селекционных программах. Надо отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия овса для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и секвенирования по Сэнгеру и локус-специфичного секвенирования NGS для маркерных ядерных и хлоропластных последовательностей до настоящего времени не проводилось. При изучении внутригеномного полиморфизма рДНК и изучении роли и места, которую играла межвидовая гибридизация в истории современных диплоидных и полиплоидных видов Avena и сортов овса посевного нами будет использован метод targeted-секвенирования «популяции» ITS-последовательностей полиплоидных геномов и, при необходимости, генов 5S рРНК, на платформе Illumina.

Род Avena довольно разнообразен, виды, входящие в него, имеют три уровня плоидности (x = 7, 2n = 14, 28, 42) и сильно различаются по геномному составу и эколого-географическому распространению. Большинство этих видов является дикими, произрастающими либо в ненарушенных фитоценозах, либо как сегетальные сорняки (Лоскутов, 2007). В тоже время, нет единого мнения о происхождении отдельных видов овса, их систематическом положении и родственных связях. До настоящего времени существуют значительные разногласия в объеме рода, особенно касающиеся выделения редких специализированных видов из видов-агрегатов (Цвелёв, 1976; Лоскутов, 2007; Loskutov, Rines, 2011). Изучение видов-агрегатов в полном объеме, и, в частности, изучение геномной конституции этих видов методами геномики, до сих пор не проводилось, таксономический статус таких сорных видов овса, как A. volgensis, A. septentrionalis, A. intermedia, A. aemulans и др., в сущности, не известен. Наши методы, включая использование специальных праймеров на маркерные последовательности C-генома овса и targeted-секвенирование, позволят выявить геномную конституцию диких и культурных видов этого рода и точно указать диких родственников культурных видов овса.

Хлебная (мягкая) пшеница Triticum aestivum L (2л = 42) является естественным аллополиплоидом с геномной формулой BBAADD в образовании которого принимали участие диплоидные виды Triticum и Aegilops. Triticum urartu является донором генома А, геном D ведет свое происхождение от Aegilops tauschii., а наиболее вероятным донором генома В из пяти видов Aegilops секции Sitopsis язляется Ае. speltoides (Feldman, 2001), В рамках данного проекта мы планируем исследовать вклад субгеномов разных подвидов (природных рас) Ae. tauschii в гексаплоидный геном разных сортов пшеницы. Генетическая коллекция эгилопсов и пшениц ВИР уникальна как по набору линий пшеницы, в которых представлены субгеномы, произошедшие от Ae. tauschii (возможно, от разных подвидов), так и, главное, включает в себя богатую коллекцию Ae. tauschii разного происхождения, в том числе разные подвиды – всего 674 образца, из которых в работу, по нашим предварительным данным, прежде всего будет взято 12.

Современное состояние исследований по данной проблеме.

Объем и структура рода Avena, а также происхождение отдельных видов до сих пор вызывает споры среди исследователей. Значительный вклад в познание рода Avena внесли ученые ВИРа, и прежде всего А. И. Мальцев (1929, 1930), исследовавший все известные в то время виды рода Avena, в своей монографии «Овсюги и овсы» (1930). Мальцев дал наиболее полную филогенетическую систему типовой секции (Euavena Griseb.) рода Avena. Большое внимание филогении овса уделял Н. И. Вавилов (1919; 1926, 1927). В современных классификациях рода Avena наблюдаются две тенденции: укрупнение видов (основной критерий – скрещиваемость) и дробление их на основании морфологических и кариологических различий. В соответствии с этим число признаваемых видов колеблется от 7 (Ladizinsky, Zohary, 1971) до 31-34 (Baum, 1977, Zeller, 1998).

Современные прикладные и общебиологические исследования рода Avena в значительной степени опираются на молекулярно-филогенетические и кариологические данные. Так, достаточно много работ посвящено родству единственного многолетнего тетраплоидного вида A. macrostachya и диплоидных видов рода Avena (Fominaya et al., 1988; Pohler, Hoppe, 1991; Leggett, 1992; Leggett, Markland, 1995; Родионов и др., 2005; Badaeva et al., 2010). Геном этого уникального многолетнего автотетраплоидного вида ближе всего к C-геномам других видов Avena, кроме того, установлено, что его геном образовался еще до эволюционного разделения A и C-геномов овса (Родионов и др., 2005; Badaeva et al., 2010).

Анализ родства геномов видов рода Avena разного уровня плоидности методом RAPD, проведенный И.Н. Перчук и соавт. (2002) показал, что диплоидные виды рода Avena разделяются на две клады – виды с геномами А и виды с геномами С. При этом хорошо заметно отличие по набору амплифицируемых фрагментов у видов с геномами Cp (A. clauda и A. pilosa) от набора фрагментов, характерного для A. ventricosa (геном Cv). Различаются Cp и Cv геномы и по последовательностям ITS1 (Родионов и др. 2020 – в печати). В последнее время интересные данные получены при изучении полиморфизма ретротранспозонов и ISSR-маркеров, затрагивающих весь геном (Katsiotis et al, 1996; Paczos-Grzeda, Bednarek, 2014). По положению в геноме ретротранспозонов гексаплоид A. sativa оказался ближе к A. sterilis, чем к диплоиду A. strigosa (Tomas et al., 2016). ISSR-маркеры оказались эффективны в распознавании различных сортов овса и показали, что A. fatua ближе к A. sativa, чем к A. sterilis (Paczos-Grzeda, Bednarek, 2014). При этом авторы предполагают, что A. sterilis является предковым для A. fatua. Испанские исследователи использовали ретротранспозоны, а также ITS-последовательности при изучении родства гексаплоидных A. sativa, A. sterilis и диплоида A. strigosa. Анализ ITS-последовательностей показал очень высокую гомологию у всех трех видов (Родионов и др., 2005), но при проведении FISH были обнаружены различия в расположении ядрышковых организаторов (содержащих гены 35S рРНК).

При исследовании молекулярной филогении рода Avena используются различные маркеры, такие как последовательности ITS1-гена 5.8S рРНК-ITS2 (Rodionov et al., 2005; Nikoloudakis et al. 2008; Nikoloudakis, Katsiotis 2008), интрона гена LEAFY (Peng et al., 2010), внешние транскрибируемые спейсеры (Rodrigues et al., 2017). Эти работы прояснили ряд родственных взаимоотношений между видами Avena с разными геномами: показано, что B и D субгеномы полиплоидов близко родственны A-субгеномам полиплоидов и А-геномам диплоидов, в то время как виды с C-геномами очень сильно отличаются от них (Rodionov et al., 2005; Nikoloudakis et al. 2008; Nikoloudakis, Katsiotis 2008, Badaeva et al., 2010).

Исследование происхождения полиплоидных видов овса путем сравнительного изучения полиморфных ДНК-маркеров пока не позволяет сделать однозначных выводов о системе рода. Так, Li et al. (2000) изучили встречаемость видоспецифичной стателлитной ДНК ASS49, 40 микросателлитов и 4 минисателлитов у диплоидов и полиплоидов для того, чтобы определить вид, который был диплоидным и тетраплоидным предком гексаплоидного овса. Это сравнение показало, что Ac геном диплоида A. canariensis является вероятным предковым геномом для А-субгеномов гексаплоидов скорее, чем A. strigosa, обычно рассматриваемая в этом качестве. Однако изучение других полиморфных маркеров дает другие результаты. Так паттерны AFLP диплоидов, тетраплоидов и гексаплоидных видов овса показывают, что не A. canariensis, а A. wiestii представляется более вероятным донором А-геномов гексаплоидов с геномной конституцией ACD (Fu and Williams, 2008). Вывод о том, что именно A. wiestii, был одним из доноров А-геномов для гексаплоидов A. sativa, A. occidentalis, A. sterilis и тетраплоида A. murphyi следует и из сравнения хлоропластных последовательностей trnL-F и ядерного гена Acc1 (Peng et al., 2010b; Yan et al., 2014).

Паттерны рестрикции хлоропластной и митохондриальной ДНК показали, что пластиды и митохондрии овса посевного и других гексаплоидных и тетраплоидных видов получены от А-геномных, а не от С-геномных предков. Поскольку пластидная и митохондриальная ДНК наследуется у злаков по материнской линии, это означает, что гексаплоидные виды овса получили материнский геном от какого-то А-геномного диплоида. Филогенетический анализ основанный на хлоропластном межгенном спейсере trnL-trnF psbA-trnH подтвердил, что некий А-геномный вид был предком гексаплоидных видов овса с материнской стороны (Nikolaudakis and Katsiotis, 2008; Peng et al., 2010b; Yan et al., 2016; Fu, 2018).

Донор С-генома полиплоидных видов овса также остается неизвестным. Основываясь на исследовании кариотипов, характерной морфологии, способности к межвидовому скрещиванию и возможной области возникновения гексаплоидных видов, Тибор Раджанти (Rajhathy, 1966) предположил, что A. ventricosa является наиболее вероятным донором С-субгенома гексаплоидных видов овса. Е. Бадаева и соавторы (Badaeva et al., 2010) пришли к такому же заключению исследуя С-бэндинг и картируя 35S и 5S рРНК гены у диплоидов и полиплоидов. При этом, Бадаева полагает, что гексаплоиды получили Cv геном A. ventricosa через тетраплоидный вид A. magna или A. insularis. С другой стороны, Ли с соавторами (Li et al., 2000), используя полиморфизм микросателлитов, показали, что A. eriantha (CpCp) является не менее вероятным донором С-генома для сложно-составного ACD генома гексаплоидов. Сравнение AFLP паттернов полиплоидных и диплоидных видов также показало, что Ср геном A. eriantha близок С-субгеному гексаплоидных видов овса (Fu, Williams, 2008). И, наконец, Пенг с соавт. (Peng et al., 2010) использовали второй интрон гена FLORICAULA/LEAFY показал, что С-геном диплоидного вида A. clauda (Сp) играл важную роль в происхождении как С- так и D-геномов полиплоидных видов овса. Таким образом, на сегодняшний день, все три дикорастущих диплоидных вида с С-геномами едва ли не с равной вероятностью могут рассматриваться как возможные предки С-субгенома полиплоидов.

В настоящее время требуется расширить круг источников и доноров ценных признаков и более эффективно использовать все имеющееся мировое разнообразие культурного и дикого овса. Прогресс в достижении этой цели становится все более важным, учитывая признаки утраты генетического разнообразия овса в различных регионах мира (Baohong et al., 2003; Fu et al., 2003; Achleitner et al., 2008), и проявление «генетической эрозии» у современных селекционных сортов. Недостаточное финансирование, выделяемое на проведение молекулярно-генетических работ по овсу по сравнению с другими зерновыми культурами, означает, что в познании генома овса остаются большие пробелы. Все это приводит к тому, что многие аспекты морфологии и строения репродуктивных органов, важных для селекции и производства, у овса еще предстоит генетически охарактеризовать и, кроме того, существует постоянная потребность для различных регионов мира в идентификации аллелей генов, придающих сортам устойчивость к важнейшим грибным заболеваниям (Winkler et al., 2016).

В значительной степени остаются невостребованными и недостаточно изученными в плане их генетического потенциала староместные популяции, сохраняемые в коллекции ВИР на протяжении длительного времени, и многие селекционные сорта овса. Наш проект предполагает комплексный подход к определению генетического разнообразия, выделению новых доноров и изучению процессов эволюции на видовом и внутривидовом уровне с использованием уникальных коллекционных материалов и самых современных методов исследования.

Ячмень (Hordeum vulgare L.) – одна из первых однолетних одомашненных культур длинного дня, получившая широкое географическое распространение в обитаемом человеком мире. Как объект генетических исследований ячмень характеризуется рядом биологических преимуществ: диплоидной природой и небольшим числом относительно крупных хромосом, почти клейстогамным типом опыления и легкостью гибридизации. Дикорастущие виды рода Hordeum (их около 33 видов - Bothmer et al. 1995) обладают рядом ценных признаков, таких как устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, в связи с чем их использование в интрогрессивной гибридизации представляет интерес для расширения генетического разнообразия культурного ячменя. При этом вопрос о том, имели ли место такие акты межвидовой гомоплоидной гибридизации при образовании староместных сортов остается открытым.

В зависимости от возможности использования в селекции культурного ячменя генофонда сортов и дикорастущих видов рода последние подразделяют на три генетических пула: первичный (селекционные сорта, староместные сорта, дикорастущие подвиды, такие как H. vulgare ssp. spontaneum, которые свободно скрещиваются с культурным ячменем, дают плодовитое потомство), вторичный (H. bulbosum L.) и третичный (все остальные виды Hordeum) генный пул (Bothmer et al., 1992).

Важность и перспективность межвидовых гибридизаций в селекции Hordeum для расширения генетического потенциала культуры очевидна. Так гены эффективной устойчивости к мучнистой росе выявлены у образцов H. spontaneum K. Koch. Ячмень луковичный имеет ряд ценных признаков, таких как устойчивость к мучнистой росе, стеблевой и листовой ржавчине, которые могут быть интродуцированы при гибридизации этих видов (Jones, Pickering, 1978). В ряде исследований на основе гибридов H. vulgare c H. bulbosum были получены формы H. vulgare с интрогрессией генетического материала H. bulbosum (Pickering, 1988; Pickering et al., 2000; Jonson, Pickering, 2002). Среди интрогрессивных форм выявлены формы, устойчивые к BaMMV, BaYMV, BYDV вирусам, идентифицированы новые гены устойчивости (Michel, 1996; Ruge, et al,2003; Ruge-Wehling et al., 2006; Scholz et al., 2009).

Почти половина видов рода Hordeum - полиплоиды (тетра и гексаплоиды). По этой причине род Hordeum - хорошая модель для изучения видообразования, идущего через полиплоидизацию. С другой стороны, корректно определить происхождение аллополиплоидных видов ячменя – сложная, ранее, в догеномную эру, трудноразрешимая задача. Не случайно, даже через 50 лет исследования видовых отношений в роде Hordeum, филогения рода до сих пор предмет дискуссий (Brassac et al., 2015; Blattner, 2018). большинство филогенетических исследований, опубликованых на сегодняшний день, были направлены на разрешение отношений только нескольких полиплоидных видов рода (Salomon, Bothmer, 1998; Petersen, Seberg, 2004; Taketa et al., 2009; Brassac et al., 2015; Blattner, 2018).

Староместные сорта, ячменя собранные в экспедициях Н.И. Вавилова и П.М. Жуковского, изучали в 30- 60е годы ХХ столетия. В настоящее время к ним возрос интерес в связи с выявлением новых источников селекционно важных признаков в условиях изменяющегося климата. Местные образцы изучали на чувствительность к фотопериоду, устойчивость к сетчатой пятнистости, устойчивость к мучнистой росе. Однако, все эти исследования фрагментарны.

Ячмень является одной из культур для которой секвенирован геном (The International Barley Genome Sequencing Consortium, 2012). Это стало хорошей основой для поиска молекулярных маркеров, идентификации генов и изучении механизмов их взаимодействия. Так, исследование 265 образцов из Дагестана в условиях короткого и длинного дня, а также проведенная идентификация аллелей генов Ppd-H1 и Ppd-H2 показала, что большинство образцов – носители доминантного аллеля Ppd-H2, который обеспечивает раннее развитие в условиях короткого дня. Выращивание образцов в непривычных для них условиях длинного дня приводило к задержке цветения (Абдуллаев и др., 2017). Сведения о взаимодействии генов, относящихся к системам Vrn, Ppd и Eam, и об аллельных вариантах этих генов, по-разному влияющих на сроки перехода от вегетативной стадии к генеративной, используются в изучении генетических ресурсов растений и в практической селекции (Абдуллаев и др., 2013; Алабушев и др., 2015, 2019; Донцова и др., 2016; Zlotina et al., 2013).

Использование методов секвенирования нового поколения позволяет выявлять минорные изменения нуклеотидной последовательности генома. Картирование с помощью секвенирования, которое сочетает в себе генетическое картирование с целевым ресеквенированием, было использовано для определения полиморфизмов потенциальных генов ячменя (Pankin et al., 2014). Еще одной задачей, решение которой зависит от знания геномных последовательностей, является сравнительный анализ геномов растений при установлении основных закономерностей происхождения различных видов растений и сельскохозяйственных культур (Avni et al., 2017). Изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов NGS пока не проводилось.

Род Aegilops, включающий 27 диплоидных, тетраплоидных и гексаплоидных видов – важный источник новых ценных аллелей генов для селекционного улучшения пшеницы. Среди видов Aegilops особое место занимает вид Ae. tauschii – наиболее вероятный донор генома D мягкой пшеницы. Вид этот полиморфен по морфологическим и физиологическим признакам, и занимает в природе широкий ареал от Причерноморья до отрогов Тянь-Шаня. В виде принято выделять два подвида – subsp. eusquarrosa и strangulate. В генетических коллекциях собраны и хранятся сотни образцов Ae. tauschii, который с 1980-х годов активно используется для обогащения генофонда пшеницы. В коллекции ВИР более 600 образцов этого вида. Наши предварительные результаты показывают, что в конструировании гексаплоидного генома T. aestivum принимали участие Ae. tauschii разного происхождения.

Значение гибридизации Ae. tauschii и Ae. umbellulata и Triticum для целей селекции ясно видно из следующего примера. Ранее была показана крайняя узость генетического разнообразия образцов мягкой пшеницы по эффективной ювенильной устойчивости к вредоносным грибным болезням – листовой ржавчине (возбудитель Puccinia recondita), септориозу (Stagonospora nodorum), темно-бурой листовой пятнистости (Bipolaris sorokiniana). Среди образцов Ae. tauschii из коллекции ВИР были выделены устойчивые ко всем 3-м болезням, а среди Ae. umbellulata – высокоустойчивые к листовой ржавчине. Наличие известных эффективных генов резистентности к ржавчине Lr9 и Lr41 изучали с помощью фитопатологического теста и ДНК-маркирования. Выявлены образцы эгилопсов, защищенные данными генами резистентности. У короткостебельных форм проведено ДНК-маркирование генов Rht2 и Rht8. В результате работы выделены образцы эгилопсов, перспективные для интрогрессивной гибридизации с мягкой пшеницей (Колесова и др., 2019).

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта. Материал для исследования

Материалом для нашего исследования будет набор образцов староместных сортов и диких видов из уникальной мировой коллекции культурных и выделенных из природы видов ВИР имени Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург), овсов (куратор И.Г. Лоскутов – участник проекта), эгиловсов (куратор Н.И. Чикида – участник проекта) и ячменей (куратор О.В, Ковалева – участник проекта), и коллекция гербарных образцов дикорастущих Avena, Hordeum, Aegilops, собранных нами во время экспедиций 2003-2019 г. в Алтай, Алтайский край, Туву и Хакассию, а также коллекции отдела гербарий БИН РАН (LE). Коллекции достаточно полно отражают спектр всего внутри- и межвидового разнообразия исследуемых родов, включая исторический материал по староместным сортам.

Все работы по размножению семенного материала, фенотипированию и выделению источников и доноров по широкому кругу морфологических, хозяйственно ценных признаков и устойчивости к абиотическим стрессам (эдафический стресс) будут проведены в полевых условиях Пушкинских и Павловских лабораторий ВИР с использованием стандартных методических указаний по изучению мировой коллекции овса (Лоскутов и др., 2012).

В работе будут использованы стандартные методы выделения ДНК, ПЦР-амплификации и секвенирования ITS-последовательностей и хлоропластных маркеров по Cэнгеру на секвенаторе Applied Biosystems 3130 ЦКП БИН РАН «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» и секвенирование нового поколения на платформе Illumina на секвенаторе ЦКП СПбГУ.

Способ изучения происхождения полиплоидов на основании исследования полиморфизма ITS-последовательностей был предложен нами (Пунина и др., 2012, 2017) и в дальнейшем усовершенствован (Rodionov et al., 2019; Беляков и др., 2019). В цитируемых работах Пуниной и соавт (2012, 2017), мы использовали интересную особенность геномов пионов – у них отсутствует или замедлен процесс изогенизации рДНК и при секвенировании по Сэнгеру в позициях, по которым ITS-последовательности родительских видов различаются, видны оба варианта нуклеотидов, благодаря чему можно реконструировать ITS-последовательность обоих предков, что позволяет верифицировать гипотезы о происхождении видов и культиваров.

В данной работе для выявления полученных аллополиплоидами от родительских видов вариантов ITS мы будем использовать локус-специфичное (targeted sequencing) секвенирование района ITS1 и фрагментов гена 18S и 5.8S рРНК на секвенаторе Illumina MiSeq с набором реагентов MiSeq® v3 (600 циклов) в соответствии с инструкциями производителя (Illumina Inc., США). При этом за одну реакцию можно прочесть примерно 10-20 тыс. копий ITS1 и соседних районов исследуемого генома (около 300-400 п.н.) и, таким образом, выявить внутригеномный полиморфизм этих последовательностей. Метод относительно новый, но несколько раз использовался при изучении внутригеномного полиморфизма рДНК (Matyasek et al., 2012; Kim et al., 2017; Rodionov et al., 2019; Гнутиков и др., 2019). Мы используем его для анализа происхождения субгеномов полиплоидных видов Avena. Triticum, внутригеномного полиморфизма рДНК Hordeum. Ранее нами показано, что у 4 предварительно исследованных полиплоидных видов Avena в геноме от общего числа генов 35S рРНК сохраняется 2-3% генов, происходящих от диплоидных видов с С-геномами (Rodionov et al., 2019; Родионов и др., 2020 – статья выйдет в журнале «Генетика» в №4) и при исследовании межвидовых гибридов у водного растения Sparganium (Беляков и др., 2019).

Первичные данные NGS будут обработаны при помощи стандартных инструментов: программ FastQC [National Center for Biotechnology Information. GenBank Overview. Available from: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/], Trimmomatic [Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics.2014;30(15):2114-2120] и Fastq-join [Aronesty E. Сomparison of sequencing utility program. Open Bioinformatics J. 2013;7:1-8]. Дальнейшая фильтрация данных более сложна, поскольку анализ SNP-ов в данном случае проводится на основе безреференсного выравнивания. Алгоритм действий следующий: 1) консенсусная фильтрация (исключение из анализа заведомо не выравниваемых вариантов – очевидных контаминантов); 2) с использованием программы COUNT (создана участником проекта Э.М. Мачсом) рассчитывалась частота каждого варианта последовательности в выборке – одинаковые гаплотипы представлены в дальнейшем анализе одной последовательностью с индексом – частота повторяемости). Для подсчета частот и сортировки гаплотипов будут использованы алгоритмы попарного сравнения и пузырьковой сортировки. 3) Далее используем программное обеспечение UGENE [Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. V. 28. P. 1166-1167. doi:10.1093/bioinformatics/bts091 5.], MEGA7 [Kumar S. et al. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets // Molec. Biol. Evol. 2016. V. 33. P. 1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054] и MEGA X [Kumar S. et al. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Molec. Biol. Evol. 2018. V. 35. P.1547-1549.doi: 10.1093/molbev/msw054]. Cравнированные вырианты ITS будут сравниваться с секвенированными по Сэнгеру ITS-последовательностями дикорастущих видов.

Для получения независимых данных по разным родительским линиям будут проанализированы и хлоропластные последовательности, прежде всего trnL-trnF, хорошо зарекомендовавшие себя при ДНК-штрихкодировании (Шнеер, Родионов, 2018).

Филогенетический анализ полученных последовательностей будет проводиться с использованием алгоритмов «объединение ближайших соседей» (NJ), программы MrBayes.

При необходимости, будет проведен цитогенетический анализ диплоидных и полиплоидных видов родов Avena, Hordeum, Aegilops (существенно при работе с образцами, выделенными из природы). При этом будут использоваться стандартные методы приготовления хромосомных препаратов и окрашивания их флуорохромами DAPI и CMA (Пунина и др., 2000).

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту.

Участниками проекта изучались закономерности эволюции внутренних транскрибируемых спейсеров и хлоропластных ДНК у злаков триб Poeae, Aveneae, Meliceae, Phleeae, Brylkiniae, Phalaridea, а также эволюция хромосомных комплексов злаков (обзоры: Родионов и др., 2013, 2015, 2016, 2019) и растений сем. Trilliaceae (Пунина и др., 2005). Развернуты работы по молекулярно-филогенетическому исследованию злаков, триллиевых, молочаев, пионов, таксономически сложных родов Sparganium, Silene и Iris флоры России. В лаборатории биосистематики и цитологии БИН РАН впервые секвенированы ITS-последовательности и гены 5.8S рРНК всех видов такого важного с генетической и научно-практической точки зрения рода злаков как Avena (Родионов и др., 2005; Тюпа и др., 2009; Rodionov et al., 2016), секвенированы ITS более сотни видов из круга родства двухромосомных злаков Zingeria и Colpodium (Родионов и др., 2008; Ким и др., 2010, Nosov et al., в редакции на рецензии), что впервые позволило показать, что кариотип этих двух этих уникальных по хромосомным наборам злаков, традиционно относимых к разным трибам, возник недавно и однократно. Нами впервые секвенированы и проанализированы ITS и гены 5.8S рРНК около 100 видов Poa, многие из которых представляют собой аллополиплоиды, и покащано, какие из современных диплоидов участвовали в формировании аллополиплоидных Poa (Носов, Родионов, 2008; Родионов и др., 2010, 2016; Носов и др., 2015). Нами впервые секвенированы и проанализированы ядерные и некоторые хлоропластные последовательности таких уникальных родов и видов, как Colpodium, Paracolpodium, Catabrosella, Anthoxantum, Zingeria, Glyceria и многих других. Эти данные помещены в международные банки данных и активно используются другими исследователями, занимающимися проблемами молекулярной таксономии Злаков. Все это позволило предложить гипотезу о путях эволюции кариотипа овсов на ранних этапах дивергенции видов этого рода (Родионов и др., 2005) и путях эволюции хромосом в семействе Здаки в целом (Родионов и др., 2013). Нами впервые, путем сравнительного анализа ядерных и хлоропластных генов с использованием методов молекулярной филогении, реконструированы филогенетические деревья, показывающие наиболее вероятные пути дивергенции видов трибы Phalarideae и положение родов Anthoxanthum, Hierochloё, Phalaris (Райко и др., 2008; Райко, Родионов, 2011) и родов Glyceria, Melica, Pleuropogon и Schizachne (триба Meliceae)(Rodionov et al., 2013, 2016) в системе злаков.

Некоторые из проведенных в лаборатории исследований касались происхождения гибридогенных видов и особенностей организации гибридогенных геномов. Так, исследуя эволюцию кариотипов в сем. Trilliaceae (Пунина и др., 2005 и др.), мы показали, что по паттерну дифференциальной исчерченности рисунок дифференциальной исчерченности хромосом у Trillium tschonoskii рисунок гетерохроматиновых сегментов гораздо более сходен с патерном представителей рода Paris, чем Trillium. В то время как для триллиумов T. camschatcense, T. erectum, T. grandiflorum и T. recurvatum характерны крупные блоки только АТ-богатого гетерохроматина, выявляемые при флуорохромировании хромосом, дифференциальное Q-окрашивание хромосом T. tschonoskii выявляет почти исключительно мелкие точечные AT-обогащенные блоки. В целом, их рисунок гораздо более сходен с патерном гетерохроматиновых районов хромосом у представителей рода Paris, чем у Trillium. Последовательности ITS1 и ITS2 этого вида, секвенированные нами (исследовалась геномная ДНК T. tschonoskii, собранного на Сахалине), по многим позициям также отличались от консенсусной последовательности, характерной для рода Trillium, но при этом имела все родоспецифические инсерции и делеции (индели) и однонуклеотидные замены, характерные для секвенированных нами видов рода Paris. Между тем, если судить по морфологии и последовательностям хлоропластного гена matK (Farmer, Schilling, 2002), T. tschonoskii - типичный представитель подрода Trillium рода Trillium, близкий T. camschatcense. Учитывая, что T. tschonoskii аллотетраплоид, и то, что по данным как морфологии так и секвенирования последовательностей гена хлоропластного генома matK этот вид близок к диплоидному T. camschatcense, можно предположить, что дальневосточный тетраплоидный вид T. tschonoskii - древний межродовой гибрид, в формировании которого участвовали пока неизвестные (а возможно, уже не существующие) виды Paris и Trillium, причем материнским растением в этой гибридизации был Trillium (Пунина и др., 2005).

В роде Avena известно около 25 диплоидных, тетраполоидных и гексаплоидных видов с геномами А, С, B и D (B и D – это варианты генома А). Проведенное обычным способом секвенирование ITS последовательностей диплоидных и полиплоидных видов Avena показало, что по ITS геномы A, B и D неотличимы друг от друга, но определенно отличаются от геномов типа С. При этом у полиплоидов обнаруживались только ITS геномов типа A(B,D) (Родионов и др., 2005; Nikoloudakis et al., 2008), что согласуется с результатами цитогенетических исследований Е.Д. Бадаевой и соавт. – FISH показывает, что С-субгеномы полиплоидных видов овсов потеряли большую часть рДНК, на них удается выявить только слабые 35S рДНК-позитивные сигналы (Шелухина и др. 2007, 2008; Badaeva et al., 2010). Для того, чтобы выяснить, какой из диплоидных видов мог стать потенциальным донором генома С у полиплоидных видов рода Avena, мы (Тюпа, 2006; Тюпа и др., 2009) разработали специальную систему геномспецифичных праймеров, позволяющую выявлять в геномах полиплоидов даже минорные количества С-геномной рДНК. Это позволило впервые определить, что наиболее вероятным предком, передавшим тетраплоидам A. magna, A. murphyi и A. fatua и гексаплоидам A. sativa и A. occidentalis субгеном С был вид A. ventricosa. Наши выводы согласуются с результатами работы греческих авторов (Nikoloudakis, Katsiotis, 2008), полученными независимо, с использованием других геном-специфичных праймеров, но разработанные нами праймеры более удобны и более информативны, так как в большей степени специфичны для С-генома (захватывают делецию, по которой геномы А и С различаются) и, кроме того, они позволяют амплифицировать большие по размеру фрагменты рДНК.

Нами исследованы также происхождение полиплоидных геномов в роде Poa (Родионов и др., 2010), роде Sparganium (Беляков и др., 2019), роде xTrisetokoeleria (Гнутиков и др., 2029), роде Elymus (Rodionov et al., 2019), в трибах Meliceae (Rodionov et al., 2013), и Phalarideae (Райко и соавт. 2008, 2011 и др.) и, в частности, показано, что виды, ранее относимые к подроду Arctopoa рода Poa (Цвелев, 1976), в действительности не только составляют особый род, а не подрод Poa, но и род, относящийся к другой филогенетической ветви (Родионов и др., 2010), чем Poa; что триба Phalarideae определенно гетерогенна и может быть разделена на 2 независимые филогенетические Anthoxanthum+Hierochloe+Ataxia и отдельную ветвь Phalaris+Phalaroides (Райко и др., 2011). Триба Meliceae, напротив, монофилетична, но в ее состав, по-видимому, может быть включена монотипная триба Брылкиниевых (Rodionov et al., 2013).

Изучая ITS-последовательности видов рода Paeonia, мы подтвердили наблюдение Санга (Sang et al., 1995), что у пионов по каким-то причинам не идут процессы изогенизациии рДНК, что позволяет использовать полиморфные сайиы в ITS-последовательностях для определения родительских видов у природных аллополиплоидов (Пунина и др., 2012) и у сортов садовых гибридов (Пунина и др., 2017). В последовательностях рДНК транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 регулярно выявляются «двойные пики», свидетельствующие о присутствии значимого количества сразу двух нуклеотидов в данной позиции. В частности, нами было показано, что кавказский нотовид P. x majkoae Ketzch. является межвидовым гибридом между P. tenuifolia L. и P. caucasica (Schipcz.) Schipcz. и не тождественен западно-сибирскому виду P. intermedia C. A. Mey (=P. hybrida Pall.), как полагали китайские исследователи (Hong, Zhou, 2003). Анализ распределения PS на участке ITS1-5.8S рДНК-ITS2 у предполагаемого спонтанного садового гибрида между P. tenuifolia и P. anomala L. подтвердил гипотезу о его происхождении. Исследуя PS у культивара «Ballerina», - гибрида, полученного в 1941 г. в результате скрещивания P. lactiflora и P. wittmanianna Stev. (Успенская , 2003) мы также подтвердили его происхождение (Пунина и др., 2012).

В лаборатории давно применяются методы исследования кариотипов и дифференциального окрашивания хромосом нуклеотид-специфичными флуорохромами, окрвшивание хромосом по С-методу, методы ПЦР-амплификации ДНК со случайных и геноспецифичных праймеров. В лаборатории впервые был разработан метод холодового дифференциального окрашивания эухроматиновых сегментов хромосом растений (Раскина, Родионов, 1992) и изучены механизмы получения CPD - исчерченности хромосом растений (Ким и др., 2002). При участии сотрудников лаборатории разработаны оpигинальные компьютерные программы хромосомного анализа и анализа электрофореграмм, позволяющие строить в интерактивном режиме денситограммы плотностей по длине хромосомы и получать каpты хpомосом высокого pазpешения, а также анализировать электрофореграммы (Пунина и др., 1994; Muravenko et al., 1998; Пичугин и др., 2001 и др.). Кроме того, сотрудниками лаборатории давно проводятся исследования структуры кариотипов широкого круга растений рутинными методами (см. обзоры: Almeida et al., (2006) Index of Plant Chromosome Numbers 2000-2003”; Applequest et al. (2010) Index of Plant Chromosome Numbers 2004-2006; Punina et al., 2015; Gnutikov et al., 2016-2019; Гнутиков и др., 2017 и др.).

Участниками проекта из ВИРа разработана уточненная система рода Avena L. и дано описание ключей для определения видов. На основе анализа данных по культурным и диким видам овса подтверждено установление их центров происхождения и разнообразия. Проведение изучения и анализа географического распространения ареалов видов, морфологических и селекционно ценных признаков позволило расширить представления о потенциальных возможностях отдельных видов и всего рода в целом. Выявлена возможность увеличения генетического разнообразия посевного овса за счет расширения его генетической основы при использовании в селекции малораспространенных и диких видов, обладающих селекционно ценными признаками (Лоскутов, 2007; Loskutov, Rines, 2011).

В совместных исследованиях ВИР и БИН РАН в течение многих лет исследуются разные стороны эволюции аллополиплоидных геномов овса. Для того, чтобы выяснить, какой из диплоидных видов мог стать потенциальным донором генома С у полиплоидных видов рода Avena были разработаны геномспецифичные праймеры (Тюпа, 2006; Тюпа и др., 2009), позволяющие выявлять в геномах полиплоидов даже минорные количества С-геномной рДНК.

Одна из работ была посвящена исследованию ранних этапов эволюции кариотипов видов рода Avena (Родионов и др., 2005). В этой работе впервые было показано, что у всех полиплоидных видов Avena, кроме эндемика Атласских гор A. macrostachya, при секвенировании по Сэнгеру выявляются только ITS-последовательности А-субгеномов. На основании анализа ITS-последовательностей, были построены филогенетические гипотезы, отражающие дивергенцию видов рода Avena. На основании этих схем нами была разработана модель эволюции кариотипов овса: предок Avena имел диплоидный хромосомный набор с "симметричными" хромосомами, похожими в этом отношении на хромосомные наборы (Cm) A. macrostachya и кариотипы диплоидных видов овса с геномом А. Далее произошло разделение филогенетических линий Avena с геномами А и С, сопровождавшееся накоплением различий по рассеянным повторам (определяющим результаты GISH-гибридизации) и накоплением специфичных для каждой филогенетической ветви транзиций и трансверсий в ITS. Затем в линии С-геномов произошло разделение филогенетических ветвей предка A. macrostachya и предка других видов с геномами С, после чего у предка A. macrostachya произошло удвоение хромосомного набора и появились крупные блоки С-гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, а у предка других видов с геномом С (A. clauda, A. pilisa и A.ventricosa) имели место хромосомные перестройки, изменившие положение центромеров. "Десимметризация" хромосом у предка A. clauda, A. pilisa и A. ventricosa сопровождалась уменьшением размеров и нуклеотидного состава АТ- и ГЦ-богатых прителомерных и прицентромерных блоков гетерохроматина и появлением множественных небольших интерстициальных блоков С-гетерохроматина, не выявляемых нуклеотид-специфичными красителями. У видов овса с геномами А мог происходить противоположный процесс − увеличение размера прителомерных и прицентромерных сегментов гетерохроматина. С помощью новейших методов пиросеквенирования («4-5-4 Life Sciences») был получен пул последовательностей ITS1 у полиплоидных видов овса Avena magna, A. murphyi, A. sativa, A. occidentalis, A. fatua. По ITS геномы A, B, D значимо не отличаются друг от друга, в то время как геном C определенно иного происхождения. По результатам NGS секвенирования ITS-последовательности генома C обнаружены в минорном количестве, всего 1 - 3% от общего числа сиквенсов. Полиплоидные овсы оказались наиболее близкими к диплоиду A. ventricosa, но, что неожиданно, C-геном был близок не только к этому виду, но также и к очень отличающемуся от него по морфологическим признакам многолетнику A. macrostachya (Rodionov et al., 2016).

Кроме того, внутривидовое разнообразие овса изучалось с использованием белковых маркеров по спектрам запасных белков (авенинов). Было установлено, что коллекция староместных сортов посевного овса, собранная и поддерживаемая в ВИРе, обладает значительным генетическим полиморфизмом, выявляемым по спектрам авенина. Наличие такого полиморфизма подтверждает высокий уровень генетического разнообразия староместных сортов овса и свидетельствует в пользу перспективности использования спектра авенина для идентификации биотипов овса (Зеленская и др., 2004). Дальнейшие исследования подтвердили, что электрофоретические спектры авенина могут служить инструментом генетического разнообразия образцов и для анализа генетической стабильности коллекции овса в ходе их репродукции. На основании полученных данных был составлен каталог белковых формул и компьютерная база данных, которые могут быть использованы для более тщательного подбора генетического материала для целей селекции (Лоскутов, 2008; Перчук и др., 2016).

Участники проекта проводят комплексное полевое и лабораторное изучение генетических ресурсов овса с целью раскрытия потенциала наследственной изменчивости образцов коллекции для рационального использования их генетического, адаптивного и хозяйственного потенциалов в селекции, производстве продовольствия и ведении сельского хозяйства (Лоскутов, 2007; Лоскутов и др., 2016; Loskutov, 2014). Селекционерам страны переданы выделенные доноры устойчивости к полеганию и 11 созданных доноров с идентифицированными генами (Dw) короткостебельности (Лоскутов, 2006). Совместно создано 5 сортов голозерного, 4 сорта пленчатого овса и один сорт ячменя, получен один патент на изобретение и 6 патентов на селекционные достижения (http://gossort.com/).

При изучении всего видового разнообразия рода Avena L. из коллекции ВИР по комплексу хозяйственно ценных признаков, устойчивости к абиотическим и биотическим стрессорам и содержанию качественных параметров зерна были выявлены генотипы, расширяющие их генетическую основу культурных видов, перспективные для селекции высокоурожайных сортов овса, пригодных для производства продуктов, рекомендованных для здорового функционального питания (Лоскутов, 2007). Среди селекционных линий из ведущих селекцентров России были выделены линии с минимальным содержание ДНК грибов Fusarium и микотоксинов в зерновке. Впервые в мире была проведена оценка широкого разнообразия диких видов Avena по устойчивости к заражению Fusarium и накоплению фузариотоксинов (Лоскутов и др., 2016; Gagkaeva et al., 2017).

При проведении биохимического анализа по содержанию белка и масла в зерновке выделялись голозерные сорта овса. Кроме того, повышенное содержание этих показателей было связано между собой и с заражением зерна фузариозом. По жирнокислотному составу выделены генотипы с высоким содержанием незаменимых жирных кислот – олеиновой (более 45%), ленолевой (более 40%) и леноленовой (более 2%). Отмечается, что, в большинстве случае, у образцов диких видов эти показатели были выше (Конарев и др., 2015).

Метаболомный анализ селекционных сортов овса и образцов диких видов позволил идентифицировать метаболиты, содержание которых меняется в процессе «окультуривания» или по которым образцы диких видов отличаются от сортов овса. Установлены достоверные корреляции между изученными показателями качества зерновки и устойчивостью к фузариозу и накоплению микотоксинов. Выявлено, что повышенное содержание сахарозы и фруктозы А имело обратную связь с поражением зерна фузариозом и накоплением микотоксинов. Анализ пленчатых и голозерных сортов овса показали, что голозерные сорта имели большие суммарные показатели по органическим, жирным и аминокислотам, стеролам, дисахарам и общим сахарам, а пленчатые сорта имели повышенные показатели только по моноацилглицеролам, азотисным основаниям, многоатомным спиртам и моносахарам (Лоскутов и др., 2016).

В результате анализа микроэлементного состава образцов овса установлено, что между концентрацией изученных микроэлементов и накоплением отдельных жирных кислот в масле, а также заражением фузариозом и накоплением микотоксинов в зерновках были найдены достоверные корреляции (Bityutskii et al., 2017; Bityutskii et al., 2019).

Таким образом, исследовательский коллектив полностью обладает необходимым опытом и навыками для изучения всего видового и внутривидового разнообразия рода Avena на уровне, отвечающем мировым стандартам.

Имеющаяся в ВИР генетическая коллекция Aegilops изучена всеми известными методами, в том числе и с использованием ДНК технологий. Однако внутривидовой полиморфизм рДНК в линиях пшениц и вклад в это разных линий Aegilops не выполнялся никогда. По нашим предварительным данным, с помощью этого подхода нам удастся показать наличие в составе Ae. tauschii ssp.strangulsta двух линий, разделить известный подвид и четко диагностировать морфологические признаки каждой линии, дав им «паспорт» по белковым маркерам (глиадинам) и по ДНК.

Детальный план работы на первый год выполнения проекта.

В 2020 нами будет изучен внутригеномный полиморфизм рДНК 10-15 староместных сортов овса и 10-15 староместных сортов ячменя и рДНК малоизученных диких видов овса и ячменя, которые, вполне возможно, участвовали в актах гибридизации, приведших к появлению гексаплоидных и тетраплоидных видов культурного овса. Методами секвенирования нового поколения (NGS) будет выявлен внутригеносный полиморфизм рДНК изучаемых сортов и видов, определена система риботипов и их наиболее вероятное происхождение. Будут сделаны выводы о случаях гибридизации между видами в роде Avena, приведших к формированию полиплоидов и решен вопрос, сохранились ли следы межвидовых гибриизаций (если они были) в геномах староместных сортов ячменя. Это позволит выявить филогенетические связи и установить границы между отдельными компонентами сложной таксономической системы родов Avena и Hordeum. Для культурных видов овса и, возможно, ячменя, будут выявлены предковые таксоны среди диких видов, в дальнейшем будет прояснен таксономический статус редких и критических видов (A. aemulans, A. volgensis, A. septentrionalis, A. intermedia и, возможно, др.). Наиболее интересные из староместных сортов овсов и ячменя в рамках данного проекта, будут впервые охарактеризованы с помощью усовершенствованной на основе NGS технологии ДНК-штрихкодирования (генетическая паспортизация). Впервые таким образом будут изучены староместные сорта ячменя, собранные Н.И. Вавиловым и П. М. Жуковским. Это может дать возможность выделить в составе генетической коллекции ВИР новые источники аллелей и доноры хозяйственно ценных признаков, адаптивности и устойчивости к биотическим стрессам, способные расширить генетическую основу культурного ячменя. Следует отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и NGS секвенирования ранее не проводилось.

Будет проведено сравнительное морфологическое исследование 674 коллекционных образцов Ae. tauschii, отобрано 12 наиболее перспективных для изучения вклада их геномов в гексаплоидные геномы разных сортов мягкой пшеницы. По нашим предварительным данным эти эксперименты позволят доказать, что есть все основания считать, что Aegilops tauschii ssp.strangulsta гетерогенен с морфологической и молекулярно-генетической точек зрения, что в его составе есть четко отличающаяся уникальную форма, которую по комплексу признаков и ботанических и молекулярно -генетических участники проекта предполают отнести к новому подвиду.


Короткий заголовокGZ-2020
АкронимМ1_2020 - 1
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания22/06/2031/12/20

Ключевые слова

  • межвидовая гибридизация
  • селекция
  • полиплоидия
  • Эволюция геномов и кариотипов