Инициация CRISPR-опосредованного пути гомологичной рекомбинации в эмбрионах мышей с помощью ингибирования NHEJ и MMEJ путей репарации: 2019 г. этап 1

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

Цель данного проекта: Разработать и валидировать новый метод активации CRISPR-опосредованного пути гомологичной рекомбинации (HDR) с помощью ингибирования ключевых мРНК, кодирующих белки NHEJ и MMEJ систем репарации.

описание для неспециалистов

Каждая клетка – это сложноорганизованная система, компоненты которой слаженно выполняют множество задач, при этом вся необходимая для жизни клетки информация хранится в ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота, основной компонент хромосом). В клетке имеется целая армия белков, которая защищает ДНК от повреждений, и специальные белки системы репарации, которые готовы сделать все возможное и невозможное, чтобы отремонтировать возникшие неполадки. Повреждения могут вызвать факторы окружающей среды, такие как ультрафиолетовый свет и радиация, но они также могут быть связаны и с естественными процессами, такими как репликация, когда синтезируется новая копия молекулы ДНК перед делением клетки. На каждую клетку приходится до миллиона повреждений ДНК в день. Поэтому белки системы репарации всегда стоят на страже и готовы быстро реагировать на любые повреждения в ДНК.
Вот представьте теперь, что мы хотим направленно внести двухцепочечный разрыв в ДНК одноклеточного эмбриона. Надо сказать, что это самое страшное повреждение для клетки, которое может вызвать ее гибель. Для ликвидации таких повреждений клетка содержит отряды особого специального назначения - системы репарации c помощью негомологичного соединения концов (NHEJ) или микрогомологичного соединения концов (MMEJ). Надо отметить, что они работают крайне быстро, потому что это вопрос жизни и смерти, но допускают ошибки и вносят мутации на месте повреждения. Именно этот способ клетки зашивать двухцепочечные разрывы подсказал ученым способ направленно вводить мутации в выбранные участки ДНК. Но для того, чтобы активировать отряды специального назначения NHEJ и MMEJ, нужно сначала внести двухцепочечный разрыв в хорошо охраняемую ДНК клетки. И тут на помощь ученым пришли микроорганизмы, которые поделились своим секретным инструментом для внесения двухцепочечных разрывов в любую молекулу ДНК. Этот инструмент называется CRISPR/Cas система, бактерии ее используют для борьбы с вирусами, которые на них нападают. Система работает очень просто: синтезируется небольшой фрагмент CRISPR-РНК, каждая буква которой будет комплементарна фрагменту ДНК, в которую мы хотим внести разрыв. Данная РНК связывается с белком-нуклеазой Сas9, умеющей вносить двухцепочечные разрывы в ДНК, и указывает ей то место, куда требуется внести этот разрыв. Узнается это место за счет спаривания комплементарных букв РНК и ДНК. Если эту конструкцию доставить, например, в одноклеточный эмбрион, то можно направленно внести разрыв в ДНК в нужном для исследования месте. Зная, как работают отряды специального назначения NHEJ и MMEJ, можно не волноваться, что клетка погибнет, они смогут ее спасти, хотя и ценой небольшой мутации. Но, ученым этого показалось мало, им захотелось не просто вносить мутации, но и вставлять другие гены, которые кодируют белки, например те, которые умеют светиться, такие как флуоресцентный белок GFP. Для этого нужно активировать другую систему репарации, опосредованную гомологичной рекомбинацией (HDR). Эта система работает медленно, и отряды специального назначения каждый раз ее опережают. Поэтому мы решили инактивировать ключевых участников двух систем репараций NHEJ и MMEJ: белки Ku70 и Polθ. Для этого мы направили на них другую нуклeазу - Cas13. Эта нуклеаза не трогает ДНК и специфично уничтожает молекулы РНК, поэтому с ее помощью, не нанося большого вреда клетке, мы сможем на какое-то время остановить производство белков Ku70 и Polθ. Это, в свою очередь, даст возможность сработать более медленной системе репарации HDR, которая умеет зашивать разрыв за счет аккуратного переписывания информации с имеющейся матрицы ДНК. Поэтому если мы внесем фрагмент ДНК, кодирующий флуоресцентный белок GFP и несущий участки, по которым может идти рекомбинация, то можем добиться, чтобы нужный нам белок начал светиться в клетке. Для этих целей мы ввели приготовленные нами конструкции: CRISPR/Cas9 с направляющей РНК к выбранному нами гену exo1, матрицу ДНК_ GFP и CRISPR/Cas13 с направляющими РНК к мРНК, в которой зашифрована информация о Ku70 и Polθ, с помощью очень тонкой иголки в зиготу мыши. Не все зиготы выжили после такой инъекции, но с помощью флуоресцентного микроскопа мы увидели, как у небольшого количества выживших эмбрионов светятся зеленым отдельные клетки. Мы выделили из эмбрионов ДНК и показали с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции), что ген GFP действительно встроился в геном мыши. Эти результаты говорят о том, что наша задумка удалась, и инактивация белков Ku70 и Polθ действительно повышает вероятность гомологичной рекомбинации, что дает возможность получать генетически модифицированные организмы быстрее и с меньшими затратами. На следующем этапе мы планируем получить живых мышей с встроенным в геном геном GFP, для этого мы подсадим мышам зиготы после инъекции наших генетических конструкций, после чего оценим их фенотип и генотип.
Короткий заголовокИнициация CRISPR-опосредованного пути гомологичной рекомбинации в эмбрионах мышей с помощью ингибирования NHEJ и MMEJ путей репарации.
АкронимRFBR_Sirius_2019 - 1
СтатусЗавершено
Действительная дата начала/окончания29/11/1930/09/20

Ключевые слова

  • CRISPR/Cas технология, негомологичное соединение концов, NHEJ, соединение концов на основании микрогомологии, MMEJ, гомологичная рекомбинация, HDR, ДНК-полимераза A-семейства θ, Polθ, экзонуклеаза 1, EXO1, тирозиназа (tyr), Ku70