Изучение механизмов нитрат-опосредованной регуляции развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L.) и люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.) с использованием геномных технологий: 2020 г. этап 1

Проект: исполнение гранта/договораисполнение этапа гранта/договора

Сведения о проекте

описание

1. Научная проблема, на решение которой направлен проект.
Настоящий проект направлен на изучение механизмов системного контроля развития симбиотических клубеньков с участием нитрат-регулируемых пептидов CLE и CEP, а также изучение роли этих пептидов в контроле поглощения нитрата из почвы у бобовых растений - люцерны слабоусеченной и у гороха посевного.

2. Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
В настоящее время важной задачей современного сельского хозяйства является снижение количества вносимых агрохимикатов, прежде всего азотсодержащих удобрений, масштабное применение которых имеет отрицательные последствия для окружающей среды и здоровья человека в целом. Одним из развивающихся подходов современного устойчивого земледелия является использование природных процессов, в основе которых лежит взаимодействие растений с симбиотическими почвенными микроорганизмами, которые позволяют снизить потребности растений во внешних источниках минеральных веществ и оптимизировать поступление азота и фосфора из среды в доступной для растений форме. Одной из групп таких полезных для сельского хозяйства микроорганизмов являются почвенные бактерии ризобии, вступающие в симбиоз с бобовыми растениями и осуществляющие биологическую азотфиксацию в симбиотических клубеньках, формирующихся на корнях бобовых растений. С участием фермента бактерий, нитрогеназы, происходит восстановление молекулярного азота и его включение в органические соединения в тканях растений, благодаря чему происходит обеспечение азотом природных экосистем. В связи с этим, понимание механизмов регуляции развития симбиотических клубеньков имеет как фундаментальное значение, так и практическую значимость, поскольку может способствовать получению бобовых культур с повышенной питательной ценностью, разработки биопрепаратов, позволяющих обогатить почву органическим азотом, а также в перспективе могут быть распространены и на небобовые сельскохозяйственные культуры с целью создания искусственных азотфиксирующих биологических систем.
Развитие симбиотических клубеньков у бобовых растений находится под системным контролем со стороны растения. Система авторегуляции клубенькообразования (AON, autoregulation of nodulation) ограничивает формирование избыточного числа клубеньков с участием мобильных сигнальных молекул - пептидов CLE, которые синтезируются в развивающихся клубеньках на корнях и транспортируются из корней в побег. В результате взаимодействия пептидов CLE со специфическими рецепторами во флоэме листа вырабатывается ответный сигнал, блокирующий закладку новых клубеньков. В системном контроле развития клубеньков также задействован нитрат. Однако, конкретный механизм действия нитрата в регуляции клубенькообразования в настоящее время изучен недостаточно. У двух бобовых растений, сои (Glycine max) и лядвенца (Lotus japonicus), выявлены индуцируемые нитратом гены CLE, экспрессия которых активировалась при клубенькообразовании, при этом их сверхэкспрессия подавляла формирование клубеньков. Однако у других бобовых растений, у люцерны и гороха, активируемые нитратом пептиды CLE не были описаны.
Пептиды CEP являются своего рода антагонистами пептидов CLE, они синтезируются при недостатке азота, и стимулируют закладку симбиотических клубеньков, как это было показано для пептида MtCEP1 у люцерны. Однако, конкретный механизм участия пептида MtCEP1, а также возможная роль других представителей пептидов CEP у люцерны в системном контроле клубенькообразования, остаются малоизученными. Пептиды CEP у гороха в настоящее время не были идентифицированы и их роль в развитии клубеньков не изучалась.
В настоящей работе мы планируем идентифицировать регулируемые нитратом пептиды CLE и CEP у люцерны слабоусеченной Medicago truncatula и у гороха посевного Pisum sativum, оценить их полиморфизм, а также описать молекулярные механизмы их действия при клубенькообразовании и развитии растения, в том числе выявить их потенциальные мишени.

3. Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб.
Конкретной задачей проекта является изучение роли пептидов CLE и CEP в нитрат-опосредованной регуляции развития симбиотических клубеньков у гороха посевного (Pisum sativum L.) и люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.). В рамках проекта планируется: 1) проведение широкомасштабных исследований с использованием секвенирования геномов линий гороха, в том числе несущих мутации в генах, предположительно кодирующих компоненты системы авторегуляции клубенькообразования, 2) изучение полиморфизма генов CEP и CLE, а также генов, кодирующих их рецепторы, у гороха и люцерны, а также 3) анализ транскриптомов растений люцерны, сверхэкспрессирующих нитрат-регулируемые гены CLE и CEP, после обработки нитратом.

4. Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Планируемое исследование характеризуется высокой степенью научной новизны:
1. Впервые будет осуществлено секвенирование геномов линий гороха Frisson, Finale, Sparkle и SGE.
2. Впервые будут выявлены гены CEP у гороха на основании данных геномного секвенирования четырех линий гороха, и изучен их полиморфизм.
3. Впервые будут выявлены активируемые нитратом пептиды CLE у гороха и люцерны и изучена их роль в развитии симбиотических клубеньков
4. Впервые будет изучен полиморфизм генов CEP и CLE, а также генов, кодирующих их рецепторы, у ряда генотипов гороха и проведено исследование ассоциации аллельного состояния указанных генов с фенотипическими характеристиками, включая содержание азота в семенах.
5. Впервые будет проведено комплексное сравнительное изучение транскриптома растений люцерны при сверхэкспрессии генов CLE, CEP, а также при обработке нитратом.
6. Впервые будут получены данные о влиянии сверхэкспрессии генов CLE и CEP на содержание азота в тканях растений.
Полученные результаты должны расширить представления о механизмах системного контроля клубенькообразования у бобовых растений с участием пептидов CEP и CLE, а также о роли нитрата в регуляции развития симбиотических клубеньков.

5. Современное состояние исследований по данной проблеме.
Как стало известно за последние годы, нитрат является не только важным компонентом минерального питания растений, но и ключевым системным регулятором роста и развития растений, оказывая влияние на такие процессы у растений, как цветение, развитие боковых корней и ветвление корней, а также на формирование симбиотических клубеньков, образуемых на корнях бобовых растений при симбиозе с почвенными бактериями ризобиями, осуществляющими фиксацию молекулярного азота.
У растений описаны два класса пептидных гормонов, продукция которых регулируется уровнем нитрата в среде: пептиды CEP (C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDES), синтезируемые в корнях в ответ на недостаток азота, а также пептиды группы CLE (CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION-related), которые, напротив, индуцируются при обработке нитратом (см. обзор Oh et al., 2018). Пептиды CLE и CEP относятся к группе посттранляционно модифицируемых пептидов: они синтезируются в из более протяженного пептида-предшественника, из которого в результате протеолиза и посттрасляционных модификаций образуется активный регуляторный пептид длиной около 12-15 аминокислот (см. обзор Oh et al., 2018). Пептиды CEP и CLE, как стало известно за последние годы, опосредуют системный ответ на содержание азота в среде: они синтезируются в тканях корня и способны перемещаться в наземную часть растения, где во флоэме листа они узнаются специфическими рецепторами (см. обзор Notaguchi and Okamoto, 2015). Таким образом, сигналы, поступающие из подземных органов в побеги, запускают ответные реакции, регулирующие процессы развития с учетом потребностей растения в целом.
В регуляции развития симбиотических клубеньков также задействованы механизмы системного контроля: численность образующихся на корнях клубеньков регулируется с помощью системы авторегуляции (AON, autoregulation of nodulation), ограничивающей формирование избыточных клубеньков. Пептиды CLE являются одним из ключевых компонентов этой системы: они cинтезируются в формирующихся клубеньках и транспортируются в побег, где, связываясь со специфическими рецепторами, пептиды CLE запускают ответные реакции, подавляющие образование клубеньков на корнях. Рецепторами пептидов CLE являются CLV1-подобные киназы, гомологи известных регуляторов развития меристем растений (Okamoto et al., 2013). Конкретные участники передачи сигналов от CLV1-подобных киназ, обеспечивающих AON, к настоящему времени не установлены, однако известно, что следствием активации AON в побеге является усиление биосинтеза цитокинина и его транспорта в корень, а также снижение транспорта ауксина из побега в корень, что в совокупности приводит к подавлению развития клубеньков на корнях (Sasaki et al., 2014, van Noorden et al., 2006). По-видимому, авторегуляция затрагивает разные этапы формирования и функционирования клубеньков, от развития бактериальной инфекции в эпидермисе до самого процесса азотфиксации в зрелых клубеньках. О конкретных мишенях авторегуляции известно мало.
Предполагается, что ген NODULE INCEPTION (NIN), ключевой регулятор развития симбиотических клубеньков, является одной из таких мишеней (Soyano et al., 2014). Экспрессия гена NIN активируется цитокинином, стимулирующим закладку примордиев клубеньков, а также сигнальным каскадом, активируемым ризобиями (Vernié et al., 2015). NIN напрямую активирует экспрессию генов CLE-RS1 и CLE-RS2 у лядвенца Lotus japonicus, таким образом, запуская AON (Soyano et al., 2014). Таким образом, NIN может являться одним из ключевых участников AON, регулируя свою собственную экспрессию и клубенькообразование в целом по механизму отрицательной обратной связи. Кроме того, ряд CLE-пептидов, активируемых при симбиозе, также индуцируется при обработке нитратом, и таким образом, опосредует нитрат-зависимое подавление развития симбиотических клубеньков. У некоторых бобовых, в частности у сои и лядвенца, были выявлены пептиды CLE, индуцируемые как при симбиозе с ризобиями, так и при обработке нитратом (Okamoto et al., 2009, Lim et al., 2014).
Нитрат, будучи основной формой азота, поглощаемого растениями из почвы, также является и важной сигнальной молекулой. Как предполагается, в роли рецепторов нитрата выступают белки-транспортеры нитрата семейства NRT (Ho et al., 2009). В промоторах генов, активируемых при действии нитрата, были обнаружены консервативные регуляторные элементы - NRE (nitrate response elements) (Konishi and Yanagisawa, 2010). Такие регуляторные последовательности были обнаружены, в частности, в промоторах генов нитратных транспортеров NRT, а также ряда генов, регулирующих развитие. У арабидопсиса и других растений были выявлены ключевые транскрипционные факторы, связывающиеся с NRE, которые относят к группе NIN-подобных белков (NIN-like proteins, NLP) (Konishi and Yanagisawa, 2013). NIN-подобные белки, NLP, были охарактеризованы у других высших растений и даже у водорослей как ключевые компоненты нитратного сигналинга. В частности, у арабидопсиса ТФ NLP7 является основным активатором экспрессии генов первичного ответа на нитрат, и как предполагается, его активность контролируется за счет фосфорилирования, необходимого для транспорта этого ТФ в ядро (Marchive et al., 2013). Таким образом, ключевой регулятор развития симбиотических клубеньков, NIN, эволюционно близок белкам, осуществляющих регуляцию ответа на нитрат у небобовых растений, что указывает на эволюционную близость сигнальных путей, запускающих нитрат-опосредованные реакции у растений и формирование симбиотических клубеньков.
Для лядвенца было показано, что наряду с ТФ NIN, экспрессию гена CLE-RS2 также регулирует NIN-подобный белок NRSYM1 (NITRATE UNRESPONSIVE SYMBIOSIS 1), связывающийся с NRE в промоторе гена CLE-RS2, что приводит к активации экспрессии нитрат-регулируемого гена CLE-RS2 (Nishida et al., 2018). Таким образом, регуляция активности гена CLE-RS2 является комплексной и включает как сигнальные пути, индуцируемые нитратом, так и ризобиями.
У люцерны также были выявлены белки NLP, и было показано, что они способны взаимодействовать с ТФ NIN (Lin et al., 2018). Предполагается, что при высоких концентрациях нитрата, ингибирующих развитие клубеньков, белок NLP1 накапливается в ядре и за счет непосредственного связывания с ним и/или за счет конкурентного связывания с NRE в промоторах NIN-регулируемых генов препятствует работе NIN и, таким образом, предотвращает активацию генов, участвующих в развитии клубеньков (Lin et al., 2018).
Однако, у люцерны к настоящему времени не были идентифицированы нитрат-регулируемые гены CLE, их идентификация и изучение их возможной регуляции с участием NIN и NLP представляет значительный интерес для понимания механизмов нитрат-опосредованной регуляции развития клубеньков. У гороха нитрат-индуцируемых пептидов CLE ранее также не было выявлено.
В отличие от CLE, пептиды CEP синтезируются в корнях растений в ответ на недостаток азота. Так, показано, что у арабидопсиса пептид AtCEP1 активируется в корнях, испытывающих голодание по азоту, и системно, действуя через рецептор, работающий в побеге, активирует экспрессию генов нитратных транспортеров в тех корнях, которые растут в условиях с достаточным содержанием нитрата (Tabata et al., 2014). Более того, пептиды CEP ингибируют рост корня, подавляя пролиферацию клеток меристемы, а также закладку боковых корней (Ohyama et al. 2008). Роль пептидов СEP в клубенькообразовании также была изучена: у модельного бобового растения Medicago trunсatula пептид MtCEP1 стимулирует формирование клубеньков и при этом подавляет закладку боковых корней (Imin et al., 2013). Однако механизмы действия нитрат-регулируемых пептидов CEP, их мишени в развитии симбиотических клубеньков, остаются малоизученными.
В настоящей работе мы планируем более детально изучить функции пептидов CLE и CEP с помощью анализа транскриптомов растений с измененным уровнем экспрессии генов, кодирующих пептиды CEP и CLE, а также изучить влияние этих пептидов на процессы поглощения нитрата из среды и на накопление азота в тканях растений. Кроме того, с помощью анализа геномов разных линий гороха и люцерны мы планируем проанализировать полиморфизм по генам, кодирующих пептиды CLE и CEP, а также генам, кодирующим рецепторные молекулы, связывающие эти пептиды. Затем планируется оценить связь аллельных состояний генов с такими признаками как число образующихся симбиотических клубеньков и содержание азота в тканях растений.
Понимание механизмов участия нитрата в системном контроле развития растений на модели клубенькообразования у бобовых растений должно способствовать формированию новых принципов земледелия, позволяющих оптимизировать количество вносимых азотных удобрений при культивировании различных сельскохозяйственно-значимых культур.

Цитируемая литература:
Oh E, Seo PJ, Kim J. Signaling Peptides and Receptors Coordinating Plant Root Development. Trends Plant Sci. 2018 Apr;23(4):337-351. doi: 10.1016/j.tplants.2017.12.007.
Notaguchi M, Okamoto S. Dynamics of long-distance signaling via plant vascular tissues. Front Plant Sci. 2015 Mar 18;6:161. doi: 10.3389/fpls.2015.00161.
Okamoto S, Shinohara H, Mori T, Matsubayashi Y, Kawaguchi M. Root-derived CLE glycopeptides control nodulation by direct binding to HAR1 receptor kinase. Nat Commun. 2013; 4:2191. doi: 10.1038/ncomms3191.
Sasaki, T., Suzaki, T., Soyano, T., Kojima, M., Sakakibara, H., Kawaguchi, M., 2014. Shoot-derived cytokinins systemically regulate root nodulation. Nat Commun 5, 4983. https://doi.org/10.1038/ncomms5983
van Noorden, G.E., Verbeek, R., Dinh, Q.D., Jin, J., Green, A., Ng, J.L.P., Mathesius, U., 2016. Molecular Signals Controlling the Inhibition of Nodulation by Nitrate in Medicago truncatula. Int J Mol Sci 17. https://doi.org/10.3390/ijms17071060
Soyano, T., Hirakawa, H., Sato, S., Hayashi, M., Kawaguchi, M., 2014. NODULE INCEPTION creates a long-distance negative feedback loop involved in homeostatic regulation of nodule organ production. PNAS 111, 14607–14612. https://doi.org/10.1073/pnas.1412716111
Vernié, T., Kim, J., Frances, L., Ding, Y., Sun, J., Guan, D., Niebel, A., Gifford, M.L., Carvalho-Niebel, F. de, Oldroyd, G.E.D., 2015. The NIN Transcription Factor Coordinates Diverse Nodulation Programs in Different Tissues of the Medicago truncatula Root. The Plant Cell 27, 3410–3424. https://doi.org/10.1105/tpc.15.00461
Okamoto, S., Ohnishi, E., Sato, S., Takahashi, H., Nakazono, M., Tabata, S., Kawaguchi, M., 2009. Nod factor/nitrate-induced CLE genes that drive HAR1-mediated systemic regulation of nodulation. Plant Cell Physiol. 50, 67–77. https://doi.org/10.1093/pcp/pcn194
Lim, C.W., Lee, Y.W., Lee, S.C., Hwang, C.H., 2014. Nitrate inhibits soybean nodulation by regulating expression of CLE genes. Plant Science 229, 1–9. https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2014.08.014
Ho, C.-H., Lin, S.-H., Hu, H.-C., Tsay, Y.-F., 2009. CHL1 Functions as a Nitrate Sensor in Plants. Cell 138, 1184–1194. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.07.004
Konishi, M., Yanagisawa, S., 2013. Arabidopsis NIN-like transcription factors have a central role in nitrate signalling. Nature Communications 4, 1617. https://doi.org/10.1038/ncomms2621
Nishida, H., Suzaki, T., 2018. Nitrate-mediated control of root nodule symbiosis. Curr. Opin. Plant Biol. 44, 129–136. https://doi.org/10.1016/j.pbi.2018.04.006
Lin JS, Li X, Luo Z, Mysore KS, Wen J, Xie F. NIN interacts with NLPs to mediate nitrate inhibition of nodulation in Medicago truncatula. Nat Plants. 2018 Nov;4(11):942-952. doi: 10.1038/s41477-018-0261-3.
Tabata R, Sumida K, Yoshii T, Ohyama K, Shinohara H, Matsubayashi Y. Perception of root-derived peptides by shoot LRR-RKs mediates systemic N-demand signaling. Science. 2014 Oct 17;346(6207):343-6. doi: 10.1126/science.1257800.
Ohyama K, Ogawa M, Matsubayashi Y. Identification of a biologically active, small, secreted peptide in Arabidopsis by in silico gene screening, followed by LC-MS-based structure analysis. Plant J. 2008 Jul;55(1):152-60. doi: 10.1111/j.1365-313X.2008.03464.x.
Imin N, Mohd-Radzman NA, Ogilvie HA, Djordjevic MA. The peptide-encoding CEP1 gene modulates lateral root and nodule numbers in Medicago truncatula. J Exp Bot. 2013 Dec;64(17):5395-409. doi: 10.1093/jxb/ert369.

6. Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
Для выполнения задач проекта будут применены методы, которые широко используются для решения сходных задач в современной генетике и биологии развития:
1). Для выявления генов, кодирующих пептиды CLE и CEP у гороха, а также изучения их полиморфизма, планируется осуществить секвенирование геномов нескольких линий гороха (Finale, SGE, Sparkle, Frisson) с помощью системы Illumina.
Сборка геномов будет проведена участниками проекта с использованием в качестве референса доступного генома гороха (Kreplak et al., 2019), а также собственных результатов секвенирования генома гороха при помощи технологии Oxford Nanopore (Afonin et al., готовится к публикации). Для сборки геномов линий гороха предполагается получить более 90 гигабаз 150х2 прочтений на приборе Illumina HiSeq4000 или подобном. Полученные прочтения для каждой линии будут очищены от примесей и низкокачественных прочтений, по алгоритму, использованному в статье (Muntyan et al., 2019) с дополнительной очисткой от возможных бактериальных загрязнителей. Для каждой линии будет произведено определение полного генотипа при помощи программы GATK и в соответствии в соответствии с “best practices”. Полученные результаты будут использованы для определения значимых замен в генах, а также для получения более точной информации о различиях геномов исследуемых линий.
На основании анализа геномов разных линий гороха и люцерны в проекте планируется исследовать полиморфизм генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, а также их рецепторы, и оценить связь аллельных вариантов с такими признаками как число образующихся симбиотических клубеньков и содержание азота в тканях растений. Для 99 генотипов гороха ранее был проведен анализ ответа на обработку симбиотическими микроорганизмами (Borisov et al., 2002), в том числе, были оценены ростовые параметры, биомасса растений и их семян, а также содержание в семенах азота и фосфора в условиях инокуляции различными полезными микроорганизмами. Эти данные будут использованы для определения ассоциации аллельного состояния секвенированных генов и проявления данных признаков.
Для серии линий люцерны данные о последовательностях генов CLE и CEP будут получены из базы данных HapMap http://www.medicagohapmap.org/hapmap, содержащей информацию о геномах более 300 инбредных линий люцерны. Поиск связи полиморфизма с фенотипическими характеристиками линий будет проводиться с помощью методов регрессионного анализа, в том числе с использованием алгоритмов обобщенной линейной модели (GLM) в программе Tassel.

2) Для выявления нитрат-регулируемых генов CLE и CEP у люцерны планируется проанализировать экспрессию ряда генов CLE и CEP в ответ на обработку нитратом с помощью количественной ПЦР в реальном времени, а также провести оценку спектра дифференциально экспрессирующихся генов с помощью анализа транскриптома растений люцерны, обработанных нитратом.
Количественный анализ экспрессии генов будет проведен с помощью системы CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, USA) с использованием набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя EvaGreen (Синтол, Россия). Количественная оценка уровней экспрессии анализируемых генов будет проведена методом Пфаффла (Pfaffl, 2001) в относительных единицах, рассчитанных при сравнении с уровнем экспрессии референсных генов убиквитина и актина. Для каждого образца количественный анализ экспрессии генов будет проведен в трех биологических повторностях, по три аналитических повторности в каждой, данные которых затем будут усреднены.
Секвенирование транскриптов планируется осуществить с помощью подхода MACE (Massive Analysis of cDNA Ends), позволяющего идентифицировать транскрипты только по последовательностям их 3‘-конца, что облегчает работу по анализу и обработке полученных данных, и в результате позволяет с меньшими затратами, по сравнению с секвенированием тотальной РНК, оценить спектр транскриптов в исследуемом образце. Выделение тотальной РНК будет проведено при помощи набора RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Германия). После проверки качества РНК на приборе Agilent TapeStation с использованием набора MACE kit для секвенирования по протоколу MACE (Massive Analysis of cDNA Ends) (Zawada et al., 2014) приготовляют библиотеки для секвенирования. Идея метода МАСЕ состоит в секвенировании короткого (до 100 п.н.) фрагмента, прилегающего к полиА-концу каждого транскрипта, что позволяет достичь значительной глубины секвенирования и, как следствие, повысить точность анализа дифференциальной экспрессии (Zawada et al., 2014; Жуков и др., 2015; Zhernakov et al., 2019. PeerJ, 7:e6662). После того, как все библиотеки будут приготовлены, их секвенирование будет проведено на приборе Illumina HiSeq X на коммерческой основе.

3) Для изучения функции и мишеней действия пептидов CLE и CEP планируется проанализировать транскриптомы растений со сверхэкспрессией генов CLE и CEP с помощью MACE-секвенирования. Для сверхэкспрессии генов CLE и CEP будут созданы конструкции на основе системы векторов Gateway, содержащие кодирующие последовательности соответствующих генов под контролем промотора 35S, а также репортерный ген GFP под контролем конститутивного промотора 35S для отботра трансгенных корней (вектор назначения — pBGWG2D, VIB-PSB, Гент, Бельгия). Полученные конструкциии будут использованы для трансформации растений с помощью агробактерий Agrobacterium rhizogenes.

4) Для идентификации новых генов, вовлеченных в авторегуляцию клубенькообразования, будет проведено геномное секвенирование двух мутантных линий гороха, несущих мутации в генах nod4 и fas, предположительно кодирующих компоненты системы CLAVATA.
Мутант «Штамбовый» был получен индуцированным мутагенезом (этилметансульфонат) из сорта Немчиновский-766 (Рехматулла, Гостимский, 1976). Этот мутант отличается выраженной фасциацией побега и увеличенным количеством симбиотических клубеньков. Соответствующий мутантный ген носит название fas и локализован в III группе сцепления (Синюшин, Гостимский, 2008). Линия K301 (несущая мутацию в гене nod4) была также получена индуцированным мутагенезом (нитрозоэтилмочевина) из сорта Рамонский-77 (Сидорова, Ужинцева, 1994). Этот мутант также сочетает признаки фасциации побега и повышенное количество клубеньков. Недавно было установлено, что мутация nod4 представляет собой аллель того же гена, что и у фасциированной линии Wt12185 из Wiatrowo (Польша), названного fa2. Ген FA2/NOD4 локализован в V группе сцепления гороха. Мутация nod4, хотя и не идентифицирована на молекулярном уровне, считается перспективной для селекции новых сортов с улучшенными показателями азотфиксации (Сидорова и др., 2012).

5) Также для изучения влияния пептидов CLE и CEP на процессы поглощения нитрата из среды и на накопление азота в тканях растений, мы планируем проанализировать экспрессию генов нитратных транспортеров NRT, а также провести оценку содержания азота в тканях растений со сверхэкспрессией генов CLE и CEP. Для этого будет использован стандартный метод определения содержания азота по Кьельдалю. Ожидается, что при сверхэкспрессии CEP у растений будет усилено поглощение нитрата из среды за счет системной активации генов нитратных транспортеров, что может приводить к увеличению содержания азота в биомассе. При этом сверхэкспрессия нитрат-активируемых генов CLE, напротив, как мы ожидаем, может приводить к снижению уровня поглощения азота из почвы, за счет системного подавления экспрессии генов нитратных транспортеров.

Общий план работ на весь срок выполнения проекта:

Этап 2020 года:
1.Секвенирование геномов линий гороха Frisson, Finale, Sparkle и SGE.
2.Идентификация генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, в геноме гороха; описание их разнообразия в пределах четырех исследованных линий, а также оценка профиля их экспрессии по данным секвенирования транскриптома, представленным в открытых базах данных.
3.Оценка уровней экспрессии генов CLE и CEP у люцерны и гороха при клубенькообразовании и при обработке нитратом с помощью количественной ПЦР в реальном времени.
4.Создание конструкций для cверхэкспрессии генов CLE и CEP у гороха и люцерны.

Этап 2021 года:
1.Анализ полиморфизма генов CLE и CEP у гороха (с использованием набора 99 генотипов из коллекции ВИР) и люцерны (с использованием данных ресеквенирования генома более 300 линий, доступных онлайн), и поиск ассоциаций с фенотипическими характеристиками (в том числе содержанием азота в семенах).
2.Анализ транскриптома растений люцерны и гороха при обработке нитратом.
3.Оптимизация методов агробактериальной трансформации гороха с помощью Agrobacterium rhizogenes.
4.Анализ транскриптома трансгенных растений люцерны и гороха со сверхэкспрессией нитрат-регулируемых генов CLE и CEP.

Этап 2022 года:
1.Анализ полиморфизма генов, кодирующих белки-рецепторы пептидов CLE и CEP у гороха и люцерны, и поиск ассоциаций с фенотипическими характеристиками.
2.Секвенирование геномов мутантов гороха по генам nod4 и fas, предположительно кодирующим компоненты системы CLAVATA, с целью обнаружения мутаций.
3.Анализ транскриптомов мутантов гороха по генам nod4 и fas, в том числе в условиях образования симбиоза с клубеньковыми бактериями и при обработке нитратом.
4.Оценка содержания азота в тканях растений гороха и люцерны со сверхэкспрессией нитрат-регулируемых генов CLE и CEP.

Цитируемая литература
Kreplak J., Madoui M.A., Cápal P., Novák P., Labadie K., et al. A reference genome for pea provides insight into legume genome evolution. – 2019 – Nat Genet. – V. 51. – N. 9. – P. 1411-1422.
Muntyan V., Afonin A. et al., (2019). The genome architecture of the strain Ensifer meliloti AK89, a highly effective symbiont of Medicago lupulina. FEBS Open Bio, 9: P-08-018. doi:10.1002/2211-5463.12675
Borisov A. Y., Tsyganov V. E., Shtark O. Y., Jacobi L. M., Naumkina T. S., Serdyuk V. P., et al. (2002). Pea: symbiotic effectiveness, in Catalogue of the World Collection of VIR, Vol. 728 (St.Petersburg: VIR Press), 29.
Pfaffl M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR //Nucleic acids research. – 2001. – Т. 29. – №. 9. – С. e45-e45.
Zawada A. M. et al. Massive analysis of cDNA Ends (MACE) and miRNA expression profiling identifies proatherogenic pathways in chronic kidney disease //Epigenetics. – 2014. – Т. 9. – №. 1. – С. 161-172.
Жуков В.А., Кулаева О. А., А. И. Жернаков, И. А. Тихонович «Секвенирование следующего поколения» для изучения транскриптомных профилей тканей и органов гороха посевного (Pisum sativum L.). – 2015. – Т. 50. – №. 3. – С. 278-287.
Zhernakov A. I. et al. Mapping-by-sequencing using NGS-based 3′-MACE-Seq reveals a new mutant allele of the essential nodulation gene Sym33 (IPD3) in pea (Pisum sativum L.) //PeerJ. – 2019. – Т. 7. – С. e6662.
Рехматулла А., Гостимский С.А. Цитогенетический анализ морфологических мутантов гороха // Научн. доклады высш. школы. Биол. науки. 1976. № 5. С. 107-112.
Сидорова К.К., Ужинцева Л.П. Локализация мутантного гена nod4, контролирующего супернодуляцию у гороха // ДАН. 1994. Т. 336. № 6. С. 847-849.
Сидорова К.К., Гончарова А.В., Гончаров П.Л., Шумный В.К. Селекция кормового гороха (Pisum sativum L.) на повышение азотфиксации с использованием симбиотических мутантов // Сельскохозяйственная биология. 2012. № 1. С. 105-109.
Синюшин А. А., Гостимский С. А. Генетический контроль признака фасциации у гороха посевного (Pisum sativum L.) // Генетика. 2008. Т. 44. С. 807–814

7. Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту.
Коллектив исполнителей принимает участие в разработке нескольких научных направлений, из которых тематике проекта в наибольшей степени соответствуют следующие:

1) Исследование молекулярно-генетических механизмов формирования и функционирования азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы.
В лаборатории заявителя поддерживается обширная коллекция генетических линий гороха посевного (Pisum sativum L.), включающую в себя более 100 образцов культурного гороха с различной степенью отзывчивости на инокуляцию клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы, а также около 100 линий гороха, несущих мутации в симбиотических генах. С использованием технологии секвенирования транскриптомов проводятся исследования роли симбиотических генов гороха в развитии взаимовыгодных симбиозов. В ходе недавнего исследования была идентифицирована последовательность гена LykX, контролирующего специфичность распознавания сигнальных молекул, выделяемых клубеньковыми бактериями (Sulima et al., 2017). Также была охарактеризована роль генов транскрипционных факторов Nsp1 и Nsp2 в развитии арбускулярной микоризы у гороха и впервые выявлена последовательность гена Sym34, кодирующего Nsp1 (Shtark et al., 2016). Разработан подход, позволяющий на основе данных РНК-секвенирования успешно проводить поиск мутаций в симбиотических генах гороха посевного (Zhernakov et al., 2019).
Коллектив заявителей принимает участие в работах, выполняемых в сотрудничестве с крупными европейскими научными центрами. Результатом этих работ явилась идентификация последовательностей генов гороха, участвующих в рецепции сигнальных молекул клубеньковых бактерий (Zhukov et al., 2008) и управляющих развитием и функционированием клубенька (Ovchinnikova et al., 2011; Couzigou et al., 2012; Azarakhsh et al., 2015; Magne et al., 2018), а также описание роли этих генов в развитии азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы.

2) Использование постгеномных технологий для изучения надорганизменных систем
В 2015 году руководителем проекта были опубликованы результаты первого в мире секвенирования транскриптома азотфиксирующих клубеньков гороха посевного (Zhukov et al., 2015). Секвенирование транскриптома в настоящее время активно используется для создания молекулярных маркеров у гороха посевного (Zhernakov et al., 2016). В 2017 году создана база данных, объединяющих информацию по 15 000 ген-специфичным молекулярным маркерам гороха посевного (Kulaeva et al., 2017). Освоено секвенирование геномов клубеньковых бактерий (Afonin et al., 2016), в настоящее время освоена также технология секвенирования от Oxford Nanopore и методики работы с данными, получаемыми в ходе секвенирования, что позволяет ставить амбициозные задачи, включая секвенирование генома гороха посевного и иных бобовых растений. Анализ транскриптома корней и клубеньков недавно позволил выявить изоформы генов, специфичных для клубеньков, и высказать предположение о роли альтернативного сплайсинга в тонкой регуляции экспрессии генов при развитии клубеньков (Зорин и др., 2019).

3) Выявление генетических основ эффективности симбиозов, формируемых бобовыми растениями, и разработка способов ее повышения в полевых условиях
Горох посевной является весьма полиморфным видом в отношении «отзывчивости» на инокуляцию грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями (Жуков и др., 2017). Изучение проблемы «отзывчивости на инокуляцию» в рамках проекта РНФ 16-16-00118 (руководитель Жуков В.А.) позволило выявить гены, являющиеся потенциальными маркерами проявления «отзывчивости на инокуляцию» (Zhukov et al., готовится к публикации). В ходе недавней работы (в рамках сотрудничества с группой к.б.н. А.А. Фролова, участника настоящего проекта) с использованием протеомного подхода было установлено, что растения «отзывчивого» генотипа реагируют на инокуляцию продлением фазы налива семян, а растения «неотзывчивого» генотипа – ускоренным завершением созревания семян, что отражается в увеличении массы семян при инокуляции лишь у «отзывчивого» генотипа (Mamontova et al., 2019). В другой недавней работе с применением метаболомики продемонстрирован также эффект продления жизненного цикла у растений сорта Finale под воздействием гриба АМ (Shtark et al., 2019).

4) Изучение систем авторегуляции клубенькообразования у гороха и люцерны.
Участники проекта имеют значительный опыт работы в области изучения молекулярных механизмов клубенькообразования и роли пептидов CLE в развитии растений. В этих направлениях нами был получен ряд приоритетных научных результатов. Нами впервые изучена роль гена WOX5 как регулятора развития клубеньков у бобовых, а также как мишени системы авторегуляции клубенькообразования (Osipova et al., 2012). Впервые показана роль транскрипционного фактора KNOX3 в контроле развития клубеньков у бобовых (Azarakhsh et al., 2015; 2019), а также изучено участие генов биосинтеза цитокининов в системном контроле клубенькообразования (Azarakhsh et al., 2018). Кроме того, участниками коллектива была исследована роль пептидов CLE и их мишеней, генов WOX, в развитии нерегулярных меристем и новообразований у растений (Lebedeva et al., 2015; Gancheva et al., 2016; Samorodova et al., 2018).

Таким образом, члены коллектива имеют обширный научный задел по теме проекта и обладают необходимой квалификацией для успешного выполнения задач проекта.

Цитируемая литература:
1. Зорин ЕА, Кулаева ОА, Афонин АМ, Жуков ВА, Тихонович ИА. Анализ событий альтернативного сплайсинга в кончиках корней и клубеньках Pisum sativum L. Экологическая генетика. 2019;17(1):53-63. doi: 10.17816/ecogen17153-63
2. Afonin A., Sulima A., Zhernakov A., Zhukov, V. Draft genome of the strain RCAM1026 Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Genomics Data. 2016. 11. 10.1016/j.gdata.2016.12.003.
3. Azarakhsh M, Kirienko AN, Zhukov VA, Lebedeva MA, Dolgikh EA, Lutova LA. KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX 3: a new regulator of symbiotic nodule development. // J Exp Bot. 2015 V. 66. N. 22. P. 7181-7195. doi: 10.1093/jxb/erv414.
4. Azarakhsh M., Lebedeva М.А., Lutova L.А. Identification and expression analysis of Medicago truncatula isopentenyl transferase genes (IPTs) involved in nodulation. Frontiers in plant science. 2018. 9: 304
5. Couzigou JM, Zhukov V, Mondy S, Abu el Heba G, Cosson V, Ellis TH, Ambrose M, Wen J, Tadege M, Tikhonovich I, Mysore KS, Putterill J, Hofer J, Borisov AY, Ratet P. NODULE ROOT and COCHLEATA maintain nodule development and are legume orthologs of Arabidopsis BLADE-ON-PETIOLE genes. // Plant Cell. 2012. V. 24. N. 11. P. 4498-4510. doi: 10.1105/tpc.112.103747.
6. Frolov A., Mamontova T., Ihling Ch., Lukasheva E., Bankin M., Chantseva V., Vikhnina M., Soboleva A., Shumilina Ju., Mavropolo-Stolyarenko G., Grischina T., Osmolovskaya N., Zhukov V., Hoehenwarter W., Sinz A., Tikhonovich I., Wessjohann L., Bilova T., Smolikova G., Medvedev S. et al. MINING SEED PROTEOME: FROM PROTEIN DYNAMICS TO MODIFICATION PROFILES Biological Communications. 2018. Т. 63. № 1. С. 43-58.
7. Gancheva MS, Dodueva IE, Lebedeva MA, Tvorogova VE, Tkachenko AA, Lutova LA. Identification, expression, and functional analysis of CLE genes in radish (Raphanus sativus L.) storage root. BMC Plant Biol. 2016;16 Suppl 1(Suppl 1):7. Published 2016 Jan 27. doi:10.1186/s12870-015-0687-y
8. Kulaeva O.A., Zhernakov A.I., Afonin A.M., Boikov S.S., Sulima A.S., Tikhonovich I.A., Zhukov V.A. Pea Marker Database (PMD) - A new online database combining known pea (Pisum sativum L.) gene-based markers. PLoS One. 2017; 12(10):0186713. doi: 10.1371/journal.pone.0186713.
9. Magne K., Couzigou J.M., Schiessl K., Liu S., George J., Zhukov V.A., Sahl L., Boyer F., Iantcheva A., Mysore K.S., Wen J., Citerne S., Oldroyd G., Ratet P. MTNODULE ROOT1 and MTNODULE ROOT2 are essential for indeterminate nodule identity // Plant Physiology. 2018. V. 178. N. 1. P. 295-316. doi: 10.1104/pp.18.00610.
10. Mamontova T., Afonin A.M., Ihling C., Soboleva A., Lukasheva E., Sulima A.S., Shtark O.Y., Akhtemova G.A., Povydysh M.N., Sinz A., Frolov A., Zhukov V.A., Tikhonovich I.A. Profiling of Seed Proteome in Pea (Pisum sativum L.) Lines Characterized with High and Low Responsivity to Combined Inoculation with Nodule Bacteria and Arbuscular Mycorrhizal Fungi. Molecules. 2019;24(8):1603. doi:10.3390/molecules24081603.
11. Osmolovskaya N, Shumilina J, Kim A, Didio A, Grishina T, Bilova T, Keltsieva OA, Zhukov V, Tikhonovich I, Tarakhovskaya E, Frolov A, Wessjohann LA. Methodology of Drought Stress Research: Experimental Setup and Physiological Characterization. Int J Mol Sci. 2018 Dec 17;19(12). pii: E4089. doi: 10.3390/ijms19124089.
12. Ovchinnikova E, Journet EP, Chabaud M, Cosson V, Ratet P, Duc G, Fedorova E, Liu W, den Camp RO, Zhukov V, Tikhonovich I, Borisov A, Bisseling T, Limpens E. IPD3 controls the formation of nitrogen-fixing symbiosomes in pea and Medicago Spp. // Mol Plant Microbe Interact. 2011 V. 24. N . 11. P. 1333-1344. doi: 10.1094/MPMI-01-11-0013.
13. Podolskaya EP, Gladchuk AS, Keltsieva OA, Dubakova PS, Silyavka ES, Lukasheva E, Zhukov V, Lapina N, Makhmadalieva MR, Gzgzyan AM, Sukhodolov NG, Krasnov KA, Selyutin AA, Frolov A. Thin Film Chemical Deposition Techniques as a Tool for Fingerprinting of Free Fatty Acids by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry. Anal Chem. 2019 Jan 15;91(2):1636-1643. doi: 10.1021/acs.analchem.8b05296.
14. Samorodova A.P, Tvorogova V.E., Tkachenko A.A., Potsenkovskaya E. A., Lebedeva М.А. Tikhonovich I.A., Lutova L.А. Agrobacterial tumors interfere with nodulation and demonstrate the expression of nodulation-induced CLE genes in pea. Journal of Plant Physiology. 2018. V. 221. P. 94-100.
15. Shtark O.Y., Sulima A.S., Zhernakov A.I., Klyukova M.S., Fedorina J.V., Pinaev A.G., Kryukov A.A., Akhtemova G.A., Tikhonovich I.A., Zhukov V.A. Arbuscular mycorrhiza development in pea (Pisum sativum L.) mutants impaired in five early nodulation genes including putative orthologs of NSP1 and NSP2. Symbiosis. 2016; 68(1): 129–144. doi: 10.1007/s13199-016-0382-2.
16. Shtark OY, Puzanskiy RK, Avdeeva GS, Yurkov AP, Smolikova GN, Yemelyanov VV, Kliukova MS, Shavarda AL, Kirpichnikova AA, Zhernakov AI, Afonin AM, Tikhonovich IA, Zhukov VA, Shishova MF. Metabolic alterations in pea leaves during arbuscular mycorrhiza development. PeerJ. 2019; 7:e7495. doi: 10.7717/peerj.7495.
17. Sulima AS., Zhukov VA., Afonin AA., Zhernakov AI., Tikhonovich IA., Lutova LA. Selection Signatures in the First Exon of Paralogous Receptor Kinase Genes from the Sym2 Region of the Pisum sativum L. Genome. Front Plant Sci. 2017;8:1957. doi:10.3389/fpls.2017.01957
18. Zhernakov A, Rotter B, Winter P, Borisov A, Tikhonovich I, Zhukov V. Massive Analysis of cDNA Ends (MACE) for transcript-based marker design in pea (Pisum sativum L.). Genom Data. 2016;11:75–76. doi:10.1016/j.gdata.2016.12.004
19. Zhernakov A.I., Shtark O.Y., Kulaeva O.A., Fedorina J.V., Afonin A.M., Kitaeva A.B., Tsyganov V.E., Afonso-Grunz F., Hoffmeier K., Rotter B., Winter P., Tikhonovich I.A., Zhukov V.A. Mapping-by-sequencing using NGS-based 3'-MACE-Seq reveals a new mutant allele of the essential nodulation gene Sym33 (IPD3) in pea (Pisum sativum L.). PeerJ. 2019;7:6662. doi: 10.7717/peerj.6662.
20. Zhukov V, Radutoiu S, Madsen L, Rychagova T, Ovchinnikova E, Borisov A, Tikhonovich I Stougaard J. The pea Sym37 receptor kinase gene controls infection-thread initiation and nodule development. Mol Plant Microbe Interact. 2008;21(12):1600-8. doi: 10.1094/MPMI-21-12-1600
21. Zhukov V.A., Zhernakov A.I., Kulaeva O.A., Ershov N.I., Borisov A.Y., Tikhonovich I.A. // De novo assembly of the pea (Pisum sativum L.) nodule transcriptome. Int. J. Genomics. 2015; 2015:695947. doi: 10.1155/2015/695947.

8. Детальный план работы на первый год выполнения проекта.

Общая задача на первый год:
На этап 2020 года планируется проведение следующих работ:

1. Секвенирование геномов линий гороха Frisson, Finale, Sparkle и SGE.
1.1. Выделение ДНК из проростков указанных линий (по стандартной методике с применением СТАВ-буфера, оптимизированной в лаборатории заявителя)
1.2. Секвенирование ДНК на приборе Illumina HiSeq4000 или HiSeq X (на коммерческой основе).
1.3. Сборка геномов и их анализ.

2. Идентификация генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, в геноме гороха; описание их разнообразия в пределах четырех исследованных линий, а также оценка профиля их экспрессии по данным секвенирования транскриптома, представленным в открытых базах данных.
2.1. Идентификация генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, в геномах исследованных четырех линий гороха (при помощи алгоритма BLAST, а также программы SPADA, предназначенной для поиска коротких генов).
2.2. Описание варьирования последовательностей генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, в пределах четырех исследованных линий гороха.
2.3. Оценка профиля экспрессии этих генов по данным секвенирования транскриптома, представленным в открытых базах данных (NCBI, Pea RNAseq Atlas), а также с использованием оригинальных данных, полученных в лаборатории заявителя.

3. Оценка уровней экспрессии генов CLE и CEP у люцерны и гороха при клубенькообразовании и при обработке нитратом с помощью количественной ПЦР в реальном времени.
3.1. Выращивание растений гороха и люцерны, их инокуляция штаммами ризобий, сбор корней с клубеньками на разных сроках разных сроках развития клубеньков (3, 5, 7, 12, 15, 18, 21 день после инокуляции)
3.2. Обработка проростков гороха и люцерны нитратом в гидропонной системе, сбор материала
3.3. Выделение РНК из полученного материала для последующего анализа экспрессии, синтез кДНК
3.4. Проведение количественной ПЦР на материце кДНК с праймерами к генам CLE и CEP, обработка результатов

4. Создание конструкций для cверхэкспрессии генов CLE и CEP у гороха и люцерны
4.1. Амплификация кодирующих областей генов CLE и CEP.
4.2. Клонирование кодирующих областей генов CLE и CEP в вектор ввода (pDONR221, Invitrogen, США) с помощью BP-клоназной реакции
4.3. Переклонирование кодирующих областей генов CLE и CEP в вектор назначения (pB7WG2D, VIB-PSB, Гент, Бельгия) с помощью LR-клоназной реакции
4.4. Введение полученных конструкций в клетки A. rhizogenes (штаммы Arqua, MSU440) путем элетропорации


9. Ожидаемые научные и (или) научно-технические результаты и их научная значимость.
В ходе выполнения первого этапа проекта будет проведено секвенирование геномов линий гороха Frisson, Finale, Sparkle и SGE. Ожидается, что использование оригинального референсного генома позволит получить более полную информацию о последовательностях генов, в том числе кодирующих короткие пептиды (CLE и CEP). Получение этих данных представляет значительный интерес, поскольку опубликованный референсный геном гороха сорта Cameor (Kreplak et al., 2019) имеет недостаточно высокое качество и не содержит большого количества коротких генов (либо они не проаннотированы должным образом). Таким образом, получение высококачественных сборок геномов 4 линий гороха позволит, во-первых, выявить последовательности серии представителей генных семейств, и, во-вторых, откроет возможность сравнения особенностей организации геномов у четырех неродственных линий гороха посевного.
Анализ геномов позволит выявить последовательности генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, а также впервые в мире описать их разнообразие в пределах четырех исследованных линий. Предполагается, что полиморфизм генов, кодирующих пептиды CLE и CEP, может быть связан с эффективностью накопления азота (эта гипотеза будет проверена на следующих этапах работы), поэтому запланированная работа представляет собой важный задел для дальнейших исследований.
Оценка профиля экспрессии генов гороха, кодирующих пептиды CLE и CEP, будет проведена на основе данных секвенирования транскриптома различных органов и тканей гороха. Эти данные находятся в открытых базах данных (NCBI, Pea RNAseq Atlas). Кроме того, в лаборатории заявителя получено большое количество данных анализа РНК-секвенирования гороха, которые также будут использованы для выявления клубенек-специфичных генов, принадлежащих семействам CLE и CEP, а также генов, активируемых/супрессируемых в ответ на обработку растений нитратом.
В работе также будут идентифицированы регулируемые нитратом и активирующиеся при клубенькообразовании гены CLE и CEP у люцерны (по данным экспрессионного атласа MtGea - Medicago truncatula Gene Expression Atlas). Кроме того, планируется получить данные по полиморфизму этих генов у разных линий люцерны и гороха, что сделает возможным анализ ассоциации аллельных состояний этих генов с такими признаками, как число симбиотических клубеньков и содержание азота в тканях растений.
Работа на следующих этапах проекта будет включать в себя анализ изменения спектра экспрессирующихся генов с помощью МАСЕ-секвенирования при сверхэспрессии генов CLE и CEP, на основании чего будут выявлены предполагаемые мишени действия этих регуляторных пептидов. Мы также планируем получить данные о роли пептидов CEP и CLE в регуляции поглощения азота из почвы (их влиние на экспрессию генов нитратных транспортеров) и его накопления в тканях растений.
Дальнейшая работа будет включать анализ полиморфизма генов, кодирующих белки-рецепторы пептидов CLE и CEP у гороха и люцерны (например, гены Sym29/SUNN, BAM3 и другие). Анализ будет проведен на наборе неродственных друг другу генотипов гороха, и поиск ассоциаций с фенотипическими характеристиками, полученными ранее для этих генотипов, будет направлен на идентификацию аллельных состояний этих генов, ассоциированных с повышенным накоплением азота в семенах. Также планируется секвенирование геномов мутантов гороха по генам nod4 и fas, предположительно кодирующим компоненты системы CLAVATA, с целью обнаружения мутаций, и анализ транскриптомов мутантов гороха по генам nod4 и fas (также при помощи МАСЕ-секвенирования), в том числе в условиях образования симбиоза с клубеньковыми бактериями и при обработке нитратом.
Получение этих результатов будут способствовать расширению понимания механизмов нитрат-опосредованной регуляции развития растений, что в перспективе станет основой для внедрения новых принципов возделывания сельскохозяйственно значимых культур, подразумевающих снижение вносимых азотных удобрений и увеличение доли микробных препаратов.

10. Планируемый объем дополнительно привлеченных средств из внешних по отношению к СПбГУ источников за весь период выполнения проекта.

РНФ 16-16-10011 «Молекулярные механизмы развития новообразований у высших растений при симбиозе и паразитизме» – 2 года, 6 000 000 руб в год

РФФИ (1150000.00 руб) 20-016-00129 А «Изучение новых компонентов системы авторегуляции клубенькообразвания и ответа на нитрат у бобовых» - 3 года

РНФ 16-16-00118П «Изменчивость транскриптома у форм бобовых растений с различной эффективностью азотного и фосфорного питания» - 2 года, 6 000 000 руб. в год
Короткий заголовокGZ-2020
АкронимМ1_2020 - 1
СтатусАктивный
Действительная дата начала/окончания22/06/2031/12/20

Ключевые слова

  • азотфиксирующие клубеньки
  • пептиды CLE
  • пептиды CEP
  • авторегуляция клубенькообразования
  • ответ растений на нитрат
  • геномное секвенирование
  • MACE-секвенирование
  • полиморфизм генов