Раздел 1. Исследование амплитудно-временных характеристик негативности рассогласования и сенсорного гейтинга при регистрации вызванных потенциалов мозга мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов в сравнении с мышами дикого типа в условиях хронического эксперимента.
Негативность рассогласования у мышей нокаутных по гену рецептора следовых аминов 1 типа (TAAR1)
Целью данного этапа исследования было изучить амплитудно-временные характеристики негативности рассогласования (НР) при регистрации вызванных потенциалов мозга мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов. Регистрация электроэнцефалограммы в свободном поведении проводилась у мышей, нокаутных по гену, кодирующему TAAR1, и мышей дикого типа (двенадцать мышей дикого типа (WT) и шестнадцать мышей-самцов, нокаутных по гену, кодирующему TAAR1 (TAAR1-KO), в возрасте от 3 до 5 месяцев были получены из вивария Института трансляционной биомедицины (Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия). Мыши дикого типа (WT) и мыши TAAR1-KO были получены путем скрещивания гетерозиготных животных C57BL6/129SvJ. (Описание методики экспериментов, рисунки и список литературы см. приложение 1). Известно, что НР отражает комбинацию реакции стимул-специфической адаптации к повторяющемуся стимулу (ССА) и механизма обнаружения отклонения. Для того, что бы разграничить эти два процесса мы сравнили стандартные и девиантные стимулы, зарегистрированные в парадигме «одд-болл», с контрольными стимулами, зарегистрированными в парадигме мультистандартного контроля. Результаты исследования Парадигма «одд-болл» На Рисунке 2 представлены усредненные ВП в ответ на предъявление стандартных и девиантных стимулов для групп TAAR1-KO и WT. Для ранних компонент ВП P1 (16–24 мс), N1 (28–36 мс) и P2 (52–60 мс) не было обнаружено статистически значимых различий между группами животных (p > 0.888), что указывает на сохранность ранних стадий обработки слуховой информации у мышей TAAR1-KO. Для компонента P2 была обнаружена разница в амплитуде ответа на девиантные и стандартные стимулы для двух групп животных (значимое влияние фактора Тип стимула: F(1, 26) = 4.324, p = 0.048, η2 = 0.143 ). Для компонент P1 и N1 значимых различий обнаружено не было (p > 0.126). Статистический анализ для позднего компонента ВП (168-184 мс) показал достоверное взаимодействие факторов Тип стимула*Группа (F(1, 26) = 5.518, p = 0.027, η2 = 0.175). Анализ парных сравнений показал достоверное увеличение негативности амплитуды ответа на девиантный стимул (М = 2.562, SD = 4.627) по сравнению с ответом на стандартный стимул (М = 5.013, SD = 2.391) в группе WT (p = 0.037). В группе TAAR1-KO достоверных различий между стандартными (M = 1.412, SD = 3.001) и девиантными (M = 2.416, SD = 4.641) стимулами обнаружить не удалось (p = 0.307). Анализ парных сравнений амплитуд ответа между двумя группами животных показал большую амплитуду ответа на стандартный стимул в группе WT по сравнению с группой TAAR1-KO (p = 0.002). Достоверных различий между амплитудами ответов на девиантные стимулы обнаружено не было (p = 0.935). Мультистимульная контрольная парадигма Привыкание, то есть снижение интенсивности реакции при повторяющемся действии раздражителя, оказывает значительное влияние на характеристики ВП. Особенно этот процесс влияет на амплитуду часто повторяющегося стандартного стимула и может вносить значительный вклад в разницу ответов на девиантные и стандартные стимулы (Ross, Hamm, 2020). Чтобы разграничить процессы стимул-специфической адаптации и обнаружения отклонения, мы сравнили ВП на стандартные и девиантные стимулы с ВП в ответ на предъявление контрольных стимулов соответствующей частоты, предъявляемых в мультистандартной контрольной парадигме. Результаты дисперсионного анализа показывают отсутствие достоверных различий между амплитудами ответов на девиантные и контрольные стимулы (p > 0.088). Для ранних компонент P1 и N1 в ответ на стандартные стимулы главные эффекты или взаимодействие факторов также не были значимыми (p > 0.494). Для компонента P2 была обнаружена разница между ВП в ответ на контрольные и стандартные стимулы как для группы WT, так и для группы TAAR1-KO (значимое влияние фактора Тип стимула: F(1, 26) = 7.456, p = 0.011, з2 = 0.223), что указывает на усиление реакции на контрольные стимулы. Для позднего компонента обнаружено значимое влияние фактора Группа (F(1, 26) = 7.551, p = 0.011, з2 = 0.225). Были проведены два отдельных однофакторных дисперсионных анализа, которые показали достоверное влияние фактора типа стимула в группе WT (F(1, 11) = 4.952, p = 0.048, з2 = 0.310) и отсутствие достоверных различий в группе TAAR1-KO (р = 0.513). Рисунок 2. Вызванные потенциалы и усредненная амплитуда пиков для групп TAAR1-KO и WT. (а) ВП в ответ на стандартные (серая линия), девиантные (черная линия) и контрольные (пунктирная линия) стимулы. Черная горизонтальная линия указывает время предъявления стимула. Серые прямоугольники показывают интервалы для статистического анализа. (b) Усредненная амплитуда пиков (M±SEM) для групп TAAR1-KO и WT в ответ на стандартные (серые столбцы), девиантные (черные столбцы) и контрольные (белые столбцы) стимулы; *р>.05 по результатам дисперсионного анализа и апостериорных тестов с использованием поправки Бонферони. Обсуждение результатов TAAR1 известен как нейромодулятор моноаминергических систем, обеспечивающий отрицательную регуляцию активности дофаминергических и серотонинергических нейронов (Bradaia et al., 2009; Revel et al., 2011; Espinoza et al., 2011; Revel et al., 2013). Способность TAAR1 регулировать моноаминергические системы обуславливает его заметную роль в возникновении психических и неврологических расстройств. Физиологические и патофизиологические эффекты TAAR1 выражаются в его антидепрессивном и прокогнитивном действии (Revel et al., 2013), а также в регуляции аддиктивного поведения (Pei et al., 2016; Thorn et al., 2014; Cotter et al., 2015; Liu et al., 2018). Кроме тогоTAAR1, вероятно, задействован в развитии ряда расстройств, таких как болезнь Паркинсона и шизофрения (Dedic et al., 2021). Прокогнитивная активность TAAR1 также подтверждается его влиянием на электрофизиологические корреляты когнитивных процессов: негативность рассогласования и сенсорный гейтинг (Aleksandrov et al., 2019a; Aleksandrov et al., 2019b). Снижение таламокортикального гейтинга (Adler et al., 1998), а также дефицит НР являются хорошо известными биомаркерами шизофрении (Light, Swerdlow, 2015), отражающими нарушение механизма адаптации или процесса обнаружения отклонений (Michie, 2001). Настоящее исследование направлено на то, чтобы представить дополнительные доказательства роли TAAR1 в генерации негативности рассогласования (НР) на модели грызунов. Обнаружено, что мыши TAAR1-KO демонстрируют уменьшение разницы в ответах на стандартные и девиантные стимулы в парадигме "одд-болл". В то время как у мышей линии TAAR1-KO ранние компоненты ВП (P1, N1, P2) не нарушены, наблюдаемый эффект отражается в изменении амплитуды позднего ответа (168-184 мс) на стандартный стимул. Поскольку НР представляет собой комбинацию процессов стимул-специфической адаптации и реакции обнаружения отклонения, мы сравнили стандартные и девиантные стимулы с контрольными стимулами, предъявляемыми в мультистандартной парадигме (Ross, Hamm, 2020). В этой парадигме все стимулы предъявлялись с одинаковой вероятностью равной 10%, что было идентично вероятности предъявления девиантных стимулов в парадигме "оддболл". Таким образом, ответы на контрольные стимулы, с одной стороны, имели более низкий уровень адаптации по сравнению с ответами на повторяющиеся стандартные стимулы, а, с другой, не были подвержены изменениям, вызванным новизной предъявляемого стимула (в отличие от девиантных стимулов). Нами было установлено, что ВП в ответ на девиантные стимулы достоверно не отличаются от ВП в ответ на контрольные стимулы, в то время как на стандартные стимулы достоверное различие наблюдается на временном интервале 168-184 мс. Это указывает на то, что разницу между ответами на стандартные и девиантные стимулы у мышей WT не может быть объяснена процессами обнаружения отклонения. Разница амплитуд, наблюдаемая между высокоадаптированными стандартными и низкоадаптированными контрольными стимулами вместе со сходной реакцией на девиантные и контрольные стимулы, позволяет предположить, что НР-подобный ответ у мышей WT, скорее всего, отражает процессы ССА. С другой стороны, мыши TAAR-KO не показывают различий между стандартными, девиантными и контрольными стимулами. Возможно, это свидетельствует о нарушении процесса ССА при предъявлении повторяющихся стимулов у мышей ТААR-КО, что выражается в отсутствии разницы между адаптированным стандартным и менее адаптированным контрольным стимулами. ССА представляет собой сложный и многоуровневый неврологический механизм, который регулирует интенсивность ответа на повторяющуюся стимуляцию. Он включает как ГАМКергическое постсинаптическое торможение (Duque et al., 2014), так и синаптическую депрессию на уровне коры, среднего мозга и таламуса (Ross, Hamm, 2020; Nelken, 2014; Natan et al., 2015; Malmierca et al., 2015). Роль TAAR1 в ССА может быть опосредована его обширным влиянием на моноаминергические системы. Введение агонистов TAAR1 приводит к снижению скорости возбуждения нейронов вентральной области покрышки (Revel et al., 2011), тогда как у мышей линии TAAR1-KO, а также при введении антагониста TAAR1 наблюдается противоположная реакция увеличения активности нейронов (Lindemann et al., 2008; Bradaia et al., 2009). В прилежащем ядре агонисты TAAR1 также ингибируют высвобождение дофамина in vitro (Leo et al., 2014) и in vivo (Leo et al., 2014), а мыши TAAR1-KO демонстрируют повышенную чувствительность постсинаптических рецепторов дофамина D2 в стриатуме (Espinoza et al., 2015). Обнаружено, что серотониновые нейроны в дорсальном ядре шва также подвержены влиянию TAAR1, что выражается в снижении возбуждения после введения полного агониста TAAR1 и увеличении возбуждения после введения антагониста (Revel et al., 2011). У мышей TAAR1-KO наблюдается повышенная частота спонтанной активности нейронов в дорсальном ядре шва (Revel et al., 2011), однако базовый уровень высвобождения серотонина в дорсальном стриатуме, прилежащем ядре и префронтальной коре не изменяется (Di Cara et al., 2011). Влияние дофаминергических и серотонинергических систем на НР хорошо известно, но содержит ряд противоречий: в нескольких исследованиях сообщалось, что снижение дофаминергической активности приводит к увеличению реакции на отклоняющийся стимул (Kähkönen et al., 2001; Valdés-Baizabal et al., 2020) а снижение синтеза серотонина выражается в уменьшении амплитуды НР (Ehlers et al., 1991; Ahveninen et al., 2002). С другой стороны, некоторые исследования указывают на увеличение амплитуды и уменьшение латентности НР при снижении синтеза серотонина (Kähkönen et al., 2005). Эффект уменьшения ССА наблюдается у мышей, после введения селективного ингибитора обратного захвата серотонина, и у мышей, нокаутных по гену, кодирующему транспортер серотонина (SERT-KO) (Pan et al., 2020). Мыши SERT-KO демонстрируют повышенный уровень серотонина в прилежащем ядре, скорлупе и префронтальной коре (Shen et al., 2004), повышенный уровень тревожности и снижение амплитуды НР (Pan et al., 2020). Таким образом, мы обнаружили, что у мышей TAAR1-KO наблюдается снижение ССА, что, скорее всего, является результатом нарушения модуляции моноаминергических систем. В совокупности полученные данные позволяютпредположить, что мыши TAAR1-KO могут представлять собой полезную модель нарушений НР. По результатам исследования по этому разделу опубликовано 2 статьи, в том числе 1 статья на английском языке в Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, индексируется в базе Web of Science, и ее вариант на русском языке, в Журнале эволюционной биохимии и физиологии Российской академии наук , индексируется в базе Russian Science Citation Index. Сенсорный гейтинг у мышей нокаутных по гену рецептора следовых аминов 1 типа (TAAR1) Целью данного этапа исследования было изучить амплитудно-временные характеристики сенсорного гейтинга (СГ) при регистрации вызванных потенциалов мозга мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов. Сенсорный гейтинг наряду с негативностью рассогласования (MMN) и преимпульсным торможением (PPI) является признанным нейрофизиологическим маркером шизофрении (Turetsky B.I. et al., 2007; Johannesen J.K. et al., 2013; Xia L. et al., 2020). Сенсорный гейтинг (от англ. gate - ворота) - это процесс дозирования и фильтрации информации, поступающей из окружающей среды, при помощи которого мозг регулирует величину ответов на сенсорные стимулы (Boutros and Belger, 1999; Javitt and Freedman R., 2015). Стандартная парадигма состоит из коротких звуковых стимулов с фиксированным межстимульным интервалов внутри пары стимулов и большим интервалом между парами стимулов (Freedman R. et al., 1987, Nagamoto H. et al. 1989). Ранее было показано (Aleksandrov et al., 2019), что агонист TAAR1 рецептора (RO 5263397) в дозировке 1 мг/кг способствует улучшению сенсорного гейтинга. Улучшение показателя сенсорного гейтинга происходило за счёт увеличения амплитуды компонента N40 в ответ на первый стимул в паре (S1), по сравнению со вторым стимулом в паре (S2). Поскольку агонисты TAAR1 рецептора оказывают весомое влияние на параметры сенсорного гейтинга, было принято решение изучить изменение сенсорного гейтинга у мышей нокаутных по ТААR1 рецептору. Регистрация электроэнцефалограммы в свободном поведении проводилась у мышей, нокаутных по гену, кодирующему TAAR1, и мышей дикого типа (одиннадцать мышей дикого типа (WT) и одиннадцать мышей-самцов, нокаутных по гену, кодирующему TAAR1 (TAAR1-KO), в возрасте от 3 до 5 месяцев были получены из вивария Института трансляционной биомедицины (Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия). Мыши дикого типа (WT) и мыши TAAR1-KO были получены путем скрещивания гетерозиготных животных C57BL6/129SvJ. (Описание методики экспериментов, рисунки и список литературы см. приложение 1). Параметры сенсорного гейтинга определялись при анализе соотношения амплитуд компонента N40 ВП в ответах на первый и второй стимулы в паре. Показатель сенсорного гейтинга высчитывался двумя способами: абсолютный показатель СГ – определялся путём вычитания амплитуды компонента N40, полученного на второй стимул (S2) в паре из амплитуды компонента N40 полученного на первый стимул в паре (S1), и относительный показатель СГ – полученный методом деления амплитуды компонента N40 полученного в ответ на S2 на амплитуду компонента N40 полученного в ответ на S1 (Boutros et all., 2004). Результаты исследования Полученные данные показывают, что амплитуда компонента N40 слухового ВП в ответ и на первый (S1), и на второй стимул в паре (S2) значительно меньше у мышей нокаутных по гену TAAR1. На Рисунке 3 представлены результаты подсчета амплитуды компонента N40 слуховых ВП для обеих групп мышей (амплитуда компонента представлена по модулю). Двухфакторный дисперсионный анализ (фактор 1: группа (TAAR1_KO и WT), фактор 2: стимул (S1 и S2) показал достоверное отличие обоих факторов. Фактор «группа» (TAAR1_KO и WT) F (1, 10) = 11,282, р=0,007. Фактор «стимул» (S1 и S2) F (1, 10) = 21,016, р0,001. Также было выявлено достоверное взаимодействие факторов «группа» (TAAR1_KO и WT) и «стимул» (S1 и S2) F (1, 10) =7,284, р=0,02. В связи с выявлением достоверного взаимодействия факторов было проведено попарное сравнение показателей амплитуд компонента N40 полученных в ответах на первый S1 и второй S2 стимул в паре. Данное сравнение показало значимое отличие амплитуды компонента N40 полученного в ответ на первый стимул в паре (S1) у нокаутных животных и животных дикого типа р=0,009 и значимое отличие амплитуды компонента N40 полученного в ответ на второй стимул в паре (S2) у нокаутных животных и животных дикого типа р=0,02. Рисунок 3. Амплитуда компонента N40 слухового ВП полученного в ответ на первый и второй стимулы. По горизонтальной оси – показатели в ответ на первый (S1) и на второй (S2) стимулы в паре, по вертикальной оси – усредненные значения амплитуды компонента N40 в мкВ (µV) Чёрные столбики (±SEM) – показатели мышей дикого типа (WT), серые столбики (±SEM) – показатели мышей нокаутных по гену TAAR1(KO TAAR1). * - различия достоверны р≤0,05. Результаты подсчета показателей СГ показаны на Рисунке 4. Абсолютный показатель СГ, который определялся путём вычитания амплитуды компонента N40, полученного на второй стимул (S2) в паре из амплитуды компонента N40 полученного на первый стимул в паре (S1) достоверно снижался у мышей нокаутных по TAAR1 - F (1, 10) = 7,3, р=0,02. Относительный показатель СГ, подсчитанный путем деления амплитуды компонента N40 в ответ на S2 на амплитуду компонента N40, полученного в ответ на S1, достоверно не отличался между изученными группами животных F (1, 10) = 0,08, р=0,78. Обнаружено значительное снижение амплитуды компонента N40 у мышей KO TAAR1 по сравнению с мышами дикого типа. Кроме того, абсолютное значение СГ, посчитанное методом (S1-S2), также было снижено, однако относительный показатель СГ, посчитанный методом (S1/S2), оставался неизменным. Рисунок 4. Показатели СГ для мышей дикого типа и мышей KO TAAR1. а — абсолютное значение СГ (SG), посчитанное методом вычитания амплитуды компонента N40 полученного на второй стимул из амплитуды компонента N40 на первый стимул в паре (S1-S2); по вертикальной оси – значение разности амплитуд компонента N40 в мкВ; b – коэффициент СГ, относительный показатель подавления величины компонента N40 в ответ на предъявление второго (S2) стимула в паре (S2/S1); серые столбики (±SEM)- показатель СГ у мышей нокаутных по гену TAAR1 (KO TAAR1), чёрные столбики (±SEM) – показатель СГ у мышей дикого типа (WT). * - достоверные отличия р0.05. Обсуждение результатов Результаты настоящего исследования продемонстрировали значительное ослабление компонента N40 слухового ВП у мышей нокаутных по гену TAAR1 по сравнению с мышами дикого типа. Наблюдается снижение амплитуды N40 в ответ как на первый (S1), так и на второй (S2) стимул в паре. Соответственно это приводит к снижению абсолютных значений сенсорного гейтинга в группе мышей нокаутных по гену TAAR1, однако коэффициент сенсорного гейтинга, показывающий относительную величину подавления ответа на второй стимул остается неизменным. Ранее, в хронических экспериментах на бодрствующих мышах линии C57BL/6 было показано, что введение агониста TAAR1 рецептора RO5263397 в дозировке 1 мг/кг значительно улучшает индекс сенсорного гейтинга, посчитанного методом (S1–S2) (Aleksandrov A. A., et al., 2019 a). Причем увеличение индекса СГ происходило за счет увеличения амплитуды компонента слухового ВП N40 в ответ на первый стимул в паре (S1). Таким образом стимуляция TAAR1 приводит к увеличению амплитуды компонента N40, а отсутствие рецепторов сопровождается значительным снижением компонента N40. Сенсорный гейтинг по компоненту N40 у мышей рассматривается в качестве аналога сенсорного гейтинга компонента Р50 у людей. Весьма интересно, что по данным ряда авторов ухудшение сенсорного гейтинга компонента Р50 при шизофрении в основном связано со снижением амплитуды ответа на первый стимул в паре (Brenner et al. 2009, Johannesen et al. 2005, Karkal, R., 2018). Подавление ответа на второй стимул, с одной стороны предположительно связывается с тормозными механизмами, лежащими в основе сенсорного гейтинга. В то же время снижение амплитуды может быть обусловлено увеличением рефрактерности нейрональных популяций, генерирующих соответствующие компоненты ВП. Поскольку в данной работе обнаружено заметное снижение электрогенеза компонента N40 окончательный вывод о природе изменения собственно сенсорного гейтинга при устранении рецепторов TAAR1 пока делать преждевременно. Настоящее исследование показало, что рецепторы TAAR1 играют важную роль в механизмах генерации слуховых ВП поскольку у генномодифицированных животных существенно падает амплитуда компонента N40 слуховых ВП. Исследование роли системы следовых аминов и TAAR1 в процессе дозирования и фильтрации информации представляет интерес для понимания патогенеза некоторых психических и неврологических расстройств. По результатам исследования по этому разделу опубликовано 2 статьи, в том числе 1 статья на английском языке в Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, индексируется в базе Web of Science, и ее вариант на русском языке, в Журнале эволюционной биохимии и физиологии Российской академии наук , индексируется в базе Russian Science Citation Index.
Раздел 2. Изучение характеристик преимпульсного торможения мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов и дикого типа и эффектов стрессорных воздействий на изучаемые нейрофизиологические механизмы.
Преимпульсное торможение (PPI) представляет собой снижение моторной реакции организма в ответ на сильный стимул в звуковой или зрительной модальности при наличии более слабого предварительного стимула. Реакция вздрагивания и индуцированное предварительным стимулом ингибирование реакции вздрагивания является широко используемым поведенческим тестом, который, как считается, является индикатором сенсомоторной фильтрации, позволяющей фильтровать нерелеватную сенсорную информацию, поступающую в ЦНС. В экспериментальных работах на человеке показано, что пациенты с шизофренией демонстрируют нарушение PPI и обнаруживают связь тяжести психотических симптомов с нарушениями преимпульсного торможения (Mena A, et al., 2016). Процент подавления реакции вздрагивания увеличивается у пациентов, принимающих нейролептики и является рутинно используемым тестом для скрининга новых антипсихотических препаратов. Весомым преимуществом изучения реакции вздрагивания у грызунов является возможность модуляция PPI фармакологическими агентами путём воздействия на моноаминергические системы. Показано, что агонисты дофамина, агонисты серотонина (5-HT), агонисты адренорецепторов α1 и антагонисты глутамата нарушают преимпульсное торможение в животных моделях (Mark A. Geyer et al., 2001). Изучение функции рецепторов к следовым аминам представляет интерес не только в связи с их модулирующим воздействием на моноаминергическую систему, которая, как известно, вовлечена в патогенез многих психиатрических заболеваний, но и в связи с широким спектром активности агонистов TAAR1 рецептора в отношении когнитивной, аффективной и психотической симптоматики (Gainetdinov RR et al., 2018). Данные по преимпульсному торможению на моделях животных, нокаутных по гену TAAR1 рецептора немногочисленны и демонстрируют разнонаправленные результаты. В ряде работ показаны статистически значимые различия между мышами нокаутами по гену рецептора TAAR1 и мышами дикого типа по выраженности подавления реакции вздрагивания, однако в других работах результат воспроизвести не удалось (Karmacharya R et al., 2011, Полякова, с соавт., 2018, Wolinsky et al., 2007). Представляется, что расхождения в результатах могут быть обусловлены рядом методических ограничений: вопервых, в работах не проводилось предварительное тестирование акустических порогов, во-вторых, амплитуда реакции вздрагивания зависит от особенностей моторного паттерна стартл-реакции, что, вероятно, повлекло дополнительные трудности в условиях стандартных оценок параметров моторного ответа. При этом стартл-реакцию определяли либо как пиковую амплитуду на определённом временном отрезке механограммы, либо и вовсе не указывали методов её подсчёта. Процедура габитуации также не велась по единому протоколу и могла проводится как за неделю до основного тестирования, так и предшествовать процедуре эксперимента в день его проведения. Целью данного этапа исследования было изучить параметры преимпульсного торможения мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов и дикого типа и эффекты стрессорных воздействий на изучаемые нейрофизиологические механизмы. На базе созданной исполнителями проекта автоматизированной установки для регистрации амплитудно-временных параметров преимпульсного торможения изучены сравнительные характеристики преимпульсного торможения у мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов и дикого типа. Имеющиеся к настоящему времени литературные данные о степени выраженности преимпульсного торможения у мышей-нокаутов по гену рецептора TAAR1 немногочисленны и неоднозначны (Полякова и др. 2018, Wolinsky T. et al., 2007, Saarinen M. et al., 2022.) Часть работ указывает на большую выраженность преимпульсного торможения у нокаутных животных, другие демонстрируют обратную тенденцию. Сложившиеся противоречия могут быть связаны с методическими особенностями реализации тестирования, в частности, отсутствием контроля акустических порогов возникновения стартл-реакции и генетически обусловленными различиями формы вызванной моторной реакции, которые могут приводить к неоднозначностям при использовании некоторых стандартных оценок параметров вызванной активности. Результаты исследования Протокол регистрации преимпульсного торможения выполнен на 13 мышах нокаутных по генам рецепторов TAAR1 и 12 животных дикого типа. Работа выполнялась в специализированном безэховом звукоизолированном помещении, для регистрации преимпульсного торможения использовалась экспериментальная камера цилиндрической формы диаметром 12 см. Источник звука находился над головой животного, на высоте 20 см от основания. Регистрация параметров механических колебаний основания камеры осуществлялась трехкоординатными акселерометрами ADXL355 (Analog Devices, США). Характер аппаратной реализации экспериментальной установки позволяет получать не только точечные оценки параметров (амплитуда главного максимума, площадь под кривой на интервале), но и регистрировать временную динамику вызываемой двигательной активности с частотой дискретизации 500 Гц как показано в примере на Рисунке 5. Рисунок 5. Огибающая акселерограммы вызванной стартл-реакции для трех вариантов стимуляции: pulse-стимул, prepulse-pulse (70 дБ), prepulse-pulse (80 дБ). Усреднено по 10 реализациям одного животного – нокаутного по генам рецепторов TAAR1. по оси ординат — амплитуда реакции (усл. ед), по оси абсцисс — время (мс) Для оценки параметров преимпульсного торможения на фоне немодулированного белого шума предъявляли рандомизированную последовательность шумовых звуковых посылок различной амплитуды и длительности, представляющих из себя четыре типа стандартных паттернов — одиночный высокоамплитудный тестирующий стимул (pulse-стимул), высокоамплитудный стимул предваряемый предупреждающей посылкой 70 дБ или 80 дБ (prepulseстимул) и аналогичную по длительности пустую последовательность. Основные параметры протокола — амплитуда фонового шума 65 дБ, амплитуда тестирующего стимула — 105 дБ, амплитуда предупреждающих стимулов 70 и 80 дБ, длительность тестирующего стимула — 40 мс, длительность предупреждающего стимула — 20 мс, длительность межстимульного интервала 100 мс. Количество предъявлений каждого тестирующего паттерна 10 раз. Перед экспериментом предъявлялась габитуирующая последовательность из пяти pulse-стимулов. Общая продолжительность эксперимента с учетом четырехминутного привыкания к нахождению в установке составляла ~17 мин. Предварительно, за двое суток до тестирования, производилось определение акустических порогов возникновения стартл-реакции. Для тестирования использовали рандомизированную последовательность pulse-стимулов различной амплитуды (от 70 дБ до 110 дБ, с шагом 5 дБ) предъявляемых на фоне белого шума амплитудой 65 дБ. Каждый из девяти видов pulse-стимулов предъявляли по девять раз. Общая продолжительность эксперимента с учетом четырехминутного привыкания к нахождению в установке составляла ~18 мин. По результатам предварительного тестирования отобраны 10 нокаутных животных по генам рецептора TAAR1 и 11 представителей дикого типа, продемонстрировавших достаточную однородность по признаку абсолютных значений акустических порогов возникновения стартл-реакции. Степень выраженности преимпульсного торможения (prepulse — 80 дБ) у животных нокаутных по генам рецепторов TAAR1 оказалась на 14 % выше чем у животных дикого типа. Достигаемый уровень значимости различий составил 0.045 ( Рисунок 6). Рисунок 6. Сравнительные характеристики стартл-реакции у мышей-нокаутов по генам рецепторов TAAR1 (ko) и дикого типа (wt) при предъявлении pulse-стимула и последовательности prepulse-pulse (амплитуда prepulse-компонента – 80 дБ). по оси ординат: усредненная амплитуда стартл-реакции (усл. ед); Изучение эффектов стрессорных воздействий на животных нокаутных по генам рецепторов TAAR5. Для изучения эффектов стрессорных воздействий на поведенческие характеристики проводилось сравнение выраженности преимпульсного торможения до и после тридцатиминутной иммобилизации животных. Тестирование выполнялось на 5 животных нокаутных по генам рецепторов TAAR5 и четырех животных дикого типа. Для формирования иммобилизационного стресса животных на 30 минут помещали в цилиндрический пластмассовый бокс диаметром 3 см и длиной 7,5 см. На размер выборки повлияла низкая выживаемость генномодифицированных животных в условиях неконтролируемого стресса. Достоверных различий выраженности преимпульсного торможения у нокаутных животных по отношению к животным дикого типа, вызываемых переживанием иммобилизационного стресса не обнаружено. Однако, имеющиеся тенденции указывают на различие скорости развертывания связанных со стрессом изменений выраженности преимпульсного торможения для двух групп животных. Для уточнения результата потребуется увеличение выборки. Обсуждение результатов Как уже отмечалось, характер различий выраженности преимпульсного торможения у нокаутных животных и представителей дикого типа пока не определен однозначно. В данной работе учтены методические аспекты связанные со значительными индивидуальными различиями акустических порогов возникновения стартл-реакции, которые, как оказалось, неравномерно распределены в сравниваемых подгруппах. Полученные данные, в значительной степени, соответствуют предположению о возможности существования генетически обусловленных отличий параметров реализации стартл-реакции у генномодифицированных животных. (по генам рецепторов TAAR1). Об этом, в частности, может свидетельствовать проявленная тенденция к увеличению достоверности полученных различий при увеличении длительности временного интервала используемого для оценки площади под кривой огибающей акселерограмму вызванного ответа. Для изучения эффектов стрессорных воздействий на поведенческие характеристики проводилось сравнение выраженности преимпульсного торможения до и после тридцатиминутной иммобилизации животных. Достоверных различий выраженности преимпульсного торможения у нокаутных животных (по генам рецепторов TAAR5) по отношению к животным дикого типа, вызываемых переживанием иммобилизационного стресса не обнаружено. Однако, имеющиеся тенденции указывают на различие скорости развертывания связанных со стрессом изменений выраженности преимпульсного торможения для двух групп животных. Для уточнения результата потребуется увеличение выборки. Заключение В ходе выполнения плана работ по гранту в 2022 году (первый год выполнения проекта) получены результаты исследования амплитудно-временных характеристик негативности рассогласования и сенсорного гейтинга при регистрации вызванных потенциалов мозга мышей нокаутных по гену рецепторов следовых аминов 1 типа в сравнении с мышами дикого типа в условиях хронического эксперимента. В ходе выполнения плана работ первого года получены параметры преимпульсного торможения мышей нокаутных по генам рецепторов следовых аминов и дикого типа и эффекты стрессорных воздействий на изучаемые нейрофизиологические механизмы. Полученные данные, в значительной степени, соответствуют предположению о возможности существования генетически обусловленных отличий параметров реализации стартл-реакции у генномодифицированных животных. План этапа выполнен полностью. Опубликованы 4 статьи. Материалы исследований по проекту доложены на 5 российских и международных конференциях. (План перевыполнен).