Гликирование - одна из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций белков, которая образуется при взаимодействии редуцирующих сахаров или α-дикарбонильных продуктов их деградации с лизиновыми и аргининовыми аминокислотными остатками [1]. Раннее гликирование инициируется взаимодействием редуцирующих сахаров (альдоз и кетоз) с лизильными аминогруппами, в результате чего образуются относительно лабильные иминовые интермедиаты (основания Шиффа), легко участвующие в так называемых Амадори-и Хейнс перегруппировках, приводящих к образованию кето - и альдоаминов (соединения Амадори и Хейнса) соответственно [2,3]. Эти соединения подвергаются дальнейшей трансформации в конечные продукты глубокого гликирования (КПГГ) - высоко гетерогенную группу соединений с выраженными провоспалительными свойствами [4]. КПГГ могут формироваться как эндогенно (например, в крови больных сахарным диабетом и хронической гипергликемией) [5], так и экзогенно (при тепловой обработке продуктов питания) [6]. Независимо от их происхождения, у млекопитающих КПГГ могут связываться с рецепторами эндотелиальных клеток, макрофагов, адипоцитов, вызывая опосредованную транскрипционным фактором NF-kB экспрессию провоспалительных генов [7]. Возникающее в результате этого системное воспаление лежит в основе развития симптомов атеросклероза и инсулинорезистентности, которые предшествуют возникновению сахарного диабета [8]. Таким образом, длительное увеличение содержания КПГГ в клетках и в крови является существенным фактором риска развития заболеваний [9]. Хотя формирование КПГГ у млекопитающих описано относительно хорошо, их образование и биологическая роль в растениях, грибах и бактериях все еще недостаточно изучена или вовсе неизвестна. Эти вопросы нуждаются в решении, ведь недавно гликирование было обнаружено в бактериальных [10] и растительных [11] клетках. Более того, количество модификаций у растительных белков значительно превышало таковое в плазме млекопитающих. Это, по нашему мнению, связано с более высоким содержанием реактивных метаболитов в тканях растений по сравнению с млекопитающими [12]. Также мы показали накопление КПГГ в органах растений при воздействии абиотического стресса [13] и в процессе старения [14]. Кроме того, нами недавно было обнаружено накопление КПГГ как в растительных, так и в ризобиальных протеомах стареющих клубеньков фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris) [15]. Нам удалось определить специфичные участки белков (горячие точки гликирования), которые способствовали гликированию в процессе старения. Однако их роль в старении клубеньков до сих пор неизвестна. Можно предположить, что эти модификации могут быть вовлечены в регуляцию растительно-микробных взаимодействий в клубеньках, то есть играть роль сигнальных молекул. Для решения этой проблемы будет охарактеризована реакция симбиотических бактерий Rhizobium leguminosarum, выделенных из корневых клубеньков гороха (Pisum sativum), на воздействие экзогенными КПГГ как в бактериальной культуре, так и в виде бактероидов. На основе всестороннего изучения динамики ризобиального протеома и метаболома будут описаны механизмы, лежащие в основе развития этой реакции. Выявление механизмов ответа на воздействие КПГГ позволит модулировать изменения в бактериоидах, вызванные стрессом и старением. Это откроет доступ к новым подходам для повышения устойчивости растений к абиотическому стрессу, увеличению урожайности сельскохозяйственных культур и предотвращению истощения сельскохозяйственных почв. Все средства и материалы, необходимые для работы с бактериальными культурами, имеются как на кафедре биохимии СПбГУ, так и в лаборатории профессора Wessjohann, то есть эта работа может быть продолжена и после предлагаемой здесь стипендии. Исследование будет дополнительно поддерживаться Российским фондом фундаментальных исследований в рамках проекта № 18-016-00190. Таким образом, общая цель данного проекта - охарактеризовать влияние экзогенных конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ) на протеом и метаболом ризобий (Rhizobium leguminosarum) в культуре бактериальных клеток и бактероидов. Для достижения поставленной цели будут решены следующие задачи:
1. Определить максимальную нетоксичную для ризобий концентрацию КПГГ. Ризобии (Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM 1026, предоставлены академиком И.А. Тихоновичем, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург, Россия) будут выращиваться в жидкой питательной среде в течение 48 часов (логарифмическая фаза роста). Затем к бактериальным клеткам/ бактеройдам будут добавлены различные концентрации КПГГ (MG-H1: Nδ-(5-метил-4-оксо-5-гидроимидазолинон-2-ил)-L-орнитин; PMG-H1: Ac-AFGSA[MG-H1]ASGA-NH2). Аргинин будет использоваться в качестве положительного контроля для MG-H1, а немодифицированный пептид (Ac-AFGSARASGA-NH2) для PMG-H1. В качестве отрицательного контроля будет применен ампициллин (100 мкмоль/л). После добавления соединений оптическая плотность бактериальной/ бактериойдной культуры будет измеряться при 620 нм в течение следующих 30 часов. Все исследуемые соединения были уже успешно синтезированы в ходе предыдущей совместной работы с профессором Ludger Wessjohann (Институт биохимии растений им. Лейбница, Галле, Заале, Германия).
2. Охарактеризовать проницаемость бактериальной мембраны для КПГГ. Бактерии будут выращиваться в жидкой питательной среде в течение 48 часов. После этого бактериальную суспензию трижды промоют 5 ммоль/л натрий-фосфатным буфером (рН 7,2) от компонентов питательной среды и продуктов бактериального метаболизма. Мембраны бактериальных клеток будут окрашены коммерческим красителем (SynaptoRed ™ C2) согласно протоколу, описанному Kondorosi с коллегами [16]. Далее флуоресцентные КПГГ (аминокислоты: NBD-DP-MG-H1, NBD-N-7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил; модифицированный пептид: CF-AFGSA[MG-H1]ASGA-NH2, CF-карбоксифлуоресцеин) будут добавлены в бактериальную или бактериойдную культуру. Флуоресцентный аргинин будет использоваться в качестве положительного контроля для NBD-DP-MG-H1, а немодифицированный флуоресцентный пептид (CF-AFGSARASGA-NH2) для флуоресцентного модифицированного пептида. Концентрация флуоресцентных соединений будет выбрана в ходе пробных экспериментов. После этого клетки снова будут трижды промыты 5 ммоль/л натрий-фосфатным буфером (рН 7,2). Эффективность проникновения КПГГ будет оцениваться с помощью конфокальной микроскопии. Все используемые соединения были успешно синтезированы в ходе предыдущей совместной работы с профессором Ludger Wessjohann (Институт биохимии растений им. Лейбница, Галле, Заале, Германия).
3. Изучить изменения ризобиального протеома, возникшие под влиянием КПГГ. Бактерии или бактероиды будут инкубироваться с максимальной нетоксичной концентрацией КПГГ и их контрольных соединений в течение 0, 5 и 18 часов. Это время инкубации соответствует логарифмической фазе роста (0h), лаг-фазе (5h) и линейной фазе роста (18h). После этого методом фенольной экстракции будет выделен тотальный белок [17]. Затем он будет гидролизирован до пептидов с помощью трипсина, как описано Фроловым и его коллегами [18]. Полнота гидролиза будет проверена при помощи диск-электрофореза в денатурирующих условиях [19]. После этого будет проведена отчистка пептидов при помощи твердофазной экстракции, а полученные фракции будут проанализированы с помощью nanoLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS. Полученные масс-спектрометрические данные будут проанализированы с использованием открытых баз данных и следующего программного обеспечения: Progenesis Q, Proteome Discoverer 2.2, XCalibur 3.0.
4. Выявить изменения бактериального метаболома, возникшие под влиянием КПГГ. Бактерии или бактероиды будут проинкубированы с максимальной нетоксичной концентрацией КПГГ в течение 0, 5 и 18 часов. Затем будут выделены первичные метаболиты, как описано Медведевым и его коллегами [20]. После полученные образцы будут проанализированы с использованием GC-MS. Анализ полученных хроматограмм и масс-спектрометрической информации будет осуществляться с использованием программного обеспечения AMDIS, MSDIAL и Xcalibur 3.0. Идентификация метаболитов будет основана на сравнении полученных масс-спектров с данными спектральной библиотеки NIST08 и спектральной библиотеки Института биохимии растений им. Лейбница. Руководить проектом будет профессор Ludger Wessjohann (заведующий кафедрой биоорганической химии Института биохимии растений им. Лейбница). Феномен гликирования интенсивно изучается в лаборатории профессора Wessjohann. В настоящее время в его лаборатории идет работа над несколькими проектами, связанными с формированием КПГГ у растений и бактерий. В частности, накопление КПГГ в клубеньках корней бобовых растений и их влияние на бобово-ризобиальный симбиоз. В последние годы в Институте биохимии растений им. Лейбница были синтезированы модельные КПГГ, а также их флуоресцентные производные. Эту работу профессор Wessjohann выполнил в тесном сотрудничестве с научным руководителем соискателя стипендии – доктором А.А. Фроловым. Следующим логическим шагом в этой совместной работе является применение КПГГ для изучения механизмов и путей гликирования у ризобий и бактеройдов. В этом контексте кафедра биоорганической химии Института биохимии растений им. Лейбница заинтересована в изучении прямого влияния КПГГ на симбиотические бактерии. В результате выполнения проекта будут определены нетоксичные концентрации конечных продуктов глубокого гликирования для ризобий, а также установлено, способны ли КПГГ проникать в бактериальные клетки. Также будут выявлены изменения протеома и метаболома ризобий под влиянием КПГГ. Этот ценный опыт и результаты, полученные в этом исследовании, несомненно, смогут быть полезны и для других проектов, выполняемых как в Институте биохимии растений им. Лейбница, так и в Санкт-Петербургском государственном университете. Сотрудники кафедры биоорганической химии обладают всеми необходимыми знаниями в области культивирования бактериальных клеток, химии белков, протеомики и метаболомики, а также в институте есть все необходимые приборы, лабораторные помещения и программное обеспечение.
Литература:
1.Milkovska-Stamenova, S.; Schmidt, R.; Frolov, A.; Birkemeyer, C. Agricultural And Food Chemistry 2015, 63, 5911–5919.
2.Heyns, K.; Noack, H. ChemischeBerichte1962, 95, 720–727.
3.Hodge, J.E. AdvCarbohydrChem 1955, 10, 169–205.
4.Ulrich, P.; Cerami, A. RecentProg. Horm. Res. 2001, 56, 1–21.
5.Monnier, V.M.; Sell, D.R.; Dai, Z.; Nemet, I.; Collard, F.; Zhang, J. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2008, 1126, 81–88.
6.Goldberg, T.; Cai, W.; Peppa, M.; Dardaine, V.; Baliga, B.S.; Uribarri, J.; Vlassara, H. J Am Diet Assoc 2004, 104, 1287–1291.
7.Pickup, J.C. Diabetes Care 2004, 27, 813–823.
8.Szoke, E.; Gerich, J.E. ComprTher 2005, 31, 106–112.
9.Uribarri, J.; Cai, W.; Sandu, O.; Peppa, M.; Goldberg, T.; Vlassara, H. Ann. N. Y. Acad. Sci.2005, 1043, 461–466.
10.Srebreva, L.N.; Stoynev, G.A.; Ivanov, I.G. Biotechnology & Biotechnological Equipment 2009, 23, 1068–1071.
11.Bechtold, U.; Rabbani, N.; Mullineaux, P.M.; Thornalley, P.J. Plant J. 2009, 59, 661–671.
12.Bilova, T.; Lukasheva, E.; Brauch, D.; Greifenhagen, U.; Paudel, G.; Tarakhovskaya, E.; Frolova, N.; Mittasch, J.; Balcke, G.U.; Tissier, A.; et al. J. Biol. Chem. 2016, 291, 7621–7636.
13.Paudel, G.; Bilova, T.; Schmidt, R.; Greifenhagen, U.; Berger, R.; Tarakhovskaya, E.; Stöckhardt, S.; Balcke, G.U.; Humbeck, K.; Brandt, W.; et al. J Exp Bot 2016, 67, 6283–6295.
14.Bilova, T.; Paudel, G.; Shilyaev, N.; Schmidt, R.; Brauch, D.; Tarakhovskaya, E.; Milrud, S.; Smolikova, G.; Tissier, A.; Vogt, T.; et al. J. Biol. Chem. 2017, 292, 15758–15776.
15.Matamoros, M.A.; Kim, A.; Peñuelas, M.; Ihling, C.; Griesser, E.; Hoffmann, R.; Fedorova, M.; Frolov, A.; Becana, M. Plant Physiol. 2018, 177, 1510–1528.
16.Farkas, A.; Maróti, G.; Kereszt, A.; Kondorosi, É. Front Microbiol 2017, 8, 51.
17.Isaacson, T.; Damasceno, C.M.B.; Saravanan, R.S.; He, Y.; Catalá, C.; Saladié, M.; Rose, J.K.C.  Nat Protoc 2006, 1, 769–774.
18.Mamontova, T.; Lukasheva, E.; Mavropolo-Stolyarenko, G.; Proksch, C.; Bilova, T.; Kim, A.; Babakov, V.; Grishina, T.; Hoehenwarter, W.; Medvedev, S.; et al..Int J MolSci 2018, 19.
19.Laemmli, U.K. Nature 1970, 227, 680–685.
20.Chantseva Veronika; Bilova Tatiana; Smolikova Galina; Frolov Andrej; Medvedev Sergei Biological Communications 2019, 64, 55–74.