CRISPR-Cas системы — это обширный класс защитных систем бактерии и архей, обеспечивающих иммунитет против чужеродных генетических элементов, таких как вирусы, плазмиды и транспозоны.
Защитный ответ CRISPR-Cas систем обеспечивается за счет внесения направленного разрыва в РНК или ДНК генома захватчика. Для внесения такого разрыва CRISPR-Cas системы используют эффекторные белки-нуклеазы, которые в комплексе с направляющими РНК, транскрибирующимися с CRISPR-кассеты, способны узнавать 20-30 нуклеотидные сайты в чужеродном геноме за счет комплементарного спаривания с ними направляющих РНК (крРНК, криспр РНК). Использование крРНК различной последовательности позволяет направлять Cas эффекторы на любые сайты ДНК/РНК, применяя их в целях генетической инженерии и для решения других биологических задач (регуляция транскрипции генов, детекция патогенов и др.) (Cong et al., 2013).
Поиск и характеризация новых CRISPR-Cas эффекторов позволяет расширить спектр применения Cas нуклеаз в биотехнологии.
Цель данной работы – характеризация CRISPR-CasY систем.
CasY CRISPR системы принадлежат к второму классу CRISPR-Cas систем и были изначально идентифицированы в метагенномных данных, в составе геномов CPR бактерий (candidate phyla radiation) (Burstein et al, 2017). CPR бактерии представляют более 15% всего бактериального разнообразия и являются клетками-симбионтами, проживающими в составе других прокариот, не способными к росту в изолированном виде. В связи со своим образом жизни CPR бактерии имеют малыый размер клеток и небольшие геномы.
Генетический локус CRISPR-CasY систем включает ген сasY, кодирующий белок около 1200 аминокислот; ген сas1, кодирующий белок-интегразу, вставляющую новые спейсерные последовательности, а также CRISPR кассету. Спейсерные последовательности CRISPR кассеты короче, чем в большинстве CRISPR-Cas систем, и имеют длину 17-19 п.н. В 2020 году группа Дженифер Дудны показала, что для работы такой системы кроме крРНК необходима дополнительная РНК, скаутная, которая аналогично трейсерной РНК CRISPR-Cas9 систем стабилизирует комплекс и необходима для правильной конформации эффектора. (Harrington et al, 2020). В работе Harrington et al была продемонстрирована активность системы CRISPR-CasY15, найденная в микробиоме термита.
В ходе работ 2020 года мы, опираясь на данные Harrington et al, а также на данные, полученные путем секвенирования малых РНК экстрагированных из бактерий несущих CRISPR-CasY системы, смогли восстановить in vitro ДНК-разрезающую активность другого ортолога, CasY1 из Катанобактерий, активность которого была продемонстрирована ранее только в бактериях, без знания последовательностей направляющих РНК (Burstein et al, 2017). В 2021 году мы увеличили эффективность разрезания ДНК этой CRISPR-Cas системой, подобрав оптимальные формы скаутной РНК. Мы показали, что CasY1 способен эффективно разрезать различные сайты ДНК in vitro и может быть использован для целевого узнавания ДНК.
Также в 2021 году были начаты биохимические исследования ортолога CasY2. Характеризация этой нуклеазы также требует получения рекомбинатного белка и информации о последовательности направляющих РНК. В связи с этим были созданы генетические конструкции для генерологической экспрессии casY2 гена в клетках E.coli и проведены работ по получению рекомбинатного белка. Для определения формы направляющих крРНК и скаутной РНК были проведены эксперименты по секвенирования малых РНК, экстрагированных из клеток, несущих систему.
2.1. Выбор оптимальной формы направляющих РНК для CRISPR-CasY1 путем проведения in vitro исследований
Проведенное в 2020 году определение последовательности направляющих РНК путем РНК-секвенирования, а также данные о форме скаутной РНК CasY15, полученные Harrington et al, позволили найти функциональную версию крРНК-скаутная РНК пары для системы CRISPR-CasY1, однако эффективность разрезания ДНК была низкой.
В 2021 году было решено найти наиболее эффективную версию скаутной РНК (сукаутРНК) путем проведения in vitro реакций разрезания ДНК с использованием скаутной РНК различной длины, опираясь на форму вторичных структур тестируемых РНК молекул.
На рисунке 1 (см файл отчета) показаны формы скаутных РНК, эффективность которых проверялась путем проведения экспериментов in vitro.
Для проверки эффективности работы РНК-белкового комплекса CasY1-крРНК-скаутнаяРНК были использованы следующие условия проведения реакций разрезания ДНК. В качестве ДНК мишени использовался двунитевой фрагмент ДНК длиной 820 п.н. с протоспейсером (мишенью) длиной 18 п.н., комплементарным спейсерному сегменту крРНК. Для разрезания ДНК использовался рекомбинатный CasY1 белок, полученный в ходе первого этапа проекта. Соотношения компонентов реакции, указаны в таблице 1 (см файл отчета). Реакция проходила в течение 30 минут при 37С в буфере CutSmart (NEB). Продукты реакции наносили на агарозный гель-электрофорез. Результаты эксперимента показали, что CasY1 наиболее эффективно разрезает ДНК мишень в присутствии скаутной РНК 2 (Рис. 2, см. файл отчета). Для дальнейших экспериментов была выбрана эта скаутная РНК.
Далее было решено проверить эффективность работы CasY1 в комплексе с скаутной РНК 1 в разрезании ДНК мишеней различной последовательности.
Для этого на двунитевом ДНК фрагменте длиной 1590 п.н. был выбран ряд мишеней, фланкированных CasY1 PAM (Protospacer adjacent motif) и сконструированы крРНК, имеющие спейсерные сегмены комплементарные выбранным целевым сайтам. Соотношения CasY1 к направляющим РНК представлены в таблице 2 файла отчета о НИР. Реакции разрезания ДНК проводили с использованием скаутной РНК 2 и различных крРНК (1-8). В качестве отрицательного контроля использовали пробу без крРНК. Продукты реакции наносили на агарозный гель электрофорез. Результаты эксперимента показали, что CasY1 в комплексе с скаутной РНК 2 эффективно вносит двунитевые разрывы в ДНК в выбранных сайтах (см. рисунок 4 файл отчета о НИР). Размеры продуктов рестрикции говорят о специфичности белка: CasY1 узнал только целевые сайты ДНК, что привело к образованию продуктов ожидаемого размера. Таким образом, в ходе работ 2021 года была подобрана оптимальная форма скаутной РНК системы CRISPR-CasY1, что позволило повысить эффективность разрезания ДНК с помощью эффекторного белка CasY1 in vitro.
2.2. Получение рекомбинантной версии нуклеазы CasY2
Для характеризации системы CasY2 in vitro необходимо получить рекомбинантный белок CasY2, а также определить и наработать необходимые направляющие крРНК и скаутные РНК.
Для выделения и очистки рекомбинантного белка CasY2 был использован протокол разработанный на прошлом этапе работ для получения белка CasY1. На первой стадии, была заклонирована плазмида pET21a_CasY2, кодирующая рекомбинантный белок CasY2 с His-таг (6xHis) на N-конце, T7 промотор, His-tag (6xHis), а также ген устойчивости к ампициллину. Полученная плазмида была трансформирована в компетентные клетки Rosetta E. сoli. 10 мл ночной культуры трансформированных баткрий разводили в 500 мл среды LB с добавлением ампициллина и растили клетки при температуре 37С до достижения оптической плотности 0.6 отн.ед. Далее клетки инкубировали в течение часа на льду и индуцировали экспрессию гена casY2 добавлением IPTG до концентрации 1 мМ, после чего клетки инкубировали при температуре 16C в течение 16 часов. Затем клетки осаждали на скорости 4000g в течение 30 минут и замораживали при температуре -20 С. Клеточный осадок растворяли в 15 мл лизисного буфера (50 mM Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 10% глицерин, 1 мМ бета-меркаптоэтанол) с добавлением 15 мг лизоцима. Затем клетки проходили ультразвуковую соникацию и центрифугировались в течение часа на скорости 16000g. Супернатант фильтровался (диаметр поры фильтра 0.22 мкм) и наносился на на колонку HisTrap HP 1 mL (GE Healthcare) на скорости 0.3 мл/мин для проведения аффинной хроматографии. После промывки лизисным буфером с добавлением 20мМ имидазола белок эллюировали лизисным буфером с добавлением 300 мМ имидазола. Собранные фракции центрифугировали в концентраторах Amicon Ultra-4 centrifugal unit (Merc Millipore) с порами размером 100 кДа до объема 600 мкл. Полученный образец наносили на гель фильтрационную колонку Superdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенную буфером 50 мМ Hepes-HCl pH=7.5, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT с добавлением 10% глицерина (Рис.4 см. файл отчета)
Результаты гель фильтрационной хроматографии показали, что CasY2 выделяется в виде высоко молекулярных агрегатов, которые вероятно образуются в результате частичного разворачивания белка и формирования крупных структур за счет гидрофобных взаимодействий. Мономеров белка, ожидаемой функциональной формы CasY2, на хроматограмме не наблюдалось. В связи с этим было решено получать рекомбинатную версию CasY2 c MBP тагом (Maltose binding protein) для повышения растворимости.
Ген сasY2 был заклонирован в плазмиду pET21a_CasY2_MBP, содержащую последовательность, кодирующую MBP на N-конце CasY и His таг, а также ген устойчивости к ампициллину.
Клетки Rosetta, трансформированные данной плазмидой, были выращены до оптической плотности 0.6 отн.ед., индукция экспрессии целевого гена была осуществлена добавлением 1 мМ IPTG. На рисунке 5 видно, что в клетках синтезируется белок нужного размера - 130 кДа (CasY2 c добавлением MBP).
Далее была проведена аффинная и гель фильтрационная очистка белка (Рис.6). Перед гель фильтрационной хроматографией MBP отрезали от CasY2 с помощью TEV протеазы (сайт узнавания фремента был расположен в линкерной части между MBP и CasY2). Анализ фракций гель-фильтрационной хроматографии на ПААГ в денатурирующих условиях и кривая хроматограммы позволили выявить кроме высокомолекулярных агрегатов, мономерные формы CasY2, хотя и в небольшом количестве. В ходе дальнейших работ будут оптимизированы условия выделения MBP_CasY2: будут проверены различные буферные условия и их влияние на количество выделяемой мономерной фракции. Оптимизация условий выделения позволит получить достаточное количество белка для проведения in vitro характеризации.
2.3. Определение последовательности направляющих РНК системы CRISPR-CasY2 с помощью РНК секвенирования
Для определения последовательности направляющих РНК системы CRISPR-CasY2 проводилось секвенирование малых РНК, экстрагированных из бактерий, несущих эту систему. В качестве бактерий, несущих систему, использовали E.coli DH5alpha, трансформированные плазмидой pACYC184_CasY2, кодирующей локус системы.
Клетки E. сoli, несущие систему, растили 16 часов при 37°C в среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола. Затем осаждали клетки центрифугированием на скорости 5000g в течение 30 мин. Из полученного бактериального осадка экстрагировали РНК.
Для этого осадок ресуспендировали в реагенте для экстракции РНК TRIzol (ThermoFisher, 15596026). Образец гомогенизировали при помощи шариков Disruption Beads for Bacteria (Research Products International Corp, 9830), обрабатывали хлороформом, после чего центрифугировали на скорости 12000g в течение 15 мин.
Полученный супернатант объединяли с равным объемом 100% этилового спирта и очищали при помощи набора Direct-Zol RNA (Zymo research, R2051). Для этого смесь переносили в колонку Zymo-Spin™ IICR Column с последующим центрифугированием на скорости 12000g в течение 30 сек. После добавления каждого следующего компонента колонку также центрифугировали на 12000g в течение 30 сек. Сначала в колонку вносили RNA Wash Buffer. Далее образец инкубировали с ДНКазой I (NEB, M0303S) в течение 15 мин на комнатной температуре. Затем в колонку дважды вносили Direct-zol™ RNA PreWash. После этого добавляли RNA Wash Buffer и центрифугировали в течение 2 мин. Содержимое колонки элюировали в 50 мкл воды.
Полученную РНК повторно обрабатывали ДНКазой I (NEB, M0303S). Образец очищали при помощи набора RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo research, R1013). Далее образцы
3'-дефосфорилировали при помощи T4 PNK путем инкубации при 37°C в течение 6 часов. Образец очищали при помощи набора RNA Clean & Concentrator-5.
Далее для удаления рибосомальной РНК использовали набор Ribo-Zero (Illumina, 15066012). Затем проводили очистку при помощи магнитных частиц для очистки РНК и кДНК Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, A63987).
Образцы для HTS получали с помощью набора для подготовки библиотек малых РНК NEBNext Multiplex для Illumina (NEB, E7300).
Полученную библиотеку секвенировали с использованием платформы Illumina MiSeq. Покрытие образца составляло около 1 млн прочтений. Оценка качества прочтения проводилась с использованием программы FastQC (Andrews, S. (2010)). Последовательности адаптеров и праймеров были удалены из прочтений при помощи AlienTrimmer v.0.4.0 (Criscuolo A. & Brisse S. (2013)). После проверки качества и удаления вспомогательных последовательностей были отсеяны около 181 тысяч парных прочтений. Оставшиеся 800 тысяч прочтений были выровнены на референсную последовательность CRISPR CasY2 локуса при помощи Bowtie 2 (Langmead B. & Salzberg S. L. (2012)) Визуализация полученных результатов проводилась при помощи программы Geneious Prime (https://www.geneious.com).
Результаты анализа показали, что в E.coli происходит слабая гетерологическая экспрессия РНК CRISPR-CasY2 системы: видна транскрипция предполагаемой скаутной РНК, однако CRISPR кассета транскрибируется слабо, невозможно идентифицировать отдельные крРНК молекулы. Несмотря на это можно определить направление транскрипции кассеты и использовать эту информацию для синтеза направляющих РНК in vitro. Определенные последовательности направляющих РНК будут использованы в ходе дальнейших работ для исследования активности CRISPR-CasY2 in vitro.
2.4. Воссоздание работы CRISPR CasY2 системы in vitro
Определенные путен РНК-севенипрования последовательности направляющих РНК были использованы для синтеза этих молекул in vitro. Синтез проводили с использованием NEB кита для транскрипции Т7 полимеразой.
Для проверки активности CRISPR-CasY2 была синтезирована двунитевая ДНК-библиотека, несущая последовательность второго спейсера CRISPR кассеты в качестве ДНК мишени, фланкированная семью рандомизированными нуклеотидными позициями. Разрезание такой библиотеки in vitro и последующее секвенирование разрезанных образцов позволит определить PAM последовательность, требуемую CasY2 для успешного узнавания ДНК.
Полученное в ходе работ количество мономера CRISPR-CasY2 позволило провести реакции разрезания ДНК, используя низкие концентрации белка эффектора, в связи с чем, не удалось детектировать разрезание ДНК-библиотеки. Получение мономерной формы белка большей концентрации путем оптимизации процедуры выделения, позволит определить PAM CasY2 в ходе дальнейших работ.
