А. Анализ формирования оксида азота клетками Polytomella parva в условиях голодания по макроэлементам, и выяснение возможности нитрозилирования белков.
В клетках Polytomella parva происходит аргинин-зависимое формирование оксида азота (Lapina et al., 2022). Поскольку ранее нами было установлено, что Chlamydomonas reinhardtii генерирует оксид азота в условиях голодания по макроэлементам, то в работе 2022 года был проведен анализ уровней NO у P. parva при удалении из среды азота, серы или фосфора. Уровни NO в средах без макроэлементов достоверно не отличались от контроля. Т.о., в отличие от близкородственной водоросли Chlamydomonas reinhardtii, у P. parva не происходит формирование оксида азота в условиях голодания по макроэлементам. Подобное отличие может быть связано с разными механизмами формирования NO у этих двух водорослей.
По нашим данным (Lapina et al., 2022) клетки нефотосинтезирующей водоросли используют функциональный аналог NO-синтаз животных и Ostreococcus tauri, который катализирует формирование оксида азота из аргинина, и аргинин-зависимая генерация NO приводит к повышению количества групп R-SNO в белках. Для дополнительного подтверждения S-нитрозилирования белков в клетках P. parva, инкубированных с аргинином, был использован Вестерн-блоттинг с китом Pierce S-нитрозилирования. Поскольку пик флуоресценции и максимальное количество групп -SNO были зафиксированы при инкубировании с 1 мМ аргинина в течение 0,5 ч, то S-нитрозилирование белков с помощью кита Pierce исследовали в тех же условиях. После блокирования свободных SH-групп с помощью MMTS, пробы обрабатывали реагентом iodоTM для мечения S-нитрозилированных белков, а затем идентифицировали с использованием антител против ТМТ. Инкубирование с 1 мМ аргинином в течение 0,5 ч привело к нитрозилированию белков, имеющих Мол. массу в интервале от ~27 до 70 кДа.
Т.о., посттрансляционная модификация (ПТМ) по типу S-нитрозилирования характерна для P. parva, и предположительно используется нефотосинтезирующей водорослью для NO-зависимого контроля роста P. parva в среде с аргинином (Lapina et al., 2022).

Б. Выяснение роли Са2+ и цГМФ в декодировке NO-зависимых сигналов у Polytomella parva при солевом стрессе.
В прототипический NO-зависимый сигнальный путь, функционирующий в клетках животных, вовлечены растворимые гуанилатциклазы. Для выяснения того, используется ли NO/цГМФ-сигнальный модуль клетками Polytomella parva нами были проанализированы уровни цГМФ с помощью кита cGMP Enzyme Immunoassay Kit, Direct. Уровни цГМФ не изменялись при переносе клеток в среду с аргинином, в том числе в условиях солевого стресса. Полученные данные согласуются с последними результатами, полученными на высших растениях и некоторых водорослях, которые не подтверждают функционирование модуля NO/цГМФ у растений и водорослей.
Ранее рядом авторов было показано, что NO действует после вовлечения Са2+ при действии ряда стрессоров на водоросли. Краситель на основе флуоресцеина Calcium Green ™ -1 (AM) не удалось загрузить в клетки Polytomella parva, т.к. происходило их разрушение после внесения красителя. В этой связи нами был опробован альтернативный подход с использованием хелатора Са2+ - ЭГТА (2мМ). Внесение ЭГТА в среду до создания солевого стресса приводило к снижению уровней флуоресценции, что предполагает вовлечение катионов кальция в NO сигнальный путь.
В. Проверка предположения о роли альтернативной оксидазы 1 Chlamydomonas reinhardtii в генерировании NO, экспрессия и активность которой возрастает в условиях дефицита фосфора.
Поскольку в работах 2021 года нами было установлено, что экспрессия и активность АОХ1 возрастает при удалении фосфора из среды, то была проверена возможная роль альтернативной оксидазы 1 в этих условиях. Сравнительный анализ уровней оксида азота в штамме СС4533 и полученного из него мутанта аох1 показал, что флуоресценция, определяемая внутриклеточным NO, через 48-96 ч в мутантном штамме в 2.2-1,6 раз выше, чем в диком типе.
Полученные данные указывают на то, что АОХ1 не вовлечена в процесс генерирования оксида азота. Возможно, что, как и в случае высших растений, АОХ1 принимает участие в детоксикации NO. Однако нельзя исключить то, что в мутанте может экспрессироваться на более низком уровне CYP450, который катализирует в клетках C. reinhardtii формирование N2O из NO, контролируя тем самым уровни оксида азота (Zalutskaya et al., 2021). Какой из возможных механизмов определяет более высокие уровни NO в клетках, дефектных по АОХ1, будет проверено в 2022 году.

Г. Получение дополнительных мутантов Ostreococcus tauri по гену, кодирующему нитратредуктазу (NR)
С помощью метода, отработанного в 2021 году, штамм Ostreococcus tauri RCC4221 (Rosco Culture Collection) был выращен в среде L1 (NCMA). Клетки O. tauri были трансформированы плазмидой POLK1. Из 145 трансформантов, устойчивых к ампициллину и канамицину, у 90 штаммов была выявлена люциферазная активность в опытах с люциферином. Из отобранных трансформантов был получен штамм O. tauri RCC4221-35 с нарушенной экспрессией гена, кодирующего нитратредуктазу. У мутанта, изолированного в 2021 году (O. tauri RCC4221-22) и мутанта O. tauri RCC4221-35 была проверена активность нитратредуктазы в сравнении с исходным штаммом. Как видно из рис. 8, внесение нитрата приводит к увеличению активности нитратредуктазы дикого типа в три раза. В штаммах 22 и 35 активность фермента не фиксировалась ни в контроле, ни после переноса клеток в среду с нитратом.

Д. Проведение сравнительного анализа уровней оксида азота в клетках дикого типа и NR-мутантах Ostreococcus tauri, в норме и условиях стресса
Известно, что в клетках Ostreococcus tauri функционирует NO-синтаза, которая катализирует формирование оксида азота из аргинина. Действительно, в среде с аргинином фиксировалось формирование оксида азота. Поскольку перенос в темноту или удаление из среды макроэлементов не приводили к изменению уровней оксида азота в среде с аргинином, то в качестве стрессора была использована высокая интенсивность света. Клетки O. tauri были выращены при ~40 mmol m-2 s-1 до логарифмической фазы и далее перенесены на свет с интенсивностью ~300 mmol m-2 s-1 на 24 ч. При действии высокой для клеток интенсивности света фиксировалось возрастание уровней оксида азота. Следует отметить, что эти уровни не отличались достоверно от уровней, зафиксированных в мутантах 22 и 35. Кроме того, перенос клеток в 10мМ нитрит не только не приводил к возрастанию уровней оксида азота, но в этих условиях наблюдалось значительное снижение флуоресценции. Последнее обстоятельство дополнительно указывает на отсутствие нитрит-зависимого механизма формирования оксида азота у O. tauri.

Е. Выяснение способности галофильной водоросли Dunaliella salina генерировать NO
Способность к генерированию оксида азота выявлена у различных высших растений и одноклеточных зеленых водорослей. Однако до сих пор никто не проанализировал формирование NO у галофильной модельной водоросли Dunaliella salina. Для выяснения того, способна ли D. salina генерировать NO, клетки водоросли были выращены в среде с мочевиной в качестве источника азота и затем перенесены в среду, содержащую 10мМ нитрит. В клетках D. salina действительно происходит возрастание уровней флуоресценции уже через 15 мин, после чего фиксируется дальнейшее увеличение, которое через 1-6 ч в 3 раза превышало уровни NO, генерируемые в клетках на среде с мочевиной. При более длительном инкубировании (48 ч) уровни флуоресценции снижались и не превышали уровни, зафиксированные в контрольных клетках.
Далее мы проанализировали, будут ли изменяться уровни NO при более высоких концентрациях вносимого нитрита. При увеличении концентрации нитрита в два раза (20 мМ), уровни флуоресценции в опытных клетках были выше приблизительно в 6-7 раз по сравнению с контрольными. При внесении 25 мМ нитрита разница с контролем фиксировалась от 6 до 11 раз вплоть до 6ч. Через 24ч – 48 ч разница в флуоресценции по сравнению с контролем во всех вариантах снижалась. Наблюдаемое снижение может быть связано с процессами вывода из клеток избытка нитрита и/или процессами детоксикации NO.
Известно, что вольфрамат натрия (Na2WO4) ингибирует нитратредуктазу. Действительно, 2 мМ ингибитора полностью блокировали активность фермента у D. salina. При этом жизнеспособность клеток сохранялась. Кроме того, вольфрамат натрия подавлял генерирование оксида азота. Полученные данные предполагают возможную роль нитратредуктазы в формировании NO из нитрита. Наши предварительные данные указывают на наличие второй нитратредуктазы у D. salina. Т.о., для окончательного вывода о роли нитратредуктазы в генерировании оксида азота необходимо получение и анализ мутантов по генам, кодирующим нитратредуктазы водоросли, который запланирован на 2023 год.

Ж. Экспрессия, очистки и наработка рекомбинантного усеченного гемоглобина Polytomella parva
Плазмида pASK-IBA3, содержащая последовательность усеченного гемоглобина Polytomella parva, была трансформирована в E. coli Lemo. Индукцию проводили с использованием 0,2 М ангидротетрациклина. Далее рекомбинантный РрТНВ, содержащий С-концевой пептид Strep-tag II, был очищен с помощью аффинной хроматографии на колонке Strep-Tactin Superflow (IBA). Биохимические свойства полученного белка будут проанализированы в 2023 году.