4.3.7.1. Научная проблема, на решение которой направлен проект.

Способные к образованию амилоидоподобных фибрилл белки играют важную роль как в нормальном функционировании живых организмов, так и при возникновении патологии. Функциональные амилоиды принимают участие в амплификации биологических сигналов (Zamorano Cuervo et al., 2018), формировании памяти (Ashami et al., 2021), инактивации биологически активных полипептидов (McGlinchey & Lee, 2018). В то же время амилоидогенные белки играют ключевую роль в патогенезе большого числа заболеваний (Benson et al., 2020). При вирусных и бактериальных инфекциях образование амилоидоподобных фибрилл в ряде случаев также является одним из факторов патогенности (Shaldzhyan et al., 2021)(Pretel et al., 2013) (Charnley et al., 2022). Проект направлен на изучение функциональных и патологических амилоидов, поиск и характеристику новых амилоидов эукариот, а также поиск факторов, влияющих на амилоидогенез и фазовую сепарацию белков, для разработки подходов к диагностике, профилактике и (в перспективе терапии) терапии социально-значимых заболеваний.

4.3.7.2. Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
Более 70-ти заболеваний человека и животных связаны с неправильной укладкой и формированием фибриллярных белковых агрегатов (амилоидов) различными белками. Все эти заболевания объединены под общим название – амилоидозы. Наиболее социально значимыми амилоидозами являются болезнь Альцгеймера (БА), поражающая 5% людей в возрасте старше 65 лет и являющаяся одной из старческой деменции, диабет II типа, от которого страдает более 400 млн человек в мире, с амилоидами связывают и некоторые формы онкологических заболеваний, а также патологии, нарушающие репродуктивный цикл человека. Большинство амилоидозов неизлечимы, многие смертельны и приводят к колоссальным экономическим потерям из-за необходимости ухода за пациентами. Помимо патогенных амилоидных белков, в последние годы появляется всё больше данных о "функциональных" амилоидах, которые выполняют важные биологические функции, такие как регуляция долговременной памяти, хранение пептидных гормонов, регуляция трансляции и транскрипции и другие. Таким образом, амилоиды играют важную роль в биологических и патологических процессах.
Механизмы, влияющие на формирование и воспроизведение амилоидов, плохо понятны, факторы риска почти не известны, что препятствует как развитию профилактических и терапевтических подходов к амилоидным заболеваниям, так и пониманию связи амилоидов с нормальными биологическими процессами.
Актуальность и социальная значимость предлагаемого проекта обусловлена его направленностью на обеспечение здоровья нации, что является важной задачей государства в социальной сфере, с целью продления активного долголетия. Улучшение здоровья населения способствует продлению активной фазы жизни, повышает эффективность трудовой деятельности в старших возрастных группах и снижает расходы на уход за пациентами с нейродегенеративными заболеваниями.

4.3.7.3. Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен
Целью данной работы является выяснением закономерностей лежащих в основе процессов амилоидогенеза и фазовой сепарации белков, а также поиск факторов, влияющих на амилоидогенез, для разработки подходов к диагностике и терапии социально-значимых заболеваний.
Для выполнения заявленной цели поставлены следующие задачи:
1.Идентификация и характеристика новых амилоидных белков и пептидов.
2.Изучение механизмов влияния цис- и трансдействующих факторов на склонность белков к амилоидной агрегации.
3.Исследование взаимосвязи между процессами, контролирующими амилоидогенез и стабильность генома.
4.Изучение механизмов, лежащих в основе фазовой сепарации белков.
5.Разработка новых подходов для неинвазивной генетической и биохимической диагностики и (в перспективе) терапии амилоидозов человека и животных.

4.3.7.4. Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости
решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Научная новизна задач данного проекта связана с выяснением закономерностей лежащих в основе процессов амилоидогенеза и фазовой сепарации белков и использование полученных знаний для разработки новых подходов к диагностике, профилактике и терапии социально-значимых амилоидозов.
В соответствии с поставленными задачами в рамках проекта будут выявлены и охарактеризованы новые амилоидогенные белки и пептиды, а также выявлены цис- и трансдействующие факторы влияющие, на формирование амилоидов. Будут исследованы механизмы, лежащие в основе фазовой сепарации белков и проанализирована возможная взаимосвязь фазовой сепарации белков с формированием амилоидов. Впервые будет проанализирована взаимосвязь между амилоидогенезом и мутагенезом. Используя задел, полученный в ходе предыдущих исследований, будут разработаны новые неинвазивные подходы для диагностики амилоидозов человека, включая болезнь Альцгеймера.
Достижимость поставленных задач определяется тем, что руководитель и заявленный коллектив имеют обширный опыт в исследовании амилоидов, что подтверждается публикациями в ведущих научных журналах. Сотрудниками лаборатории получены научные результаты, сделавшие возможным использование дрожжей в качестве экспериментальной системы для изучения амилоидов и прионов. Руководитель проекта А.А. Рубель принимал непосредственное участие в разработке системы позволяющей проводить фенотипическую детекцию амилоидов человека и других млекопитающих в клетках дрожжей. Для успешной реализации Проекта в состав коллектива вошли специалисты из разных областей биологии, включая: генетику, цитологию, биоинформатику, биохимию и молекулярную биологию. К настоящему времени разработанные, в том числе, руководителем и участниками проекта новые методологии выявления амилоидогенных белков и протеомного скрининга амилоидов успешно апробированы в экспериментах с известными амилоидогенными белками.

4.3.7.5. Современное состояние исследований по данной проблеме.
Общее состояние проблемы.
Амилоиды - упорядоченные белковые фибриллы, способные к воспроизведению по механизму нуклеированной полимеризации. Большинство амилоидов, формируются за счёт образования межмолекулярных водородных связей между бета-структурами полипептидов. В результате присоединения к амилоидному олигомеру новых мономеров образуются протофибриллы, которые объединяются в фибриллы и крупные амилоидные агрегаты. Белки, способные формировать амилоидные фибриллы, найдены в самых разных группах живых организмов: бактериях, растениях, грибах (дрожжах и мицелиальных аскомицетах) и животных [Van Gerven et al., 2015; Si et al., 2010; Majumdar et al., 2012; Fioriti et al., 2015; Chakrabortee et al., 2016; см. Liebman and Chernoff, 2012].
Условно все амилоиды можно разделить на две группы: патогенные и функциональные [по: Invernizzi et al., 2012]. В настоящее время известно более 70-ти различных амилоидных заболеваний человека [Eisenberg and Jucker, 2012]. К числу наиболее социально значимых амилоидных заболеваний относятся болезни Альцгеймера, Паркинсона, хорея Хантингтона, боковой амиотрофический склероз, а также инфекционные амилоиды – прионы, вызывающие такие болезни как коровье бешенство (передающееся человеку) и болезнь Кройцфельдта-Якоба. По последним данным, амилоиды также связаны с диабетом второго типа и преэклампсией (гестозом), а также некоторыми формами рака.
Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения, болезнь Альцгеймера является самым распространенным в мире неизлечимым нейродегенеративным заболеванием. Во всём мире от болезни Альцгеймера страдает более 46 млн. человек [2018 Alzheimer’s Disease Facts and Figures]. Предполагается, что в связи с увеличением средней продолжительности жизни в развитых странах к 2050 году эта цифра возрастет в 3 раза [2018 Alzheimer’s Disease Facts and Figures].
Большинство охарактеризованных амилоидов человека демонстрирует цитотоксические свойства [Eisenberg and Jucker, 2012; Resenberger et al, 2011], но есть и примеры амилоидов, выполняющие физиологические функции. Белок Pmel17 в амилоидной форме выступает в качестве "скаффолда", способствующего полимеризации пигмента меланина [Fowler et al., 2006]. Млекопитающие запасают многие гормоны секреторных гранул в виде обратимых амилоидных агрегатов [Maji et al., 2009]. Белок CPEB моллюска Aplysia californica и его ортологи у Drosophila melanogaster и Mus musculus формируют амилоидоподобные SDS-устойчивые олигомеры, которые связаны с долговременной памятью [Si et al., 2010; Majumdar et al., 2012; Fioriti et al., 2015]. У дрожжей-сахаромицетов и некоторых других грибов к настоящему времени идентифицировано более 10 эндогенных амилоидов, передающихся по наследству через цитоплазму. Их называют прионами грибов (дрожжей) [Инге-Вечтомов и др., 2012; Liebman and Chernoff 2012]. Как правило, прионобразующие белки дрожжей содержат прионные домены, отвечающие за формирование амилоидных фибрилл. Формирование прионов дрожжей индуцирует временная сверхпродукция прионообразующего белка (наиболее эффективно - в клетках, содержащих другие прионы), а воспроизведение и наследование прионов дрожжей осуществляется в результате последовательных циклов фрагментации (под действием белков-шаперонов) и роста амилоидных фибрилл [Инге-Вечтомов и др., 2012; Liebman and Chernoff, 2012; Chernova et al., 2017]. Некоторые прионы дрожжей патогенны, тогда как для других прионов дрожжей предполагаются позитивные биологические функции. Многие прионы дрожжей контролируют фенотипически детектируемые признаки, что делает их удобной моделью для изучения общих закономерностей амилоидогенеза. Наиболее часто в качестве такой модели используют фактор [PSI+], прионную форму фактора терминации трансляции Sup35 [Wikner, 1994; Zhouravleva et al., 1995; Inge-Vechtomov et al., 2003]. Один из прионных белков, Het-s, обнаруженный у гриба Podosporа, вовлечён в контроль вегетативной несовместимости через деструкцию мицелия, не содержащего прион, в случае контакта – процесс, сходный с программированной клеточной гибелью [Saupe and Daskalov 2012]. Несколько прионных белков дрожжей являются регуляторами транскрипции, и, по крайней мере, для одного из них - белка Swi1 (компонента комплекса Swi/Snf), показана роль в регуляции укладки хроматина. Прионизация Swi1 может нарушать ремоделирование хроматина, тем самым внося наследуемые изменения в регуляцию транскрипции генов [Du et al., 2008]. Значительное количество белков, вовлечённых в регуляцию транскрипции, как у дрожжей, так и в клетках млекопитающих содержат последовательности, сходные с амилоидогенными участками прионов дрожжей, но возможность формирования амилоидов этими белками и потенциальная роль таких амилоидов плохо исследованы.
В целом, данные, имеющиеся в литературе, позволяют утверждать, что способность формировать амилоиды in vivo характерна для большого количества белков (в том числе и человеческих), и связана как с патологическими процессами, так и с нормальной биологической регуляцией.
Большинство известных нам амилоидов обнаружены в связи с их ролью в заболеваниях, или же благодаря биологическим эффектам в хорошо исследованных экспериментальных моделях. Не менее 1% белков в протеоме человека имеют домены, сходные с прионными доменами дрожжей [Michelitsch and Weissman, 2000] и, несомненно, что реальное число амилоидогенных белков в протеоме человека гораздо выше, потому что большинство известных амилоидов человека не сходны с известными амилоидами дрожжей по аминокислотным последовательностям.
Стоит отметить, что, несмотря на значительные успехи в исследовании амилоидов, имеющиеся данные, как правило, носят разрозненный характер и не позволяют в полной мере оценить распространённость и значимость амилоидов в живой природе.
Механизмы, приводящие к развитию амилоидозов, изучены слабо. Ранняя диагностика для большинства амилоидозов, а также подходы к лечению для большинства амилоидозов отсутствуют. Исключением являются прионные заболевания (инфекционные амилоидозы), для которых разработаны подходы для самой ранней диагностики. При этом данная группа заболеваний по-прежнему неизлечима, и все прионные заболевания неизбежно оканчиваются летальным исходом. Лучше дело обстоит с системными амилоидозами, для которых может успешно применяться терапия. Однако успешность терапии, этих заболеваний, существенно зависит от стадии, на которой они были диагностированы (Oerlemans et al., 2019). В настоящее время диагноз амилоидоза может быть однозначно поставлен только после изучения биопсийного материала. В случае ренальных амилоидозов из почки. Классический анализ, который позволяет с большой степенью уверенности диагностировать амилоидоз, заключается в окрашивании образцов ткани красителем Конго красным и выявлением эффектов двойного лучепреломления и дихроизма в поляризованном свете от связывания данного красителя с амилоидами (Puchtler et al., 1962; Howie et al., 2008). К настоящему времени разработаны различные подходы на основе иммунодетекции, а также масс-спектрометрических и имиджинговых технологий, которые позволяют уточнить тип амилоидоза путем анализа биопсийного материала, связывающего Конго красный (обзор Wisniowski, Wechalekar, 2008). Однако инвазивный характер подобной диагностики, которая выявляет заболевание уже на терминальных стадиях развития, требует разработки новых подходов для подтверждения развития амилоидоза и определения его типа. Единственным условно неинвазивным методом, для которого показаны практически 100% чувствительность и специфичность, является диагностика с помощью введения в сосудистое русло и визуализации накопления радиоактивных меток в амилоидных отложениях миокарда. Данный метод разработан исключительно для выявления транстиретинового амилоидоза сердца и при условии, что у пациента отсутствует дискразия плазматических клеток (Gillmore et al., 2016). Использование радиоактивно меченого амилоидного P компонента также позволяет эффективно диагностировать наличие амилоидных отложений, но без уточнения их типа (Hazenberg et al., 2006). Таким образом, неинвазивная диагностика амилоидозов и его типов на ранних стадиях развития является актуальной проблемой, а поиск новых диагностических маркеров, указывающих на развитие различных типов амилоидозов, имеет научную значимость для понимания механизмов развития данных заболеваний.
В настоящее время известно ограниченное число препаратов, рекомендованных для борьбы с конформационными заболеваниями и действующих напрямую на образование амилоидоподобных фибрилл и токсичных префибриллярных олигомеров. Многие субстанции, препятствующие образованию фибрилл (такие, как beta-strand breakers или препараты на основе модифицированных азотистых оснований) были обнаружены в рамках исследований, проводившиеся в in vitro – и впоследствии оказались неэффективными при применении на модельных животных. Это может быть связано как с биораспределением субстанций и связанными с ним концентрационными эффектами, так и с модификацией молекул препарата в живой клетке или участием клеточных систем фолдинга в процессе фибриллогенеза. В то же время – высокопроизводительный скрининг антиамилоидогенных соединений на моделях животных связан с большими финансовыми расходами и трудозатратами.

4.3.7.6. Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок
выполнения проекта.
Для решения поставленных задачи будут применены как хорошо зарекомендовавшие себя в ходе предыдущих исследований, проводимых коллективом, методы и подходы, так и ряд современных методов анализа и поиска амилоидов, значительная часть которых разработана с участием членов коллектива.
Для получения генно-инженерных конструкций, кодирующих амилоидогенные белки, будет применен широкий спектр современных молекулярно-биологических методов: амплификация ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР); методы плазмидного конструирования с последующим рестрикционным анализом и секвенированием [Sambrook, 2012]; метод бактериальной трансформации [Inoue, 1990]; метод выделения плазмидной ДНК из бактерий с помощью щелочного лизиса [Sambrook, 2012].
При получении штаммов дрожжей S. cerevisiae, продуцирующих различные амилоидогенные белки человека, будет использован метод дрожжевой ДНК-трансформации [Rose et al., 1990], а также целый ряд стандартных методов работы с дрожжами-сахаромицетами [Захаров и др., 1984; Rose et al., 1990].
Присутствие приона [PSI+] в клетках дрожжей будет детектироваться по росту на селективных средах, или по цвету колоний на полной среде [см. Инге-Вечтомов, 1996; Liebman and Chernoff, 2012].
Характеристика агрегатов, формируемых амилоидными белками млекопитающих в дрожжах и клетках нейробластомы человека, потребует применения широкого спектра современных молекулярно-биологических и биохимических методов: получение белковых лизатов из дрожжевых клеток [Рубель, 2008] и клеток нейробластомы [Meriin et al, 2007]; метод дифференциального центрифугирования [Patiano et al., 1996], метод SDS-электрофореза в полиакриламидном геле [Laemmli, 1970]; метод полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле SDD-AGE [Kryndushkin et al., 2003], метод модифицированного SDS-электрофореза в полиакриламидном геле, включающий денатурацию пробы кипячением геля в середине электрофоретического анализа [Kushnirov et al., 2006]; Вестерн-блот гибридизации [Sambrook, 2012].
Для анализа агрегации амилоидогенных белков in vitro, белки или их амилоидогенные фрагменты будут выделены и очищены из клеток E. сoli с помощью металл-аффинной хроматографии на колонках. При необходимости будет проведена дополнительная очистка белков методами ионообменной хроматографии. Для получения амилоидных фибрилл препараты очищенных белков будут инкубированы в условиях, описанных ранее [Serio et al., 1999; Sulatskaya et al., 2016]. Агрегация белков in vitro будет детектироваться по связыванию с кросс-бета специфичным флуоресцентным красителем тиофлавином Т с последующей детекцией на спектрофлуориметре, или по накоплению детергент-устойчивой фракции, не способной входить в полиакриламидный гель без кипячения.
Для анализа амилоидогенных белков млекопитающих в культурах клеток нейробластомы человека и в клетках дрожжей, будут использованы методы конфокальной микроскопии в сочетании с цитологическими методами окрашивания внутриклеточных структур флуорохромами [см. Сайфитдинова, 2008]. Для визуализации амилоидогенных белков будут использованы конструкции, содержащие флуоресцентные белки (GFP, CFP и YFP).
Для анализа морфологии амилоидных фибрилл, полученных in vitro, будет использована сканирующая электронная микроскопия [см. Sen et al., 2007].
Будет проведён биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей с использованием алгоритма ArchCandy [Ahmed et al., 2015], предсказывающего образование складчатых кросс-бета структур (бета-арок).
Для оценки амилоидогенно потенциала белков in vivo будут использованы два подхода:
Первый из них представляет собой уникальную дрожжевую тест-систему, позволяющую проводить анализ белков-кандидатов, по способности нуклеировать прион. В качестве репортера агрегации белков-кандидатов выступают дрожжевые прионы (инфекционные амилоиды), возникновение которых на фоне агрегации изучаемых белков легко детектируется по росту дрожжей на культуральных средах (Chandramowlishwaran et al., JBC, 2018).
Второй подход основан на анализе амилоидогенного потенциала белков в бактериальной системе C-DAG, предложенной Сиванатаном и Хокшильдом (Sivanathan and Hochschild, 2012, 2013). Система C-DAG позволяющей секретировать белки на поверхность бактериальных клеток и изучать их фибриллогенез. Для анализа амилоидогенного потенциала исследуемого белка с помощью C-DAG последовательность, кодирующая белок интереса, будет слита с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид CsgAss. Благодаря CsgAss изучаемый белок экспортируется на поверхность клеток бактерий, где формирует фибриллы в случае, если он способен к амилоидной агрегации. Далее амилоидогенный потенциал белков будет оценён тремя способами: 1) По связыванию амилоидных фибрилл, находящихся на поверхности бактериальных клеток с красителем Конго красным, непосредственно в селективной для роста бактерий среде. При связывании фибрилл с Конго красным бактериальные колонии приобретают малиново-красный оттенок. Таким образом, по окраске колоний можно быстро проводить первичный отбор белков, способных к амилоидной агрегации, и оценивать их амилоидогенный потенциал. 2) По способности окрашенных Конго красным колоний E. coli демонстрировать двойное лучепреломление в поляризованном свете. 3) С помощью просвечивающей электронной микроскопии. Поскольку внеклеточные фибриллы хорошо видны в электронный микроскоп, есть возможность изучить их морфологические особенности (Sivanathan and Hochschild, 2012, 2013).
Для оценки устойчивости агрегатов к действию ионных детергентов, а также оценки размера амилоидных полимеров, будет использован метод полуденатурирующего электрофореза в агарозном геле SDD-AGE [Krynduskin et al., 2003], с последующей детекцией белка при помощи вестерн-блот гибридизации.
Кроме этого, будет проведена оценка протеазоустойчивости агрегатов (в том числе, будет использована обработка амилоидов протеиназой К и трипсином). С использованием методов масс-спектрометрии будут выявлены участки протеазоустойчивые участки ответственные за формирование амилоидов.

Ключевым биохимическим маркером, говорящим о возможном старте патологического каскада при болезни Альцгеймера, являться появление агрегированной (мультимерной) формы пептида Aβ42. Нами предлагается подход к диагностике БА направленный на детекцию мультимеров Aβ42 в биологических жидкостях человеческого организма (в первую очередь крови, лимфе, поскольку в отличие от спинномозговой жидкости, пробы этих жидкостей можно взять без значительной опасности для организма).
Для детекции агрегатов Aβ42 в биологических жидкостях будет адаптирован метод циклической амплификации агрегатов амилоидогенного белка (известный в англоязычной литературе как Protein Misfolding Cyclic Amplification, или PMCA), метод позволяет детектировать наличие агрегированных форм белка в образце, даже если они находятся там, в исчезающе малой концентрации. В настоящий момент методика PMCA применяется только для диагностики прионных заболеваний человека и животных (прионные заболевания связаны с агрегацией белка Prion Protein), а также в исследовательских целях для амплификации амилоидов грибов. Показана принципиальная применимость метода для детекции амилоидных мультимеров Aβ42 человека (Salvadores et al., 2014).
Предлагаемый метод PMCA будет состоять из 3-х этапов:
1.Выделение суммарного белка (из крови или лимфы, или мочи)
2.Амплификация амилоидных фибрилл Aβ42 (включает в себя циклические раунды: - рост амилоидных фибрилл (за счёт включения синтетического растворимого белка Aβ42) - разбивка крупных амилоидных фибрилл на фрагменты с помощью ультразвука).
3.Детекция амилоидных фибрилл, окрашенных амилоидным красителем Конго красным или Тиофлавином Т, с помощью флуорометрии.
В результате многократного повторения циклов фрагментации и инкубации фибрилл произойдёт рост количества агрегированного белка Aβ42. Таким образом, количество агрегатов станет достаточным для определения общепринятыми аналитическими методами, такими как окраска Конго красным или изменение флуоресценции тиофлавина-Т, а количество циклов амплификации, необходимое для наработки детектируемых количеств агрегированного белка, позволит судить об исходной концентрации агрегатов в исследуемом образце.
Известно, что при болезни Альцгеймера меняется соотношение Aβ42 (патогенная агрегирующая форма) и Aβ42 (менее патогенная форма) в крови. Этот результат, позволяет ставить задачу неинвазивной детекции мультимеров Aβ42 с помощью метода РМСА.
Ранее нами, при использовании дрожжевой тест-системы, были обнаружены варианты последовательности пептида, высокогомологичного Aβ42, но склонного не к спонтанному (как природный пептид), а только к индуцированному уже сформировавшимися фибриллами природного Aβ42 фибриллогенезу. Разрабатываемы ранее в других лабораториях системы детекции малых количеств амилоидоподобных фибрилл в биологическом материале от пациента, действующие на основе циклической амплификации конформации, не могли быть использованы для ранней неинвазивной диагностики болезни Альцгеймера из-за уже упоминавшейся склонности природного Aβ42 к спонтанному амилоидогенезу. Поэтому обнаруженные нами уникальные варианты последовательности Aβ42 с пониженной спонтанной амилоидогенностью будут применены при разработке теста для выявления малых количеств фибрилл.

В ходе проекта планируется исследовать возможность использования ранее обнаруженных участков рекомбинации гена в качестве прогностического признака развития или стадии болезни Альцгеймера. Будут использоваться методы, доступные большинству клинических лабораторий, такие как ПЦР в реальном времени, секвенирование. Для проведения исследования будут использованы образцы от пациентов с поставленным диагнозом болезни Альцгеймера и контрольной группы (люди старшего возраста без каких-либо признаков болезни Альцгемера). Образцы могут быть различных типов: венозная кровь, ликвор. Образцы крови от пациентов с БА и контроль были собраны ранее и хранятся в РЦ «Биобанк» Научного парка СПбГУ.

Для анализа наличия амилоидов в образцах мочи пациентов с системными амилоидозами (AL и AA), будут образцы мочи, предоставленные Научно-исследовательским институтом нефрологии Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова.
Для подтверждения и уточнения диагноза преэклампсия, а также для анализа на присутствие амилоидов в образцах мочи у пациентов с диагностированными системными амилоидозами в работе будет использован тест CRD (Congo Red Dot) в соответствии с методикой, описанной ранее для детекции амилоидов в моче у женщин с патологией преэклампсия [см. Ирина Бухимчи и Герасимова]. Данный тест позволяет выявлять присутствие амилоида в моче по связыванию с красителем Конго красный.

Общий план работы на весь срок выполнения проекта.

Задача 1. Идентификация и характеристика новых амилоидных белков и пептидов.
- (2025 г.) Оценка амилоидогенного потенциала белков in silico, отбор кандидатов в амилоиды.
- (2025-2026 г.) Анализ амилоидогенного потенциала белков при помощи дрожжевой тест-системы.
- (2025-2027 г.) Оценка амилоидных свойств белков, выявленных в дрожжах, при помощи биохимических и цитологических методов.
- (2025-2027 г.) Оценка амилоидогенного потенциала кандидатов в амилоиды, выявленных ранее, в ходе скрининга библиотеки плазмид, содержащих кДНК человека.
- (2026) Конструирование плазмид, кодирующих амилоидогенные белки человека, для экспрессии в клетках и E. coli (в системе C-DAG).
- (2026-2027 г.) Анализ амилоидных свойств белков-кандидатов in vitro/в системе C-DAG.
- (2026-2027 г.) Анализ амилоидных свойств белков при помощи методов электронной микроскопии.
- (2026-2027 гг.) Анализ амилоидных свойств наиболее интересных белков-кандидатов, в клетках и/или тканях человека.

Задача 2. Исследование взаимосвязи между процессами, контролирующими амилоидогенез и стабильность генома.
- (2025-2027 г.) Анализ взаимосвязи между процессами, контролирующими амилоидогенез и стабильность генома, на модели приона [PSI+] у дрожжей S. cerevisiae.

Задача 3. Изучение механизмов влияния цис- и трансдействующих факторов на склонность белков к амилоидной агрегации.
- (2025-2027 г.) Исследование влияния цис- и трансдействующих факторов таких как мутации и шапероны на склонность белков к амилоидной агрегации на модели дрожжевого белка Sup35.

Задачи 4. Изучение механизмов, лежащих в основе фазовой сепарации белков.
(2025-2027) Изучение механизмов, лежащих в основе фазовой сепарации белков на модели дрожжевого белка Sup35.
(2025) Поиск in silico белков способных к формированию биоконденсатов в клетках дрожжей.
(2026-2027) Экспериментальная проверка отобранных кандидатов в дрожжевой модели
(2026) Проверка гипотезы о связи фазовой сепарации белков с амилоидогенезом.

Задача 5. Разработка новых подходов для неинвазивной генетической и биохимической диагностики и (в перспективе) терапии амилоидозов человека и животных.

- (2025 г.) Получение конструкций для наработки различных вариантов пептида Aβ42 человека в клетках бактерии E. coli.
- (2025 г.) Подбор условия для выделения и очистки препаративных количеств различных вариантов рекомбинантного пептида Aβ42 человека из клеток E. coli.
- (2026 г) Оценка скорости и lag-фазы для агрегации различных вариантов рекомбинантного пептида Aβ42. Параметры будут рассчитаны на основании данных об изменении флуоресценции тиофлавина Т в пробах.
- (2026 г.) Оптимизация условий для циклической амплификации исчезающе малых количеств пептида Aβ42 человека. В качестве затравки для амилоидной агрегации будут использованы агрегаты пептида wtAβ42 полученные из синтезированного пептида.
- (2027 г.) Подбор условий для циклической амплификации пептида Aβ42 человека полученных из крови пациентов с болезнью Альцгеймера. Биоматериал будет взят из коллекции РЦ «Центр Биобанк» Научного парка СПбГУ, собранной ранее. Для проведения исследования будут использованы образцы от пациентов с поставленным диагнозом болезни Альцгеймера и контрольной группы (люди старшего возраста без каких-либо признаков болезни Альцгемера).
- (2025 г) Оценка специфичности связывания амилоид-специфичного красителя Конго красного с белковыми компонентами в образцах мочи больных амилоидозом в сравнении другими образцами в коллекции.
- (2026-2027 г) Масс-спектрометрический анализ детергент-устойчивых агрегатов, выделенных из образцов мочи в коллекции, сопоставить полученные профили белков с клиническими данными и оценить специфичность и чувствительность данного подхода в диагностике
- (2026 г) Оценка возможность использования ранее обнаруженных участков рекомбинации гена в качестве прогностического признака развития или стадии болезни Альцгеймера.
- (2026-2027 г) Разработка ДНК-наносенсоров, которые позволят выявлять мутации, ассоциированных с социально-значимыми амилоидозами.

4.3.7.7. Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту
- Разработана методика протеомного скрининга амилоидов. Методика позволяет выявлять агрегаты детергент-устойчивых белков в клетках, тканях и органах различных организмов, включая человека.
- Предложен оптимизированный протокол для поиска и идентификации амилоидных белков.
- Разработан метод оценки эффектов биологических факторов и химических соединений на амилоиды в культуре клеток нейробластомы человека. Модель может быть использована для последующей оценки эффектов действия белков и химических соединений, выявленных в ходе скрининга с использованием дрожжевой тест-системы.
- Разработана оригинальная дрожжевая тест-система, позволяющая проводить оценку амилоидогенного потенциала белков. Тест-система позволяет оценивать амилоидогенный потенциал как отдельных белков-кандидатов, так и проводить масштабные скрининги в пределах протеомов.
- Используя дрожжевую тест-систему были подтверждены амилоидные свойства известных амилоидных белков, а также выявлено более 30 ранее неизвестные амилоидогенных белков человека.
- Установлено, что белок человека RAD51, играющий ключевую роль в гомологичной рекомбинации ДНК при репарации двухцепочечных разрывов, формирует амилоидные фибриллы in vitro, а также амилоидоподобные структуры in vivo в некоторых типах раковых клеток.
- Продемонстрировано, что РНК-связывающий белок FXR1 образует SDS-резистентные амилоидоподобные агрегаты в мозге амфибий, рептилий и птиц.
- Показано, что основной белок миелина – MBP, функционирует в мозге крысы в амилоидной форме. Выявлена последовательность ответственная за агрегацию MBP. Предложена новая модель структурной организации компактного миелина, в состав которого входят амилоидные фибриллы белка MBP.
- Получены данные о влиянии агрегации изоформ 5 и 6 белка PHC3 на экспрессию ряда генов в клетках человека HEK293T. Выдвинута гипотеза о том, что амилоидогенез белка PHC3 можно рассматривать в качестве фактора, регулирующего укладку хроматина.
- Обнаружено явления «клеточной памяти стресса», определяемой самособирающимися белковыми структурами, и идентифицированы новые белки-шапероны человека, контролирующие процессы болезнетворной агрегации белков.
- Показало, что при сверхпродукции в клеточных культурах белок человека NOS1AP образует устойчивые к детергентам агрегаты неамилоидного типа; выявлены участки, отвечающие за его агрегацию. Продемонстрировано взаимодействие агрегатов NOS1AP с α-синуклеином. Выдвинута гипотеза о том, что NOS1AP может быть вовлечен в развитие синуклеинопатий. Предложена модель объясняющая связь между болезнью Паркинсона и шизофренией.
- Выявлены мутации в пептиде Aβ42, которые ослабляют или усиливают его агрегацию в дрожжевой модели. Полученные результаты хорошо соотносятся с клиническими данными и данными in vitro. Продемонстрировано, что аналогичный подход может быть использован для поиска мутаций, блокирующих или усиливающих агрегацию белка PrP.
- Впервые продемонстрирована возможность физического взаимодействия пептида Aβ42 человека с агрегатами IAPP. Полученные данные свидетельствуют о взаимосвязи диабета 2 типа с развитием болезни Альцгеймера.
- Показан механизм, лежащие в основе передачи приона [PSI+] между дальнеродственными видами дрожжей – S. cerevisiae и O. methanolica.
- Установлено, что M-домен дрожжевого белка Sup35 играет важную роль во взаимодействии с шаперонами на ранних этапах формирования приона [PSI+].
- Установлено, что NM-домены дрожжевого белка Sup35 отвечают на гиперосмотический шок образованием биоконденсатов, которые являются жидкими каплями. Выявлены участки в Sup35, ответственные за формирование биоконденсатов.
- Используя дрожжевую модель показано, что появление амилоидов часто ассоциировано с дестабилизацией генома.
- Разработан вариант теста CRD (Congo Red Dot) для неинвазивной диагностики преэклампсии (патология при беременности), проведена его оптимизация и оценка эффективности.
- Используя метод протеомного скрининга в сочетании с масс-спектрометрией, в образцах мочи пациентов с диагнозом преэклампсия идентифицированы потенциальные амилоидогенные белки.
- Во фракции детергент-устойчивых агрегатов из мочи, пациентов с диагнозом преэклампсия выявлен специфичный для данной группы пептид, который может быть использован в дальнейшем в качестве маркера для диагностики патологии.
- Проведено сравнение белковых профилей образцов мочи и детергент-устойчивых агрегатов, выделенных из них, у пациентов с разными типами нефропатий. Выявлены потенциальные белки, асоциированные с конгофилией мочи.

4.3.7.8. Детальный план работы на первый год выполнения проекта.
Задача 1. Идентификация и характеристика новых амилоидных белков и пептидов.
- Оценка амилоидогенного потенциала белков in silico, отбор кандидатов в амилоиды.
- Конструирование плазмид, кодирующих амилоидогенные белки предсказанные in silico, для экспрессии в клетках дрожжей.
- Анализ амилоидогенного потенциала белков при помощи дрожжевой тест-системы.
- Оценка амилоидных свойств белков, выявленных в дрожжах, при помощи биохимических и цитологических методов.
- Оценка амилоидогенного потенциала кандидатов в амилоиды, выявленных ранее, в ходе скрининга библиотеки плазмид, содержащих кДНК человека.

Задача 2. Исследование взаимосвязи между процессами, контролирующими амилоидогенез и стабильность генома.
- Анализ взаимосвязи между процессами, контролирующими амилоидогенез и стабильность генома, на модели приона [PSI+] у дрожжей S. cerevisiae.

Задача 3. Изучение механизмов влияния цис- и трансдействующих факторов на склонность белков к амилоидной агрегации.
- Исследование влияния цис- и трансдействующих факторов на склонность белков к амилоидной агрегации на модели дрожжевого белка Sup35.

Задача 4.Изучение механизмов, лежащих в основе фазовой сепарации белков.
- Изучение механизмов, лежащих в основе фазовой сепарации белков на модели дрожжевого белка Sup35.
- Поиск in silico белков способных к формированию биоконденсатов в клетках дрожжей.

Задача 5.Разработка новых подходов для неинвазивной генетической и биохимической диагностики и (в перспективе) терапии амилоидозов человека и животных.
- Получение конструкций для наработки различных вариантов пептида Aβ42 человека в клетках бактерии E. coli.
- Подбор условия для выделения и очистки препаративных количеств различных вариантов рекомбинантного пептида Aβ42 человека из клеток E. coli.
- Оценка специфичности связывания амилоид-специфичного красителя Конго красного с белковыми компонентами в образцах мочи больных амилоидозом в сравнении другими образцами в коллекции.

4.3.7.9. Ожидаемые научные и (или) научно-технические результаты и их научная новизна и значимость
Ожидаемые результаты за период с 2025 по 2027 гг:
- Будут выявлены и охарактеризованы новые амилоиды и амилоидоподобные белки у различных эукариотических организмов, включая человека.
- Будут получены данные о влиянии цис и трансдействующих факторов на способность белков к агрегации и прионной передаче.
- Будет создана тест-система для выявления факторов, способнных модифицировать специфическую и неспецифическую активность редактирующих комплексов на основе CRISPR/Cas9.
- Будут получены данные, которые позволят установить причинно-следственную связь между возникновением мутаций и амилоидных агрегатов.
- Будет проведена оценка амилоидогенного потенциала целого ряда транскрипционных факторов, участвующих в онкогенезе.
- На модели дрожжей будут получены данные о механизмах, лежащих в основе фазовой сепарацию белков.
- Будут получены экспериментальные данные о способности белков предсказанных in silico к фазовой сепарации.
- Будет осуществлена разработка новых подходов к неинвазивной генетической и биохимической диагностики амилоидозов, включая болезнь Альцгеймера.
- Будут разработаны ДНК-наносенсоры, которые позволят выявлять мутации, ассоциированных с социально-значимыми амилоидозами.
- Будет исследована возможность использования ранее обнаруженных участков рекомбинации в качестве прогностического признака развития или стадии болезни Альцгеймера.
Таким образом будут описаны и охарактеризованы новые амилоидогенные белки и пептиды, также выявлены последовательности, отвечающие за формирование амилоидов. Будут получены данные об эффективности предсказаний амилоидогенного потенциала белков, выполненных различными биоинформатическими алгоритмами. Кроме того, впервые амилоидогенные свойства целого ряда белков, предсказанные бионформатическими подходами, будут проверены in vivo. Будут выявлены цис- и трансдействующие факторы, влияющие на склонность белков к амилоидной агрегации. Будут получены представления о связи механизмов, фазовой сепарацию белков с механизмами формирования амилоидов, полученные результаты позволят также выявить возможную связь между стрессовыми воздействиями и механизмами амилоидогенез. Полученные в ходе проекта данные позволят оценить взаимосвязь между амилоидогенезом и онкогенезом. Используя задел, полученный в ходе предыдущих исследований, в том числе оптимизированный нами тест на окрашивание амилоидо-подобных белков мочи Конго красным (CRD тест) планируется разработать диагностические тесты для неинвазивной диагностики ренальных амилоидозов. Будет осуществлена попытка разработать новые высокочувствительные подходы для диагностики болезни Альцгеймера основанные на детекции агрегатов пептида Aβ в биологических жидкостях, что позволит осуществлять диагностику болезни Альцгеймера до появления клинических симптомов. Для решения данной задачи впервые будут использованы рекомбинантые варианты пептитда Aβ, содержащие мутации, выявленные нами ранее в ходе скрининга в дрожжевой модели. В рамках данного проекта планируется провести экспериментальную верификацию ранее выявленных in silico участков рекомбинации в качестве потенциального прогностического маркера для диагностики стадий развития болезни Альцгеймера.
Полученные в ходе проекта результаты позволят лучше понять механизмы, лежащие в основе амилоидогенеза и прионогенеза белков; выявленные новые амилоиды у различных организмов позволят получить представление о белках, обладающих амилоидогенным потенциалом в пределах протеома человека и других эукариотических организмов. Выявление роли амилоидов в нормальных процессах жизнедеятельности откроет новые пути к регуляции этих процессов с целью улучшения здоровья человека. Выявленные в работе биомаркеры амилоидозов позволят осуществлять их диагностику на самых ранних доклинических стадиях, это позволит растянуть период развития симптомов заболеваний, осуществить профилактику болезней и в перспективе начать их лечение на ранних стадиях, когда ещё нет критических повреждений тканей и органов.
Полученные в ходе выполнения проекта работе результаты будут соответствовать мировому уровню.

4.3.7.10. Планируемый объем дополнительно привлеченных средств из внешних
по отношению к СПбГУ источников за весь период выполнения проекта.
Планируется дополнительно привлечь средства из внешних по отношению к СПбГУ источников в размере 35 млн. рублей за весь период выполнения проекта. Из них не менее 1 млн рублей – средства партнёра ООО «Вет Ген». 34 млн рублей, планируется привлечь за счёт грантов на выполнение научных исследований.