Следовые амины (СА) присутствуют в центральной нервной системе (ЦНС) позвоночных в очень низких концентрациях - в несколько сотен раз ниже, чем концентрации классических биогенных аминов, таких как дофамин и серотонин1,2. В 2001 году две независимые исследовательские группы3,4 сообщили о клонировании и идентификации нового семейства аминергических рецепторов, связанных с G-белком (GPCR) млекопитающих, которые позже были переименованы в рецепторы к следовым аминам «Trace Amine-Associated Receptors (TAAR)» 5. Есть данные, указывающие на то, что СА и TAAR участвуют в нейромодуляции, регуляции метаболизма и по-разному влияют на различные системы, включая ЦНС6–9. Однако до недавнего времени все TAAR, за исключением TAAR1, обычно рассматривались только как обонятельные рецепторы, участвующие в обнаружении естесвенных запахов.
На сегодняшний день роль СА и TAAR в регуляции сенсомоторных функций мало изучена. Несколько отчетов показали, что СА могут влиять на нейронные сети спинного мозга, ответственные за рефлекторную и двигательную активность10–14. Что касается TAAR, TAAR1 является наиболее изученным рецептором, но его участие в регуляции двигательной активности исследовалось в основном с точки зрения взаимодействия с психостимулирующими препаратами, такими как кокаин и амфетамин15,16. Сообщалось также, что введение агониста TAAR1 индуцирует ритмическую двигательную активность задних конечностей у спинального животного13. мРНК TAAR1 была обнаружена в структурах, участвующих в сенсомоторном контроле, таких как продолговатый мозг, мозжечок, гиппокамп, базальные ганглии и спинной мозг3. Функции других TAAR менее изучены, но было обнаружено, что некоторые из них, включая TAAR5, потенциально также могут участвовать в моторном контроле, так как была показана локализация TAAR5 в спинном мозге новорожденных крыс13. Наше недавнее исследование выявило распределение TAAR5 в гиппокампе, миндалевидном теле и других лимбических структурах 17, а также увеличение исследовательской локомоторной активности мышей с нокаутом гена, кодирующего TAAR5 (мыши TAAR5-KO). В настоящем исследовании мы провели тестирование мышей TAAR5-KO в серии поведенческих, электрофизиологических и гистохимических экспериментов, чтобы оценить роль рецепторов TAAR5 в различных аспектах сенсомоторного поведения.

1.Общая методология
Поведенческое тестирование и регистрация электрофизиологических сигналов были выполнены на взрослых самцах мышей, в то время как гистохимические эксперименты проводились на взрослых мышах обоих полов. Мыши TAAR5-KO, экспрессирующие β-галактозидазу, что отображает экспрессию TAAR5, были получены Deltagen Incorporation (Сан-Матео, Калифорния, США) и распространены NIH Knockout Mouse Project (KOMP). Селекцию и генотипирование мышей TAAR5-KO и мышей дикого типа (WT) проводили, как описано ранее17. Все процедуры, касающиеся животных и ухода за ними, были одобрены этическим комитетом Санкт-Петербургского государственного университета, Санкт-Петербург, Россия (номер разрешения 131-03-4 и 131-03-5) и проводились в соответствии с законодательством Российской Федерации согласно стандартам надлежащей лабораторной практики (директива № 267 Минздрава РФ от 19.06.2003), а также в соответствии с директивами ARRIVE.
Мышей содержали по 3-5 на клетку до операции и по отдельности после хирургической операции. Поддерживались стандартные лабораторные условия (12-часовой цикл свет / темнота, 21 ± 1 ° C и влажность 40–70%), пища и вода предоставлялись ad libitum. Все эксперименты проводились во время световой фазы. Одни и те же животные использовалась в вертикальной и горизонтальной лестницах, в то время как статический стержень и вестибулярная стимуляция выполнялись на другой группе, остальные эксперименты проводились на отдельных группах животных. Общее количество животных, использованных в исследовании: 39 TAAR5-KO и 38 WT (возраст 3-6 месяцев).

2.Изучение распределения TAAR5 в головном мозге
Локализацию TAAR5 анализировали с использованием встроенного гена репортерного белка LacZ (Рис. 1а). Все процедуры для маркировки и визуализации LacZ были описаны ранее17,27. Вкратце, после предварительной анестезии изофлураном с последующей глубокой анестезией уретаном 2 г/кг проводили декапитацию (TAAR5-KO n = 5, WT n = 5). Затем мозг извлекали из черепа, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) 3 раза и немедленно фиксировали в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA). Фронтальные и сагиттальные срезы (40 мкм) готовили на микротоме Leica CM-3050S (Wetzlar, Германия). Для окрашивания LacZ использовали как свободно плавающие, так и прикрепленные срезы. Срезы промывали 0,02% NP40 (Sigma, ab142227) и 2 мМ хлорида магния в PBS, а затем инкубировали в течение ночи в окрашивающем растворе, содержащем 1 мг/мл X-gal (5-бром-4-хлор-3-индолил β- D-галактопиранозид, Sigma, B4252), 5 мМ ферри- (K3Fe (CN) 6, Sigma, 244023), 5 мМ ферроцианид (K4Fe (CN) 6, Sigma, 455989) и 2 мМ MgCl2 при + 37 °C. Срезы покрывали DPX (Sigma-Aldrich), а затем анализировали с помощью микроскопа Olympus BX51 (Olympus Corporation, Япония). Клетки, меченные LacZ, окрашивались в синий цвет.

3.Биоинформатика: анализ экспрессии генов
Транскриптомные данные RNA-seq были получены из репозитория GEO (Gene Expression Omnibus)53. Сначала в браузере GEO, доступном на https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/browse/, был произведен поиск термина «мозжечок». В обзор были включены наборы данных, если они соответствовали критериям включения: (1) не менее 30 миллионов чтений в файле SRA для всех выборок в наборе данных; (2) доступность набора данных на платформе GEO RNA-seq Experiments Interactive Navigator (GREIN, доступно по адресу: http://www.ilincs.org/apps/grein/?gse=)54.
После исключения всех неподходящих наборов данных в анализ были включены наборы данных GSE114062, GSE165105, GSE84208, GSE67556, GSE143671, GSE83465 и GSE79929 мозжечка мыши и наборы данных GSE68559 мозжечка человека. Все наборы данных RNA-seq были проанализированы онлайн-платформой GREIN54. Экспрессия TAAR5 считалась положительной, если по крайней мере 10 считываний на образец были идентифицированы как фрагменты мРНК TAAR5, затем данные были нормализованы по CPM и оценивалась дифференциальная экспрессия гена. Исходные значения P были скорректированы для множественного тестирования с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга, и только скорректированные значения P (Padj) выше 0,05 считались значимыми.

4.Анализ экспрессии мРНК TAAR5 методом qPCR
Ткани 3 животных обоих генотипов препарировали на льду, замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C.
Выделение РНК из ствола мозга и мозжечка выполняли с использованием набора для очистки РНК GeneJet (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. РНК элюировали водой, свободной от РНКазы, и хранили при -80 °C до использования. Концентрацию РНК определяли количественно с помощью спектрофотометрии (NanoDrop, München, Германия). Для удаления любой оставшейся геномной ДНК для образцов РНК использовали набор TURBO DNA-free (Thermo Scientific). 1 мкг РНК (ствол мозга) и 0,6 мкг (мозжечок) брали для синтеза кДНК с использованием обратной транскриптазы Revertaid (Thermo Scientific). Вкратце, обратная транскриптаза и реакционная смесь, содержащая 1 мкМ случайных гексамерных праймеров, были добавлены к РНК, обработанной ДНКазой, и подвергнуты следующему протоколу: отжиг при 25 °C в течение 10 минут, транскрипция при 42 °C в течение 90 минут и терминация при 70 °C в течение 10 минут. Образцы кДНК хранили при -20 °C. Для количественной ПЦР (qPCR) использовали 1 мкл кДНК. В качестве контроля для успешного удаления геномной ДНК каждый образец подвергали одинаковой обработке, за исключением того, что не добавляли обратную транскриптазу (RT - контроль). Экспрессию генов оценивали с помощью qPCR. Реакции проводили с использованием qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) при следующих условиях: 95 ° C в течение 5 минут, затем 35 циклов при 95 ° C в течение 20 секунд, 60 ° C в течение 20 секунд и 72 °C в течение 30 секунд.
Праймеры были разработаны для обнаружения TAAR5 мыши (mTAAR5_F1: 5'- 5-ttctgctaccaggtgaatgggt-3 ', mTAAR5_R1: 5'-gccagatagatgacgacctgga -3') и были протестированы на специфическую целевую амплификацию в образце по сравнению с RT-контролем с использованием анализа кривой плавления (от 55 до 95 ° C) и электрофореза в 2% агарозном геле. Ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) (праймеры: mGAPDH_F2: 5’-ttgatggcaacaatctccac -3 ’, mGAPDH_R2: 5’-cgtcccgtagacaaaatggt -3’), который является геном домашнего хозяйства, был включен в качестве внутреннего контроля.

5.Поведенческое тестирование
Rotarod (Рис. 2а) используется для оценки координации движений и равновесия, а также выносливости животного22,52. Перед тестированием мышей предварительно тренировали удерживаться на вращающемся барабане (диаметр 40 мм, Neurobotics, Россия) в течение трех дней (24 об/мин, 1 минута, 3 повтора с перерывом не менее 2 минут между повторами) чтобы адаптировать к устройству и условиям проведения теста. Во время тестирования использовался протокол с ускорением: ступенчатое увеличение скорости с 10 до 30 об/мин (каждые 5 секунд на 5 об/мин), далее поддерживали скорость 30 об/мин (весь тест длился 5 минут). Время падения с барабана ротарода регистрировалось для каждой мыши. Тест был проведен на двух группах мышей: TAAR5-KO (n = 7), WT (n = 5).
Вертикальная лестница (Рис. 2b) позволяет оценить мышечную силу и выносливость мыши и является более простой модификацией теста с вертикальной сеткой55 и представляет собой лестницу высотой 50 см, углом наклона 90° и металлическими перекладинами (диаметром 3 мм), расположенными на расстоянии 1 см друг от друга. Наверху лестницы располагалась пластиковая непрозрачная коробка в качестве укрытия. Мышь помещали на нижнюю перекладину и фиксировали время, необходимое для подъема до укрытия, также регистрировалось количество ошибок (шагов мимо перекладины). Тест проводился с 2 повторениями с интервалом в одну минуту. Тест был проведен на двух группах мышей: TAAR5-KO (n = 13), WT (n = 13).
Статический стержень и Вестибулярная стимуляция. Кроме того, мы оценивали моторную координацию и способность поддерживать равновесие 22,23. Рейка длиной 100 см с одной стороны закреплялась на высоте 80 см параллельно полу. Со стороны закрепленного конца рейки располагалась пластиковая коробка в качестве укрытия для мышей. На расстоянии 10 см от входа в коробку на рейке была сделана метка, обозначающая «точку финиша». Мышей помещали на незакрепленный конец рейки носом в сторону укрытия. Регистрировалось время, необходимое мыши для прохождения рейки до точки финиша (Рис. 3а). Чтобы оценить возможное нарушение вестибулярного контроля, использовали Вестибулярную стимуляцию, после которой повторяли тест Статического стержня (Рис. 3b )32. Для вестибулярной стимуляции мышь помещали в маленький непрозрачный бокс, закрепленный на ротаторе. Для нарушения вестибулярных функций использовали вращение по часовой стрелке с частотой 3 Гц в течение 25 с. После окончания вращения мышь немедленно помещали на рейку и измеряли время, необходимое на прохождение рейки (от конца вращения до пересечения «точки финиша»). Для обоих тестов количество правильных шагов и количество соскальзываний для каждой конечности подсчитывалось отдельно, затем полученные результаты суммировались для всех 4 конечностей. Количество соскальзываний конечностей с рейки выражалось в виде процента от общего количества шагов для всех конечностей. Тесты были выполнены на двух группах мышей: TAAR5-KO (n = 6), WT (n = 6).
Нерегулярная горизонтальная лестница с перекладинами, расстояние между которыми варьирует (Рис. 4а), использовалась для оценки сложной сенсомоторной координации и сложной координации передних и задних конечностей, что требуюет особого внимания и концентрации. Установка состояла из перекладин из нержавеющей стали (диаметром 3 мм), которые располагались между стенками из прозрачного поликарбоната. Боковые стены были 50 см в длину и 21 см в высоту. Перекладины располагались так, чтобы мышь не доставала до поверхности, на которой закреплена установка. Тест повторялся 3 раза, но перед каждым повтором менялась конфигурация расположения перекладин, чтобы предотвратить запоминание их положения. Подсчитывались правильные шаги и полные промахи (шаг мимо перекладины) каждой из четырех конечностей. За полный промах был принят шаг, при котором конечность не попадала на перекладину, что приводило к нарушению равновесия и позы тела. Отдельно для каждой конечности были проанализированы 15-20 шагов, и результаты были представлены как процент полных промах от общего количества. Тест был проведен на двух группах мышей: TAAR5-KO (n = 13), WT (n = 12).
Все поведенческие тесты проводились с видеозаписью и анализировались после экспериментов. Все полученные количественные данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. Для нормально распределенных данных использовали t-критерий Стьюдента (критерий Шапиро-Уилка для проверки на нормальное распределение), для остальных данных - U-критерий Манна-Уитни.

6.Электрофизиологические исследования в хроническом эксперименте
Операционные процедуры. Использовались электроды двух типов: эпидурально расположенные винты для записи электрокортикограммы (ЭКоГ) (диаметр 0,5 мм; длина 1 мм; сталь) и интрацеребральные глубинные электроды для регистрации локального полевого потенциала (LFP) (вольфрамовая проволока в перфторалкоксидной полимерной изоляции (795500, AM Systems), диаметр 50 мкм; длина 1,2 мм/3,2 мм). Каждому животному имплантировали три электрода под общей анестезией (золетил 200 мг/кг внутрибрюшинно; ксилазин 0,2 мг/кг внутримышечно): расположенный эпидурально референсный электрод (+2 мм AP от брегмы и 1 мм латерально); расположенный эпидурально электрод для регистрации сигналов моторной коры (еМ) (+1 мм AP от брегмы и 1 мм латерально); стриарный (eCP) интрацеребральный глубинный электрод (длиной 3,2 мм, - 0,5 мм AP от брегмы и 2,5 мм латерально) 21 (Рис. 5a, b). Электроды размещали с помощью микроманипулятора в стереотаксической раме и фиксировали на черепе стоматологическим цементом («Акродент», ООО «Стома», Украина). Эксперименты проводились не ранее чем через три дня после имплантации.
Регистрация ЭКоГ и LFP. Экспериментальная установка для электрофизиологической регистрации состояла из усилителя (усиление x1000, USF-8; Beta Telecom), аналого-цифрового преобразователя L-791 (L-CARD,) и программного обеспечения Bioactivity Recorder v5.44 (Д.А. Сибаров, Биотехнологии). Для регистрации сигналов животное помещали в бокс из оргстекла 20x20x25 см, который находился изолированной заземленной камере вместе с усилителем. Сигнал подвергался полосовой фильтрации от 0,1 до 200 Гц и оцифровывался с частотой 2500 sps на канал. Электрическую активность в группах TAAR5-KO и WT регистрировали в течение 20 минут у бодрствующих мышей в свободном поведении, адаптированных к экспериментальным условиям и боксу, не демонстрирующих заметных различий в поведении между генотипами. Серию из трех опытов проводили на каждом животном не чаще, чем один раз в двое суток. В анализ были включены только те участки записи (эпохи), когда животные демонстрировали сходное поведение. Выбранные эпохи использовали для сравнения спектральных характеристик электрофизиологической активности мышей TAAR5-KO и WT.
Анализ данных. Используя программное обеспечение Bioactivity Recorder, из каждой записи выбирали 12 эпох без артефактов длительностью 20 секунд, затем выполняли преобразование Фурье с использованием программного обеспечения Clampfit 10.2.0.16 (MDS Analytical Technologies). Полученные спектры мощности (частота в Гц, спектральная плотность мощности в мкВ2) мышей WT сравнивали со спектрами мышей TAAR5-KO. В анализе использовались данные в диапазоне 0,9-20 Гц, так как данные в диапазоне 0-0,9 были исключены из-за обилия артефактов. Анализ проводился после нормализации путем преобразования всех значений из одного набора данных в проценты от суммы всех значений спектров мощности. Все данные были проверены на нормальность распределения критерием нормальности Шапиро-Уилка и проанализированы с помощью двустороннего дисперсионного анализа (two-way ANOVA) c последующим апостериорным множественным тестом Сидака. Статистическая обработка выполнена в GraphPad Prism 9.0.2. (GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка (SEM).
Электрофизиологические исследования были проведены на двух группах животных: мышах TAAR5-KO (n = 5) и WT (n = 6).

7.Локализация LacZ у мышей TAAR5-KO в мозжечке и вестибулярных ядрах
Для исследования физиологической роли TAAR5 in vivo были созданы генетически модифицированные по целевому гену мыши путем замены оснований от 1 до 320 кодирующих последовательности гена Taar5 на последовательность, кодирующую LacZ (β-галактозидазу) 17 (Рис. 1a). Таким образом, гистохимическое окрашивание LacZ тканей TAAR5-мутантных мышей позволяет анализировать паттерн экспрессии TAAR5.
Во-первых, мы обнаружили отдельное специфическое окрашивание LacZ некоторых моторных областей головного мозга (Рис. 1b-d). Четкая метка LacZ на месте экспрессии TAAR5 была обнаружена в мозжечке (Рис. 1b, c) у всех проанализированных мышей TAAR5-KO. Были зарегистрированы ярко-синие окрашенные клетки с большими круглыми профилями сомы (382,93 ± 127,1 мкм2), соответствующие клеткам Пуркинье 18. Окрашивание LacZ в мозжечке наблюдали по всей доле, и его рисунок не похож на окрашивание полосами в случае использования метки к zebrin19. Далее мы исследовали распределение LacZ в области мозга, связанной с вестибулярным контролем. Плотно упакованные крупные сомы округлой или овальной формы наблюдались в вестибулярном комплексе (Рис. 1b, d), в основном в медиальном вестибулярном ядре (средняя площадь поперечного сечения 388,85 ± 49,81 мкм2). И форма, и размер меченых клеток соответствуют нейронам вестибулярных ядер 20.

Рис. 1 TAAR5 экспрессируется в мозжечке и медиальных вестибулярных ядрах мыши. a. Мыши TAAR5-KO получены с использованием гомологичной рекомбинации, приводящей к инактивации гена TAAR5 с помощью замещающего вектора. Целевой ген выравнивается с вектором-мишенью, содержащим последовательность, кодирующую LacZ17; b. Схема мозга мыши в сагиттальной плоскости (модифицированна из Paxinos and Franklin the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 200121). c. Окрашенные LacZ нейрональные профили слоя клеток Пуркинье мозжечка (CBX) мышей дикого типа и TAAR5-KO. Пунктирная область - увеличенное изображение клеток Пуркинье. Калибровочный маркер - 100 мкм. d. Окрашенные LacZ нейрональные профили медиальных вестибулярных ядер (MVN) мышей дикого типа и TAAR5-KO. Пунктирная область - увеличенное изображение окращенных клеток. Калибровочный маркер 10 мкм. e. Анализ обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) экспрессии мРНК TAAR5 в мозжечке и стволе мозга мышей дикого типа и TAAR5-KO. ACB — nucleus accumbens, CBX — cerebellum, CN — cerebellum nuclei, CP — caudate-putamen, CTX — cortex, HP — hippocampus, HY — hypothalamus, IC-inferior colliculus, LR4V — lateral recess of 4th ventricle, LV — lateral ventricle, MB — midbrain, MVN — medial vestibular nuclei, MY — medulla, P — pons, SC — superior colliculus, SN —substantia nigra, TH — thalamus.
8.Транскриптомный анализ экспрессии TAAR5 в общедоступных данных RNA-seq
Чтобы дополнительно подтвердить экспрессию TAAR5 в мозжечке, мы выполнили транскриптомный анализ общедоступных данных RNA-seq. Среди проанализированных наборов данных три набора данных GEO мышей включают TAAR5-положительные образцы мозжечка мышей. В наборах данных GSE143671 и GSE83465 экспрессия TAAR5 представлена в мозжечке мышей на стадиях развития P2 (в 50% образцов) и P4 (во всех образцах), соответственно. TAAR5 также экспрессируется во всех образцах мозжечка от мышей P8 в наборе данных GSE67556, но в том же наборе данных его экспрессия была значительно снижена у мышей P60 по сравнению с мышами P8 (P adj = 5.809e -11), и мРНК TAAR5 обнаружима только в 50образцов % (12 из 24) мозжечка в этой группе.
Экспрессия TAAR5 не была обнаружена в наборах данных GSE114062 (7-недельные мыши), GSE165105 (15-месячные мыши), GSE84208 (7-недельные мыши) или GSE79929 (3-недельные мыши), возможно это связано с более низким уровнем экспрессии TAAR5 у мышей в подростковом и взрослом возрасте по сравнению с животными в раннем онтогенезе или недостаточной глубиной RNA-seq для обнаружения мРНК TAAR5 в этих группах. Фактически, в наборе данных GSE67556, который состоит из более глубоких данных RNA-seq по сравнению с другими наборами данных GEO, включенными в анализ (например, GSE67556 было 200 миллионов считываний на образец по сравнению с 30–70 миллионами считываний на образец в других наборах данных), TAAR5 экспрессия была обнаружена не только у мышей P8, но и у мышей P60.
Анализ паттерна экспрессии TAAR5 в мозжечке взрослого человека, представленный в наборе данных GSE68559, подтверждает это соображение. Этот набор данных включает образцы мозжечка со значительно различающейся глубиной RNA-seq в диапазоне от 8,8 до 165 миллионов считываний на образец. Экспрессия мРНК TAAR5 положительна в 4 из 10 образцов мозжечка в GSE68559. Все TAAR5-положительные образцы секвенированы на глубину 60 миллионов считываний или выше. Не было обнаружено данных для проведения аналогичного транскриптомного анализа экспрессии в вестибулярных ядрах.

9.Анализ экспрессии мРНК TAAR5 методом qPCR в мозжечке и стволе мозга мышей

Для подтверждения экспрессии мРНК TAAR5 в мозжечке и стволе мозга мышей был проведен анализ RT-qPCR. Специфичность сконструированных праймеров подтверждали с помощью PCR с плазмидой, несущей последовательность мышиного TAAR5. Его пригодность для RT-qPCR TAAR5 была подтверждена путем проведения PCR с кДНК в качестве образца, полученной из обонятельного эпителия мыши, который, как известно, экспрессирует TAAR5,
Анализ экспрессии мРНК TAAR5 с помощью qPCR проводили в образцах мозжечка и ствола мозга (который включает вестибулярные ядра) от животных WT и TAAR5-KO (Рис. 1e, SFig. 1). Слабовыраженные, но четко очерченные полосы были обнаружены во всех образцах РНК мозжечка и ствола мозга животных WT. Обнаруженные полосы были заметно слабее, чем полосы для гена домашнего хозяйства, синтезированного на тех же образцах кДНК. Таким образом, видимая разница в интенсивности флуоресценции полосы, по-видимому, связана с относительно более низкой экспрессией TAAR5, а не с повреждением РНК в процессе подготовки образца. Специфичность обнаруженных полос подтверждается отсутствием соответствующих сигналов в тканях, полученных от TAAR5-KO мышей.

10. Особенности двигательного поведения у ТААR5-KO мышей

В первую очередь для оценки моторной координации во время выполнения задания, требующего выносливости был использован Rotarod. Тест проводился с быстрым разгоном в течение первых 30 с, после чего поддерживалась максимальная скорость. TAAR5-KO мыши были способны удерживаться на барабане в течение меньшего времени чем WT мыши (TAAR5-KO: 50,28 ± 2,036 с по сравнению с WT: 76,85 ± 5,632 с, тест Манна-Уитни, P = 0,0025), однако во время ускорения результаты для обеих групп были аналогичны. Парадигма теста с ускорением и последующим поддержанием высокой скорости позволяет разделить результаты, связанные с координацией движений, от результатов, связанных с выносливостью. Полученные данные указывают на более низкую мышечную силу или выносливость у мутантных мышей (Рис. 2а). Чтобы дополнительно оценить сложную моторную координацию и выносливость, мы выполнили несколько дополнительных тестов, в том числе тест с вертикальной лестницей, со статическим стержнем и вестибулярной стимуляцией, а также тест с нерегулярной горизонтальной лестницей.
Тест «Вертикальная лестница» позволяет оценить выносливость и мышечную силу. Нокаутные животные поднимались медленнее, чем мыши дикого типа (TAAR5-KO: 23,98 ± 2,756 с по сравнению с диким животным: 17,01 ± 1,621 с, t-тест, P = 0,0392, t = 2,181, df = 24) (Рис. 2b). Общее количество промахов (шагов мимо перекладин) не различается между генотипами. Эти результаты могут указывать на то, что мыши TAAR5-KO менее выносливы или имеют меньшую мышечную силу, чем мыши дикого типа.


Рис. 2. Поведенческое тестирование мышей TAAR5-KO и WT на моторную координацию, выносливость и мышечную силу. a. Латентный период падения с вращающегося барабана в тесте Rotarod. b. Общее время, необходимое для прохождения Вертикальной лестницы. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, уровень значимости *P < 0.05, ** P < 0.01.
Чтобы оценить моторную координацию и способность поддерживать равновесие, были использованы тесты «Статический стержень» и «тест с Вестибулярной стимуляцией» 22,23. Анализ процента промахов не выявил различий между экспериментальными группами в обоих тестах. Время прохождения рейки в тесте «Статический стержень» (Рис. 3а) было значительно меньше для мышей TAAR5-KO (TAAR5-KO: 5,16 ± 0,59 с по сравнению с диким животным: 7,19 ± 0,56 с, t-тест, P = 0,0451, t = 2,260, df = 11). После вестибулярной стимуляции (Рис. 3b) обе группы мышей тратили больше времени на прохождение рейки, однако мыши TAAR5-KO были значительно быстрее по сравнению с контролем WT (TAAR5-KO: 7,42 ± 0,46 с по сравнению с WT: 11,68 ± 1,74 с, t-тест, P = 0,0391, t = 2,373, df = 10). Таким образом, нокаутные мыши способны лучше поддерживать динамический баланс при прохождении по рейке.

Рис. 3. Поведенческое тестирование мышей TAAR5-KO и WT на моторную координацию на рейке, равновесие и вестибулярный контроль. a. Статический стержень: время, необходимое для прохождения рейки и процент соскальзываний конечностей. b. Вестибулярная стимуляция: время, необходимое для прохождения рейки и процент соскальзываний конечностей после 25 с вращения. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, уровень значимости *P < 0.05.
Для оценки сложной межконечностной координации и динамических сенсомоторных функций в изменчивой среде, требующих особого внимания и концентрации, использовался тест «Нерегулярная горизонтальная лестница» (Рис. 4a,b). Нокаутные мыши совершали меньше промахов (шагов мимо перекладины), чем животные WT (TAAR5-KO: 1,33 ± 0,27% по сравнению с WT: 2,94 ± 0,72%, критерий хи-квадрат, χ2 = 10,02, df = 1, z = 3,166, P = 0,0015), вне зависимости от конечности (передняя или задняя, правая или левая). При этом длительность прохождения лестницы (Рис. 4b) не отличалось (TAAR5-KO: 17,86 ± 1,25 по сравнению с WT: 16,15 ± 1,75, t-тест, н.р.). Это может указывать на лучшую моторную координацию у мышей TAAR5-KO.

Рис. 4. Поведенческое тестирование сложной межконечностной координации, требующей повышенного внимания и концентрации у мышей TAAR5-KO и WT в тесте Нерегулярная горизонтальная лестница. a. Схематичное изображение теста Нерегулярная горизонтальная лестница. b. Процент ошибочных шагов и время прохождение лестницы. Для каждого животного количество ошибок выражено в виде процента от общего количества шагов на лестнице. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего, уровень значимости *P < 0.05, ** P < 0.01.

11.Спектральная плотность мощности ЭКоГ и LFP стриатума у мышей TAAR5-KO по сравнению с мышами WT

Электрокортикограмма моторной области коры (ECoG) и локальные полевые потенциалы (LFP) стриатума были зарегистрированы у мышей TAAR5-KO и WT в свободном поведении во время бедствования (Рис. 5a,b,c) и проанализированы с использованием преобразования Фурье. Спектральная плотность мощности всего диапазона 0,9-20 Гц сравнивалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа two-way ANOVA.
Спектральная плотность мощности сигнала eM (Рис. 5d) была выше у мышей TAAR5-KO (two-way ANOVA, групповой фактор F (1, 17209) = 233,9, P <0,0001). TAAR5-KO и WT показал значительные различия в спектральной плотности мощности между мышами TAAR5-KO и WT в диапазоне частот 4,8-8,5 Гц (P <0,05), что соответствует тета-диапазону (Рис. 5d, серая область).
Анализ LFP стриатума показал значительные различия между TAAR5-KO и мышами WT (two-way ANOVA, групповой фактор F (1, 17292) = 7,340, P = 0,0068) (Рис. 5e). Согласно апостериорному множественному тесту Сидака, значительные различия LFP были обнаружены в диапазоне частот от 0,9 до 3,7 Гц (P <0,05), что соответствует диапазону дельта-ритма (Рис. 5e, серая область).


Рис. 5. ЭКоГ и LFP стриатума. a. Визуализация расположения электродов на черепе. Размерность сетки 1 мм. b,c. Визуализация расположения электродов моторной коры eM (AP +1; ML –1) и стриатума eCP (AP –0.5; ML +2.5) на сагиттальном срезе 1.44 mm латерально от брегмы (модифицировано из Paxinos and Franklin the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 200121). d. Спектральная плотность мощности электрокортикограммы моторной коры (eM). e. Спектральная плотность мощности локальных полевых потенциалов стриатума (eCP). Ось X — частота сигнала в Гц; ось Y — спектральная плотность мощности в % от общей плотности. Бирюзовая и черная линии — спектральная мощность TAAR5-KO и WT мышей, соответственно; точечная линия — стандартная ошибка среднего (SEM). ** — P<0.01; **** — P<0.0001 two-way ANOVA в диапазоне 0,9–20 Гц. Серая зона — достоверные различия по апостериорному множественному тесту Сидака. eM (окружность красного цвета) — эпидурально расположенный винт над областью моторной коры; eCP (круг красного цвета) —интрацеребральный глубинный электрод в области скорлупы и хвостатого ядра (caudate-putamen); ref — референсный электрод (эпидурально распложенный винт), ACB — nucleus accumbens, CP — caudate-putamen, CTX — cortex, GP — globus pallidus, HY — hypothalamus, LSX — Lateral septal complex, MCTX — motor cortex, Pal — pallidum, TH — thalamus.
12.Обсуждение
Классические моноамины (серотонин, дофамин, гистамин и др.) являются важными модуляторами нейронных сетей головного и спинного мозга, которые контролируют сенсомоторные функции24. Следовые амины структурно и функционально близки к классическим моноаминам и могут модулировать их функцию, взаимодействуя со специфическими рецепторами или переносчиками25. Однако роль TAARs, особенно TAAR5, в сенсомоторном контроле остается неизвестной. В данной работе мы исследовали сенсомоторные функции мышей с нокаутом гена, кодирующего рецептор TAAR5.
Ранее при помощи иммуногистохимического окрашивания LacZ у мышей TAAR5-KO нами была показана экспрессию TAAR5 не только в обонятельной системе 26, но также в лимбических областях мозга, обрабатывающих обонятельную информацию17 и нейрогенных зонах 27. В данном исследовании мы расширили эти наблюдения, обнаружив экспрессию LacZ также в отдельных центрах управления моторными функциями ствола мозга и мозжечка. Специфический сигнал мРНК TAAR5 был обнаружен с помощью количественной ПЦР в образцах WT мышей, но не TAAR5-KO, что дополнительно подтверждает экспрессию TAAR5 в мозжечке и стволе мозга. Кроме того, транскриптомный анализ экспрессии TAAR5 в мозжечке мыши выявил низкую экспрессию этого рецептора в нескольких наборах данных. Недавний подробный транскриптомный анализ экспрессии TAAR5 в человеческом мозге также показал повсеместную низкую экспрессию TAAR5 в мозжечке и других областях мозга, включая кортикальные и лимбические области мозга, миндалевидное тело и гиппокамп, прилежащее ядро, таламус, гипоталамус, базальную часть мозга. ганглии, черную субстанцию и белое вещество 28,29. Аналогичные выводы были независимо сделаны в другом исследовании транскриптомного анализа, в котором экспрессия всех TAAR была обнаружена в нескольких областях мозга, включая мозжечок и ствол мозга, при этом TAAR5, по-видимому, имел наивысший уровень экспрессии29. Тем не менее, относительно низкий уровень экспрессии TAAR5 в головном мозге требует дальнейшей проверки с помощью иммуногистохимических и других подходов в будущих исследованиях, когда и если будут доступны селективные антитела и инструменты7.
Такая локализация TAAR5 послужила основанием для тестирования сенсомоторных функций мышей TAAR5-KO в различных поведенческих и электрофизиологических тестах. Во-первых, в тесте Rotarod и тесте с вертикальной лестницей (90 °) у мышей TAAR5-KO наблюдались результаты достоверно хуже, чем у WT, что может быть следствием снижения мышечной силы или выносливости в этой группе. Было показано, что сила мышц может частично зависеть от функции мозжечка и может регулироваться нервными путями мозжечка 30. Вероятной причиной изменений сенсомоторных характеристик, наблюдаемых у животных TAAR5-KO, могут быть изменения в функционировании классических моноаминергических систем 17,27, особенно в гистаминергических проекциях мозжечка. Это предположение подтверждается недавним исследованием, в котором отмечалось, что инъекция гистамина в структуры мозжечка у крыс приводит к улучшению моторной координации и выносливости в тесте Rotarod31. Для оценки этого предположения безусловно необходимы дальнейшие исследования.
Кроме того, в тесте «Статический стержень» мыши TAAR5-KO показали меньшее время прохождения рейки, а моторную координацию и поддержание баланса после вестибулярной стимуляции путем вращения – лучше, по сравнению с контрольными мышами. Мы использовали вестибулярный стимул с короткой продолжительностью и низкой частотой вращения тела мыши, предложенный Tung32, для стимуляции волосковых клеток в полукружных каналах периферического вестибулярного лабиринта (преимущественно горизонтального полукружного канала). Первичные вестибулярные афферентные волокна поступают в ЦНС в определенные области моста и продолговатого мозга, известные как вестибулярный комплекс. Эти ядра также получают и другие сенсорные модальности, например, проприоцептивный вход, а главный тракт, проецирующийся к вестибулярным ядрам, берет свое начало в мозжечке 33. Медиальное вестибулярное ядро (MVN) - самая большая часть вестибулярного комплекса34. Эта структура обрабатывает вестибуло-окулярные и вестибулоспинальные рефлексы путем интеграции входных сигналов от вестибулярных рецепторов и рецепторов шеи и обеспечивает моторный выход к глазодвигательным ядрам и верхнему шейному отделу спинного мозга35. Обе эти части мозга играют ключевую роль в восстановлении контроля над равновесием после вестибулярного нарушения. Основываясь на результатах, показывающих лучшую моторную координацию у TAAR5-KO мышей в тестах «Статический стержень» и после Вестибулярной стимуляции, а также благодаря наличию LacZ метки в MVN, можно предположить, что TAAR5 может участвовать в моноаминергической модуляции, регулирующей баланс и вестибулярный контроль. Дофаминергические проекции MVN еще не были показаны морфологически, но было обнаружено, что это ядро содержит значимое количество дофамина 36. Рецепторы дофамина D2 также были обнаружены в MVN37, и можно предположить, что гистамин и дофамин могут модулировать возбудимость MVN. Считается, что активность вестибулярных ядер находится под контролем тонического торможения, регулируемого дофамином35. В частности, дофамин участвует в регуляции комиссуральных путей между вестибулярными ядрами и статическими рефлексами.
В то же время мы обнаружили, что у мышей TAAR5-KO лучше сложная моторная координация при ходьбе по нерегулярной горизонтальной лестнице (меньше процент ошибок), что требует пространственного внимания. Мы предполагаем, что эти изменения могут быть связаны с модуляцией серотонинергических систем. Недавние исследования показали, что у мышей с нокаутным геном, кодирующим серотониновые рецепторы 5-HT1D, двигательные навыки в тесте «Статический стержень» лучше, чем у WT 38. Эти рецепторы локализованы в стриатуме39, где был обнаружен сниженный уровень серотонина у TAAR5-KO мышей 17.
Зарегистрированы изменения в электрокортикограмме моторной коры и локальных полевых потенциалов стриатума у мышей TAAR5-KO в свободном поведении во время бодрствования. Широко известно, что тета-ритм связан с пространственным вниманием и пространственной памятью, а также со специфическими типами двигательной активности, которые считаются исследовательским поведением40–42. Увеличение спектральной плотности мощности в диапазоне данного ритма наблюдалось в коре головного мозга мышей TAAR5-KO. Считается, что мощность тета-колебаний модулируется серотонинергическими проекциями: например, активация рецепторов 5-HT2c или ингибирование обратного захвата серотонина приводит к подавлению тета-ритма 43,44. Значительное снижение уровня серотонина наблюдалось в гиппокампе мышей TAAR5-KO17. Такой нейромедиаторный дисбаланс может привести к увеличению мощности тета-ритма, поскольку тета-колебания, регистрируемые над моторной корой головного мозга, генерируются по всей видимости гиппокампом 45. Мы также наблюдали уменьшение спектральной плотности мощности дельта- ритма в стриатуме. Хотя дельта-колебания часто наблюдаются во время сна и под наркозом, также известно, что они коррелируют с некоторыми когнитивными процессами, такими как мотивация, внимание и концентрация46,47, которые важны для координации движений и способности сохранять равновесие. Дельта-ритм возникает во время принятия решений и может играть роль в подавлении исследовательского поведения46,48. Колебания в диапазоне 0,5–4 Гц также считаются надежным маркером истощения дофамина, особенно в базальных ганглиях, и коррелируют с двигательной дисфункцией49. В случае мышей TAAR5-KO мы ранее наблюдали увеличение уровня дофамина в тканях стриатума27, что могло привести к снижению мощности колебаний дельта-диапазона, а также к изменению сенсомоторного контроля и улучшению моторной координации у этих мышей. Важно отметить, что как уменьшение дельта-колебаний, так и увеличение тета-колебаний может указывать на более высокий исследовательский драйв у мышей TAAR5-KO. Учитывая, что дельта-колебания в основном возникают при подавлении исследования, и что тета-ритм, наоборот, возникает во время исследовательского поведения, наши данные предполагают повышенную двигательную / исследовательскую активность, о которой сообщалось ранее17 и которая может играть критическую роль в сложных моторных функциях. В то же время следует отметить, что различия в спектральной плотности мощности могут быть вызваны множеством причин. Не только снижение уровня серотонина в тканях гиппокампа и повышение уровня дофамина в стриатуме, наблюдаемое у мышей TAAR5-KO, может вызывать измененные тета- и дельта-колебания. Изменения в поведенческих паттернах, отмеченные у мышей TAAR5-KO17, также потенциально могут способствовать изменениям спектральной мощности, хотя мы проводили регистрацию, когда животные демонстрировали схожее поведение.
Известно также, что TAAR5 участвует в восприятии поведения мышей, связанного с естественными одорантами. В частности, мыши TAAR5-KO проявляли меньшее влечение к компоненту мочи самцов мышей триметиламину 50, и этот эффект потенциально может приводить к изменениям моторного поведения. Например, можно было ожидать, что мыши дикого типа могут проводить больше времени в тестах из-за исследования «следов триметиламина», но в других анализах, включающих оценку моторных функций и исследовательской активности (тест Открытого поля), мыши WT показали, фактически, меньшее исследовательское поведение по сравнению с мышами TAAR5-KO17. Кроме того, мы отметили изменения в нескольких различных тестах, не обязательно связанных с моторными функциями, и поэтому считаем, что только этот факт не может полностью объяснить наблюдаемые данные.
Как отмечено ранее17, здесь мы подтверждаем, что TAAR5 (и, вероятно, TAARs в целом) не просто «обонятельный рецептор», участвующий в восприятии естественных запахов51, но также участвует в нейромодуляции сенсомоторного контроля в стволе мозга, мозжечке и переднем мозге. Принимая во внимание специфические эффекты на опорно-двигательную систему, а также наши предыдущие открытия активации нейрогенеза у взрослых мышей TAAR5-KO27, мы рассматриваем потенциальную полезность будущих TAAR5-нацеленных агентов в фармакотерапии нейромоторных расстройств. Для оценки такой возможности необходимы дальнейшие подробные исследования. Наконец, учитывая близкое сходство между членами семейства TAAR, было бы важно оценить роль других TAARs в сенсомоторных функциях. Интересно, что экспрессия других TAARs (TAAR1, TAAR8) ранее сообщалась в мозжечке мышей и людей 27,52.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, TAAR5-KO мыши имеют специфический моторный фенотип, характеризующийся уменьшением мышечной силы, а также улучшением баланса и моторной координации, что связано с распределением TAAR5 в вестибулярных ядрах, мозжечке, а также изменениями дельта-ритма стриатума и тета-ритма моторной коры. Эти результаты демонстрируют участие TAAR5 в контроле сенсомоторной активности, что может быть связано с модулирующим действием TAAR5 на дофаминергические, серотонинергические и потенциально другие аминергические системы, которые осуществляют супраспинальную регуляцию нейронных сетей, участвующих в контроле постуральных и локомоторных функций. Учитывая специфические эффекты на опорно-двигательную систему, а также имеющиеся у нас данные об активации нейрогенеза у взрослых мышей TAAR5-KO, мы рассматриваем потенциальную возможность использования TAAR5-нацеленных препаратов в фармакотерапии нейромоторных расстройств, вызванных заболеваниями и травмами ЦНС, в т.ч. при мультисистемной нейрореабилитации56 с применением электро-химических нейропротезов57.


Список опубликованных работ по 3 этапу проекта

По результатам работы в 2021 г. лабораторией получено 2 патента, подготовлено 22 научная публикация, из них опубликовано 15 статьи в рецензируемых изданиях общим IF=39,455, из которых 14 в WOS/Scopus, 7 статей находится на стадии рецензии в журналах.

Статьи в рецензируемых журналах:

1.Popov A, Lyakhovetskii V, Bazhenova E, Gorskii O, Kalinina D, Merkulyeva N, Musienko P. The role of load-dependent sensory input in the control of balance during gait in rats. J Exp Biol. 2021 Aug 1;224(15):jeb242138. doi: 10.1242/jeb.242138. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=3.312)

2.Simultaneous bidirectional hindlimb locomotion in decerebrate cats. Lyakhovetskii V, Merkulyeva N, Gorskii O, Musienko P. Sci Rep. 2021;11(1):3252. doi: 10.1038/s41598-021-82722-2. https://www.nature.com/articles/s41598-021-82722-2 (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=4.379)

3.Merkulyeva N, Lyakhovetskii V, Veshchitskii A, Gorskii O, Musienko P. Rostrocaudal Distribution of the C-Fos-Immunopositive Spinal Network Defined by Muscle Activity during Locomotion. Brain Sci. 2021;11(1):69. doi: 10.3390/brainsci11010069.
https://www.mdpi.com/2076-3425/11/1/69 (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=3.7).

4.D.S. Kalinina, M.A. Ptukha, A.V. Goriainova, N.S. Merkulyeva, A.A. Kozlova, R.Z. Murtazina, T.S. Shemyakova, S.R. Kuvarzin, A.N. Vaganova, A.B. Volnova, R.R. Gainetdinov, P.E. Musienko. Role of the trace amine-associated receptor 5 (TAAR5) in the sensorimotor functions. Scientific Reports. 2021. In press. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=4.379)

5.Zabegalov K.N., Wang D., Yang L.E., Wang J., Hu G., Serikuly N., Alpyshov E.T., Kalueff A.V., Khatsko S.L., Zhdanov A., Demin K.A., Galstyan D.S., de Abreu M.S., Strekalova T., Song C., Volgin A.D., Amstislavskaya T.G., Sysoev Y., Musienko P.E., Kalueff AV. Decoding the role of zebrafish neuroglia in cns disease modeling. Brain Research Bulletin. 2021. Т. 166. С. 44-53. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0361923020306420 (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=4.077)

6.Popov A., Lyakhovetskii V., Merkulyeva N., Musienko P. Effect of hindlimb unloading on recruitment of gastrocnemius medialis muscle during treadmill locomotion in rats. Exp Brain Res. 2021 doi: 10.1007/s00221-021-06167-9. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=1.972)

7.Sysoev, Y.I.; Prikhodko, V.A.; Chernyakov, R.T.; Idiyatullin, R.D.; Musienko, P.E.; Okovityi, S.V. Effects of Alpha-2 Adrenergic Agonist Mafedine on Brain Electrical Activity in Rats after Traumatic Brain Injury. Brain Sci. 2021, 11, 981. https://doi.org/10.3390/brainsci11080981 (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=3.7)

8.Д. П. Чернюк, А. Г. Зорин, К. З. Деревцова, Е. В. Ефимова, В. А. Приходько, Ю. И. Сысоев, О. Л. Власова, М. В. Болсуновская, И. Б. Безпрозванный. Автоматический анализ данных поведенческого теста “водный лабиринт Морриса” / Д. П. Чернюк, А. Г. Зорин, К. З. Деревцова [и др.] // Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. – 2021. – Т. 71. – № 1. – С. 126-135. – DOI 10.31857/S0044467721010044. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=0.99)

9.Вещицкий А.А., Мусиенко П.Е. Меркульева Н.С Особенности распределения кальретинин-иммунопозитивных нейронов в поясничном отделе спинного мозга (Felis Catus). Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2021, том 57, No 4, с. 344–360 https://rusjphysiol.org/index.php/jebph/article/view/1208/604 (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=0.652)

10.Попов А.А., Меркульева Н.С., Мусиенко П.Е. Двигательная дисфункция нетравматического генеза. Интегративная физиология. 2021. В печати. (РИНЦ)

11.D. Kalinina, A. Goriainova, N. Pavlova, N. Merkulyeva, R. Gainetdinov , P. Musienko Repair after incomplete spinal cord injury in TAAR5 KO mice. European Neuropsyhopharmacology. In press. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=4.6).

12.Efimova EV, Kozlova AA, Razenkova V, Katolikova NV, Antonova KA, Sotnikova TD, Merkulyeva NS, Veshchitskii AS, Kalinina DS, Korzhevskii DE, Musienko PE, Kanov EV, Gainetdinov RR. Increased dopamine transmission and adult neurogenesis in trace amine-associated receptor 5 (TAAR5) knockout mice. Neuropharmacology. 2021 Jan;182:108373. doi: 10.1016/j.neuropharm.2020.108373. (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=5.2).

13.Shapkova, Еmelyannikov, Larionova. Sensorimotor and locomotоr adjustments in the chronic post-traumatic spinal cord damage in human adults as evidence of activity-dependent neuroplasticity. Human Physiology, 2021, vol.47, №4, p.363-373. doi: 10.31857/s0131164621040147 (Scopus, РИНЦ, IF=1.124).

14.Sysoev, Y.I., Whaley, A.K., Prikhodko, V.A. et al. Pharmacokinetics of Intravenously and Intraperitoneally Administered Mafedine Sodium in Mice. Pharm Chem J, 54, 1193–1197 (2021). (Scopus, WoS, РИНЦ, IF=0,837)

15.Шапкова Е.Ю., Емельянников Д.В., Ларионова Ю.Е., Купреев Н.А., Григорьева Е.В. Динамика независимости и локомоторных возможностей при тренировках ходьбы в экзоскелете у пациентов с тяжелой хронической позвоночно-спинномозговой травмой. "Хирургия позвоночника". 2020 (опубликована в 2021); 17(4):54-67. https://doi.org/10.14531/ss2020.4.54-67 (Scopus, РИНЦ, IF=0.533)


Патенты:

1."Нейрональный имплант" приоритет на патент от 15.05.2020, выдан 07.09.2021, №2020116844

2."Способ получения нейрональных имплантов" приоритет на патент от 09.03.2021, выдан 11.10.2021, №2021106033

Тезисы в материалах отечественных и международных конференций:

1.Ляховецкий В.А., Шкорбатова П.Ю., Горский О.В., Мусиенко П.Е. Сайт-специфичность трансвертебральных вызванных потенциалов скелетных мышц кошки. Международная научная конференция «ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ НАУКИ – МЕДИЦИНЕ», Минск, окт. 2021
2.Ляховецкий В.А., Меркульева Н.С., Горский О.В., Мусиенко П.Е. Ходьба децеребрированной кошки на расщепленном тредбане. XVII Международный Междисциплинарный Конгресс НЕЙРОНАУКА ДЛЯ МЕДИЦИНЫ И ПСИХОЛОГИИ
3.Kalinina D, Gorsky O, Gainetdinov R, Musienko P. Sensorimotor functions in condition of altered dopaminergic control in DAT-KO rats. Virtual FENS Regional Meeting 2021, 25 - 27 August 2021, p.164. Poster.
4.D. Kalinina, A. Goriainova, N. Pavlova, N. Merkulyeva, R. Gainetdinov, P. Musienko. Repair after incomplete spinal cord injury in TAAR5 KO mice. 34rd ECNP Congress, 2-5 October 2021, Hybrid, Poster.
5.D. Kalinina , O. Gorsky , A. Goriainova , R. Gainetdinov ,P. Musienko. Dopaminergic regulation altered motor evoked potentials in DAT-KO rats. Neroscience 2021, Labroots. 25 august 2021. https://events.labroots.com/event/Neuroscience2021/en-us/contents/723683/share?rid=Lobby&nid=1246198
6.Шкорбатова П.Ю., Ляховецкий В.А., Горский О.В., Мусиенко П.Е. Бипедальная ходьба децеребрированной кошки при трансвертебральной стимуляции. Материалы X Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности, посвященной памяти Инесы Бенедиктовны Козловской и приуроченной к году науки и технологий НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПРОБЛЕМ ФИЗИОЛОГИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ (Москва, 28 июня – 01 июля 2021г.) ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Стендовый доклад онлайн. тезисы стр.50.
7.Ляховецкий В.А., Меркульева Н.С., Горский О.В., Мусиенко П.Е. Активность мышц бедра при двунаправленной ходьбе децеребрированной кошки. Материалы X Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности, посвященной памяти Инесы Бенедиктовны Козловской и приуроченной к году науки и технологий НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПРОБЛЕМ ФИЗИОЛОГИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ (Москва, 28 июня – 01 июля 2021 г.) ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Стендовый доклад онлайн. тезисы стр.44.
8.Шапкова Е.Ю., Ларионова Ю.Е, Купреев Н.А. Емельянников Д.В. Адаптация к принудительной локомоторной активности и афферентной стимуляции при хроническом посттравматическом поражении взрослого спинного мозга человека. Материалы X Всероссийской с международным участием школы-конференции по физиологии мышц и мышечной деятельности, посвященной памяти Инесы Бенедиктовны Козловской и приуроченной к году науки и технологий НОВЫЕ ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ ПРОБЛЕМ ФИЗИОЛОГИИ ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ СОСТОЯНИЙ (Москва, 28 июня – 01 июля 2021 г.) ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Стендовый доклад онлайн. тезисы стр.80.
9.Шапкова Е.Ю. Комплексная тренировка ходьбы в экзоскелете при позвоночно-спинномозговой травме: что дает дополнительная электростимуляция спинного мозга?XIII Международный конгресс «НЕЙРОРЕАБИЛИТАЦИЯ - 2021» 18 июня 2020, секция "Роботизированные технологии в нейрореабилитации", доклад
10.Калинина Д.С., Горский О.В.Исследование дофаминергического контроля постуральной функции. Материалы научной конференции XXIV Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье». Санкт-Петербургский гос. ун-т. — СПб. : Сциентиа, 2021. — 812-813 с.
11. Горяинова А.В., Калинина Д.С., Горский О.В Исследование роли рецепторов к следовым аминам 5 типа в различных uравитационных условиях Материалы научной конференции XXIV Международная медико-биологическая конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье». Санкт-Петербургский гос. ун-т. — СПб. : Сциентиа, 2021. — 794-795 с.
12.Калинина Д.С., Горский О. В., Сысоев Ю.И., Горяинова А.В., Мусиенко П.Е. Дофаминергическая регуляция нервной проводимости. XXIV научная школа-конференция молодых ученых по физиологии высшей нервной деятельности и нейрофизиологии. 28-30 октября 2021 доклад
13.AV Goriainova, DS Kalinina, RR Gainetdinov, PE Musienko. Motor activity during swimming and walking in TAAR5 knockout mice. 28th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference “Stress and Behavior” 16-18 May 2021 стр.21. https://static1.squarespace.com/static/5c30ace65b409b49b09b1b83/t/60a630a54997140811238a0b/1621504170494/Program+and+Proceedings+ISBS+STP+2021+%281%29.pdf
14.PE Musienko. Neuroprosthetics of motor and visceral functions. 28th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference “Stress and Behavior” 16-18 May 2021 стр.33. https://static1.squarespace.com/static/5c30ace65b409b49b09b1b83/t/60a630a54997140811238a0b/1621504170494/Program+and+Proceedings+ISBS+STP+2021+%281%29.pdf
15.Y.I. Sysoev, PE Musienko. Effects of mafedine administration on brain electrical activity after brain trauma in rats. 28th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference “Stress and Behavior” 16-18 May 2021 стр.23. https://static1.squarespace.com/static/5c30ace65b409b49b09b1b83/t/60a630a54997140811238a0b/1621504170494/Program+and+Proceedings+ISBS+STP+2021+%281%29.pdf
16.DS Kalinina. Maternal hyperhomocysteinemia leads to neuroinflamatory processes in rat hippocampus during the first month after birth, inducing memory deficit in adults. 28th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference “Stress and Behavior” 16-18 May 2021 стр.17. https://static1.squarespace.com/static/5c30ace65b409b49b09b1b83/t/60a630a54997140811238a0b/1621504170494/Program+and+Proceedings+ISBS+STP+2021+%281%29.pdf
17.A Popov, V Lyakhovetskii, O Gorskii, D Kalinina, PE Musienko. Effect of hindlimb unloading on hamstring muscle during treadmill locomotion in rats. 28th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference “Stress and Behavior” 16-18 May 2021 стр.49. https://static1.squarespace.com/static/5c30ace65b409b49b09b1b83/t/60a630a54997140811238a0b/1621504170494/Program+and+Proceedings+ISBS+STP+2021+%281%29.pdf
18.Горяинова А.В., Калинина Д.С. Исследование моторной координации у мышей с нокаутом гена, кодирующего TAAR5. Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2021» / Отв. ред. И.А. Алешковский, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, Е.И. Зимакова. [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс, 2021., Секция “Физиология человека и животных”,
https://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2021/data/21890/126228_uid443559_report.pdf

19. Сысоев Ю.И. Применение метода электрокортикографии для оценки нейропротекторной активности лекарственных средств у мелких лабораторных животных. Конференция ПСПбГМУ им.И.П.Павлова 22-23 апреля 2021 https://www.1spbgmu.ru/images/home/Nauka/konferentsii/2021/Программа_конференции_СПб_22-23.04.2021.pdf

Статьи на стадии рецензирования в журналах:

1.K. V. Deriabin, S.O. Kirichenko, A.V. Lopachev , Y. Sysoev, P. Musienko, R. Islamova. Ferrocenyl-containing silicone nanocomposites as materials for anticancer neural implants. Macromolecular Rapid Communications. 2021. Submitted.

2.N. Merkulyeva, O. Gorskii, V. Lyakhovetski, P. Musienko. Functional differences of the spinal networks responsible for backward and forward locomotion. J Neurosci. 2021. Submitted.

3.M.N. Barshutina, S.O. Kirichenko, V.A. Wodolajsky, A. V. Lopachev, S.N. Barshutin, O.V. Gorsky, K.V. Deriabin, R. M. Islamova, A.G. Tkachev, P. E. Musienko. Biocompatible PDMS CNT composite for soft bioelectronic neuronal implants. Nanotechnology, Science and Applications. 2021. Submitted.

4.P. Musienko, V. Lyalka, O. Gorskii, P. Zelenin, T. Deliagina. Organization of spinal networks generating forward and backward walking. J Neurosci. 2021. Submitted.

5.Popov Alexander, Lyakhovetskii Vsevolod, Gorskii Oleg, Kalinina Daria, Musienko Pavel. Effect of hindlimb unloading on hamstring muscle during treadmill locomotion and swimming in rats. Exp Neurol. 2021. Submitted.

6.P. Shkorbatova, V. Lyakhovetski, A. Veshchitskii, E. Bazhenova, N. Pavlova, P. Musienko, N.Merkulyeva. Postnatal growth of the spinal segments in cat: their lengths and positions in relation to vertebrae. Anatomical Records. 2021. Submitted.

7.А.А. Вещицкий, В.А. Ляховецкий, О.В. Горский, П.Е. Мусиенко, Н.С. Меркульева. Что может рассказать двунаправленная ходьба о центральных генераторах паттерна? Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. На рецензировании.

Список использованной литературы

1.Boulton, A. A. Letter: Amines and theories in psychiatry. Lancet (London, England) 2, 52–53 (1974).
2.Berry, M. D. Mammalian central nervous system trace amines. Pharmacologic amphetamines, physiologic neuromodulators. J. Neurochem. 90, 257–271 (2004).
3.Borowsky, B. et al. Trace amines: identification of a family of mammalian G protein-coupled receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 8966–8971 (2001).
4.Bunzow, J. R. et al. Amphetamine, 3,4-methylenedioxymethamphetamine, lysergic acid diethylamide, and metabolites of the catecholamine neurotransmitters are agonists of a rat trace amine receptor. Mol. Pharmacol. 60, 1181–1188 (2001).
5.Lindemann, L. et al. Trace amine-associated receptors form structurally and functionally distinct subfamilies of novel G protein-coupled receptors. Genomics 85, 372–385 (2005).
6.Adriaenssens, A. et al. A Transcriptome-Led Exploration of Molecular Mechanisms Regulating Somatostatin-Producing D-Cells in the Gastric Epithelium. Endocrinology 156, 3924–3936 (2015).
7.Berry, M. D., Gainetdinov, R. R., Hoener, M. C. & Shahid, M. Pharmacology of human trace amine-associated receptors: Therapeutic opportunities and challenges. Pharmacol. Ther. 180, 161–180 (2017).
8.Mazzoli, R. & Pessione, E. The Neuro-endocrinological Role of Microbial Glutamate and GABA Signaling. Front. Microbiol. 7, 1934 (2016).
9.Raab, S. et al. Incretin-like effects of small molecule trace amine-associated receptor 1 agonists. Mol. Metab. 5, 47–56 (2016).
10.Ono, H., Ito, H. & Fukuda, H. 2-phenylethylamine and methamphetamine enhance the spinal monosynaptic reflex by releasing noradrenaline from the terminals of descending fibers. Jpn. J. Pharmacol. 55, 359–366 (1991).
11.Reddy, S. V, Maderdrut, J. L. & Yaksh, T. L. Spinal cord pharmacology of adrenergic agonist-mediated antinociception. J. Pharmacol. Exp. Ther. 213, 525–533 (1980).
12.Kitazawa, T., Saito, K. & Ohga, A. Effects of catecholamines on spinal motoneurones and spinal reflex discharges in the isolated spinal cord of the newborn rat. Brain Res. 351, 31–36 (1985).
13.Gozal, E. A. et al. Anatomical and functional evidence for trace amines as unique modulators of locomotor function in the mammalian spinal cord. Front. Neural Circuits 8, 134 (2014).
14.Hochman, S. Metabolic recruitment of spinal locomotion: intracellular neuromodulation by trace amines and their receptors. Neural Regen. Res. 10, 1940–1942 (2015).
15.Lindemann, L. et al. Trace amine-associated receptor 1 modulates dopaminergic activity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 324, 948–956 (2008).
16.Liu, J.-F., Thorn, D. A., Zhang, Y. & Li, J.-X. Effects of Trace Amine-associated Receptor 1 Agonists on the Expression, Reconsolidation, and Extinction of Cocaine Reward Memory. Int. J. Neuropsychopharmacol. 19, (2016).
17.Espinoza, S. et al. Trace Amine-Associated Receptor 5 Provides Olfactory Input Into Limbic Brain Areas and Modulates Emotional Behaviors and Serotonin Transmission. Front. Mol. Neurosci. 13, (2020).
18.McKay, B. E. & Turner, R. W. Physiological and morphological development of the rat cerebellar Purkinje cell. Journal of Physiology 567, 829–850 (2005).
19.Eisenman, L. & Hawkes, R. Antigenic compartmentation in the mouse cerebellar cortex: zebrin and HNK-1 reveal a complex, overlapping molecular topography. J. Comp. Neurol. 335, 586–605 (1993).
20.Suárez, C. et al. Morphometric Analysis of the Vestibular Complex in the Rat. Laryngoscope 103, 762???773 (1993).
21.Paxinos, G. & Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. (Academic Press, 2001).
22.Deacon, R. M. J. Measuring motor coordination in mice. J. Vis. Exp. e2609 (2013). doi:10.3791/2609
23.Brooks, S. P. & Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user’s guide. Nat. Rev. Neurosci. 10, 519–529 (2009).
24.VanderHorst, V. G. J. M. & Ulfhake, B. The organization of the brainstem and spinal cord of the mouse: Relationships between monoaminergic, cholinergic, and spinal projection systems. J. Chem. Neuroanat. 31, 2–36 (2006).
25.Gainetdinov, R. R., Hoener, M. C. & Berry, M. D. Trace Amines and Their Receptors. Pharmacol. Rev. 70, 549–620 (2018).
26.Liberles, S. D. Trace amine-associated receptors: Ligands, neural circuits, and behaviors. Current Opinion in Neurobiology 34, 1–7 (2015).
27.Efimova, E. V. et al. Increased dopamine transmission and adult neurogenesis in trace amine-associated receptor 5 (TAAR5) knockout mice. Neuropharmacology 182, (2021).
28.Vaganova, A. N. et al. Pattern of TAAR5 Expression in the Human Brain Based on Transcriptome Datasets Analysis. Int. J. Mol. Sci. 22, (2021).
29.Gaudel, F., Guiraudie-Capraz, G. & Féron, F. Limbic Expression of mRNA Coding for Chemoreceptors in Human Brain—Lessons from Brain Atlases. International Journal of Molecular Sciences 22, (2021).
30.Kenville, R., Maudrich, T., Maudrich, D., Villringer, A. & Ragert, P. Cerebellar transcranial direct current stimulation improves maximum isometric force production during isometric barbell squats. Brain Sci. 10, 235 (2020).
31.Li, B., Zhu, J. N. & Wang, J. J. Histaminergic afferent system in the cerebellum: Structure and function. Cerebellum and Ataxias 1, 5 (2014).
32.Tung, V. W. K., Burton, T. J., Dababneh, E., Quail, S. L. & Camp, A. J. Behavioral assessment of the aging mouse vestibular system. J. Vis. Exp. (2014). doi:10.3791/51605
33.Brodal, A. Vestibulocerebellar Input in the Cat: Anatomy. Prog. Brain Res. 37, 315–327 (1972).
34.Romand, R. & Varela-Nieto, I. Development of Auditory and Vestibular Systems. (Academic Press, 2014). doi:10.1016/C2012-0-03648-4
35.Vidal, P. P. et al. Chapter 28 - The Vestibular System. in (ed. Paxinos, G. B. T.-T. R. N. S. (Fourth E.) 805–864 (Academic Press, 2015). doi:https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374245-2.00028-0
36.Cransac, H., Cottet-Emard, J. M., Pequignot, J. M. & Peyrin, L. Monoamines (norepinephrine, dopamine, serotonin) in the rat medial vestibular nucleus: endogenous levels and turnover. J. Neural Transm. 103, 391–392 (1996).
37.Yokoyama, C., Okamura, H., Nakajima, T., Taguchi, J.-I. & Ibata, Y. Autoradiographic distribution of [3H]YM-09151-2, a high-affinity and selective antagonist ligand for the dopamine D2 receptor group, in the rat brain and spinal cord. J. Comp. Neurol. 344, 121–136 (1994).
38.Enjin, A. et al. Sensorimotor function is modulated by the serotonin receptor 1d, a novel marker for gamma motor neurons. Mol. Cell. Neurosci. 49, 322–332 (2012).
39.Mengod, G., Cortés, R., Vilaró, M. T. & Hoyer, D. Distribution of 5-HT Receptors in the Central Nervous System. in Handbook of Behavioral Neuroscience 21, 123–138 (Elsevier, 2010).
40.Buzsaki, G. Theta oscillations in the hippocampus. Neuron 33, 325–340 (2002).
41.McNaughton, N., Ruan, M. & Woodnorth, M. A. Restoring theta-like rythmicity in rats restores initial learning in the Morris water maze. Hippocampus 16, 1102–1110 (2006).
42.Goutagny, R., Jackson, J. & Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat. Neurosci. 12, 1491–1493 (2009).
43.Kudina, T. A., Sudnitsyn, V. V., Kutyreva, E. V. & Kichigina, V. F. The serotonin reuptake inhibitor fluoxetine suppresses theta oscillations in the electroencephalogram of the rabbit hippocampus. Neurosci. Behav. Physiol. 34, 929–933 (2004).
44.Sörman, E., Wang, D., Hajos, M. & Kocsis, B. Control of hippocampal theta rhythm by serotonin: Role of 5-HT2c receptors. Neuropharmacology 61, 489–494 (2011).
45.Harmony, T. The functional significance of delta oscillations in cognitive processing. Frontiers in Integrative Neuroscience 7, (2013).
46.Knyazev, G. G. EEG delta oscillations as a correlate of basic homeostatic and motivational processes. Neuroscience and Biobehavioral Reviews 36, 677–695 (2012).
47.Nácher, V., Ledberg, A., Deco, G. & Romo, R. Coherent delta-band oscillations between cortical areas correlate with decision making. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 15085–15090 (2013).
48.Whalen, X. T. C., Willard, A. M., Rubin, J. E. & Gittis, A. H. Delta oscillations are a robust biomarker of dopamine depletion severity and motor dysfunction in awake mice. J. Neurophysiol. 124, 312–359 (2020).
49.Liberles, S. D. & Buck, L. B. A second class of chemosensory receptors in the olfactory epithelium. Nature 442, 645–650 (2006).
50.Li, Q. et al. Synchronous evolution of an odor biosynthesis pathway and behavioral response. Curr. Biol. 23, 11–20 (2013).
51.Chiellini, G. et al. Distribution of exogenous [ 125I]-3-iodothyronamine in mouse in vivo: Relationship with trace amine-associated receptors. J. Endocrinol. 213, 223–230 (2012).
52.Jones, B. J. & Roberts, D. J. The quantitative measurement of motor inco‐ordination in naive mice using an accelerating rotarod. J. Pharm. Pharmacol. 20, 302–304 (1968).
53.Barrett, T. et al. NCBI GEO: archive for functional genomics data sets--update. Nucleic Acids Res. 41, (2013).
54.Mahi, N. Al, Najafabadi, M. F., Pilarczyk, M., Kouril, M. & Medvedovic, M. GREIN: An Interactive Web Platform for Re-analyzing GEO RNA-seq Data. Sci. Reports 2019 91 9, 1–9 (2019).
55.Kim, S. T., Son, H. J., Choi, J. H., Ji, I. J. & Hwang, O. Vertical grid test and modified horizontal grid test are sensitive methods for evaluating motor dysfunctions in the MPTP mouse model of Parkinson’s disease. Brain Res. 1306, 176–183 (2010).
56.Musienko P, Heutschi J, Friedli L, van den Brand R, Courtine G. Multi-system neurorehabilitative strategies to restore motor functions following severe spinal cord injury. Exp. Neurol. 2012. Vol.235. P.100.
57.Musienko P, van den Brand R, Maerzendorfer O, Larmagnac A, Courtine G. Combinatory electrical and pharmacological neuroprosthetic interfaces to regain motor function after spinal cord injury. IEEE Trans Biomed Eng. Vol.56. 2009. P.2707–2711.