Данный проект направлен на изучение молекулярного разнообразия мембранного транспортного белка Na,K-АТФазы и белков межклеточного транспорта суперсемейства клаудинов. Различные молекулярные формы этих транспортных белков отличаются ткане-специфичностью экспрессии, способностью образовывать мультимолекулярные функциональные комплексы, а также особенностями локализации в специализированных микродоменах мембраны. Новейшие разработки, включая наши данные, свидетельствуют о существовании функционального взаимодействия между Na,K-АТФазой и клаудинами. Основным инструментом в исследованиях этого взаимодействия является специфический лиганд Na,K-АТФазы уабаин, рецептором для которого служит а-субъединица Na,K-АТФазы. В настоящее время доказано существование эндогенного аналога уабаина, который синтезируется в коре надпочечников и в гипоталамусе, циркулирует в наномолярном диапазоне концентраций и рассматривается в качестве важного физиологического регулятора. Полученные данные подтверждают взаимосвязь между уровнем мембранного холестерина и распределением а2-изоформы Na,K-АТФазы в области концевой пластинки, а также роль холестерина во взаимодействии а2-изоформы с холинорецептором. Обнаружены существенные отличия в стабильности липид-упорядоченной фазы мембраны концевой пластинки у мышей с моделью бокового амиотрофического склероза, несмотря на существенное перераспределение а2-изоформы и холинорецептора в мембране после удаления части мембранного холестерина, молекулярное взаимодействие этих белков сохраняется. Данные свидетельствуют о нарушении механизма везикулярного транспорта церамида у этих мышей, что дополнительно подчеркивает отличия в стабильности липидной фазы мембраны этих мышей по сравнению с контрольными мышами. В экспериментах по изучению роли липидного окружения в функционировании клаудинов оценена возможность существования функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов, изменение тока «короткого замыкания» при действии MbCD может указывать на потенциально важную роль липидного окружения в модуляции этого взаимодействия. Впервые в условиях in vivo показано, что только хронически циркулирующий уабаин способен модулировать электрогенную активность Na,K-АТФазы и электрогенез скелетной мышцы, что может быть основой протективных свойств уабаина в условиях моделирования гравитационной разгрузки. У этих же крыс однократное введение уабаина вызывало снижение проницаемости эпителия без изменений электрофизиологических параметров и экспрессии белков плотных контактов в тощей кишке. Однако превентивное однократное введение уабаина перед антиортостатическим вывешиванием оказывало протективное действие, увеличивая ток «короткого замыкания», а также экспрессию клаудинов-1, -2 и окклюдина. Напротив, в лобных долях головного мозга само по себе введение уабаина приводило к снижению уровня клаудина-5, в том числе, в условиях вывешивания. В экспериментах с моделированием ионизирующего излучения установлена оптимальная доза излучения 10 Гр с пострадиационным периодом 72 ч. Тенденция к увеличению ТБК-активных продуктов в сыворотке крови может свидетельствовать о характерных для ионизирующего излучения признаках оксидативного стресса (генерация активных форм кислорода и последующих процессов свободнорадикального повреждения макромолекул). В тощей кишке наблюдалось увеличение уровня «уплотняющего» клаудина-1 и порообразующего клаудина-2, что свидетельствует о большой потере воды у животных с кишечной формой острой лучевой болезни. Ткань толстой кишки была сравнительно резистентна к воздействию излучения, что может быть связано с различным спектром белков плотных контактов, экспрессируемых в разных отделах кишки. Эксперименты на диафрагмальных мышцах крысы показали снижение мембранного потенциала покоя, наиболее выраженное в постсинаптическом районе сарколеммы. Эта деполяризация была обусловлена снижением общей электрогенной активности а1- и а2-изоформ Na,K-АТФазы, причем активность а2-изоформы по всей мембране практически отсутствовала. В опытах in vivo с применением барокамеры моделировали условия гипобарической гипоксии в течение 3-х ч при атм. давлении 530 либо 370 мм рт.ст. Обнаружена долговременная (24 ч) гиперполяризация сарколеммы за счет увеличения электрогенной активности а2-изоформы Na,K-АТФазы, которая вероятно обусловлена повышением плотности ее распределения в мембране. Показано влияние кратковременной гипобарической гипоксии на барьерные и транспортные процессы преимущественно в ткани толстой кишки. Все изменения сопровождались устойчивым снижением уровня циркулирующего эндогенного уабаина и увеличением уровня ТБК-активных продуктов. Уровень кортикостерона, редокс статус и активность лактатдегидрогеназы не изменялись. В условиях острой гипоксии in vitro создавали замену оксигенации перфузирующего раствора карбогеном (95% O2+5% CO2) на азотсодержащую смесь (95% N2+5% CO2) с последующей реоксигенацией карбогеном. Обнаружено, что ткани тощей и толстой и кишки были резистентны к влиянию острой гипоксии. Однако такая гипоксия в условиях in vitro уже через 15 мин вызывала гиперполяризацию сарколеммы (также, как и при гипобарической гипоксии), которая, сохранялась в течение 60 мин и была обратимой при реоксигенации карбогеном. При хроническом введения преднизолона мышам впервые обнаружено, что помимо уплотняющих клаудинов-1, -3, -5, участвующих в организации гематоэнцефалического барьера, обнаружен также порообразующий клаудин-2, что важно для понимания механизма регуляции ионного и водно-солевого баланса в этой структуре. Применение данных моделей делает проект исключительно актуальным с точки зрения поиска подходов к высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения.
Изучение роли изоформ-специфичности функционирования и взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов: I. Роль липидного окружения. На модели бокового амиотрофического склероза (FUS) выявлено снижение плотности распределения а2-изоформы в диафрагмальной мышце мышей FUS, аналогичное обнаруженному нами ранее у мышей с моделями дисферлинопатии и миодистрофии Дюшенна (Bla/J и mdx). Таким образом, у всех трех моделей (FUS, Bla/J и mdx), принципиально отличающихся по молекулярным механизмам нарушений двигательной активности, наблюдается сходное нарушение мембранной локализации а2-изоформы Na,K-АТФазы в диафрагмальной мышце. Установлено, что влияние частичного удаления мембранного холестерина с помощью MbCD на распределение а2-изоформы намного сильнее выражено у мышей FUS. Опыты с применением флуоресцентного аналога церамида выявили нарушение механизма везикулярного транспорта церамида у мышей FUS. Применение MbCD в культуре клеток гладких мышц A7r5 подтвердило, что функциональное взаимодействие а2- изоформы Na,K-АТФазы с молекулярным окружением, важные для реализации внутриклеточного Ca2+ сигналинга, существенно зависит от мембранного холестерина и реализуется в специализированных микродоменах плазматической мембраны. При внутривенном введении MbCD in vivo изменений барьерных свойств ткани тощей и толстой кишки не обнаружено. Однако выявлена способность MbCD модулировать экспрессию клаудинов-1 и -5 в эндотелии кровеносных сосудов головного мозга. При остром (in vitro) применении MbCD зарегистрировано увеличение тока «короткого замыкания» в ткани тощей кишки, которое может быть связано с изменением активности Na,K-АТФазы и косвенно указывает на роль липидного окружения в модуляции функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов. II. Моделирования гравитационной разгрузки. Однократное введение уабаина (1 мкг/кг) неспособно предотвращать вызываемую вывешиванием деполяризацию мембраны в камбаловидной мышце крысы. Только хронически циркулирующий уабаин способен модулировать электрогенную активность Na,K-АТФазы и электрогенез мышцы, что может быть основой протективных свойств уабаина в условиях моделирования гравитационной разгрузки. Напротив, в тканях тощей и толстой кишки, а также лобных долей головного мозга, уже при однократном введении уабаина проявлялась его способность модулировать экспрессию клаудинов-1, -2, -5 и окклюдина и предотвращать вызываемые вывешиванием нарушения в тканях кишки. III. Моделирования эндотоксемии. Уабаин (10 нМ) способен предотвращать вызванное липополисахаридами (LPS) нарушение барьерных свойств монослоя клеток линии IPEC-J2 за счет увеличения уровня «уплотняющих» клаудинов-1 и -3 без изменения уровня клаудина-5. Данные подтверждают функциональную значимость взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов в условиях моделирования эндотоксемии in vitro. IV. Ионизирующее излучение. Анализ дозо-чувствительности эпителия тощей кишки крысы по изменениям барьерных свойств показал, что оптимальной для дальнейших исследований является доза общего ионизирующего излучения 10 Гр с пострадиационным периодом 72 ч. Наблюдалось увеличение уровня «уплотняющего» клаудина-1 и порообразующего клаудина-2, ткань толстой кишки была сравнительно резистентна к воздействию излучения. В диафрагмальных мышцах этих же крыс выявлена деполяризация сарколеммы, обусловленная предположительно снижением электрогенной активности а2- изоформы Na,K-АТФазы.
V. Моделирование гипоксии. В опытах in vivo с применением барокамеры моделировали условия гипобарической гипоксии в течение 3-х ч при атм. давлении 530 либо 370 мм рт.ст. Гипоксию в условиях in vitro создавали заменой оксигенации перфузирующего раствора карбогеном на азотсодержащую смесь с последующей реоксигенацией. Данные свидетельствуют об изменении барьерных и транспортных процессов в эпителии тощей и толстой кишки крысы только при гипобарической гипоксии. В диафрагмальной мышце гипобарическая гипоксия вызывала долговременную (24 ч) гиперполяризацию сарколеммы за счет увеличения электрогенной активности а2-изоформы Na,K-АТФазы. Эти изменения сопровождались устойчивым снижением уровня, циркулирующего эндогенного уабаина и увеличением уровня ТБК-активных продуктов. Уровень кортикостерона, редокс статус и активность лактатдегидрогеназы не изменялись. Гипоксия в условиях in vitro в течение 15 мин вызывала аналогичную по величине гиперполяризацию диафрагмальных мышц, которая, однако, была обратимой при реоксигенации карбогеном. VI. Влияние преднизолона на уровень клаудинов в ткани мозга. Впервые в ткани мозга, помимо уплотняющих клаудинов-1, -3, -5, участвующих в организации гематоэнцефалического барьера, обнаружен также порообразующий клаудин-2, что важно для понимания механизма регуляции ионного и водносолевого баланса в гематоэнцефалическом барьере. Внутримышечное введение преднизолона (70 мг/кг) в течение семи суток модулирует экспрессию клаудинов-1, -2 и -3 без изменения их локализации в кровеносных сосудах. Учитывая, способность глюкокортикоидов модулировать Na,K-АТФазу, эти данные дополнительно подтверждают возможность функциональной связи между Na,K-АТФазой и клаудинами in vivo. Заключение. В опытах с новыми экспериментальными моделями функциональных нарушений и воздействий получены дополнительные подтверждения высокой степени пластичности а2-изоформы Na,K-АТФазы в мышечной ткани по сравнению с функционально стабильной а1- изоформой. Клаудин-1, экспрессируемый всеми эпителиальными клетками, характеризуется гораздо большей способностью к адаптивному ремоделированию по сравнению с прочими исследованными клаудинами. Опыты с дестабилизацией липид-упорядоченной фазы плазматической мембраны подтверждают важность липидного окружения в такой функциональной специфичности а2-изоформы Na,K-АТФазы и клаудина-1. Результаты подтверждают также физиологическую значимость функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов, в частности в условиях эндотоксемии
Игорь Ильич Кривой, руководитель - 30%
Виолетта Васильевна Кравцова, ответственный исполнитель - 24%
Александр Георгиевич Марков, ответственный исполнитель - 23%
Арина Александровна Федорова, ответственный исполнитель - 23%
Acronym | RSF_RG_2018 - 4 |
---|
Status | Finished |
---|
Effective start/end date | 12/05/21 → 31/12/21 |
---|