Изучение роли изоформ-специфичности функционирования и взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов: I. Роль липидного окружения. На модели бокового амиотрофического склероза (FUS) выявлено снижение плотности распределения а2-изоформы в диафрагмальной мышце мышей FUS, аналогичное обнаруженному нами ранее у мышей с моделями дисферлинопатии и миодистрофии Дюшенна (Bla/J и mdx). Таким образом, у всех трех моделей (FUS, Bla/J и mdx), принципиально отличающихся по молекулярным механизмам нарушений двигательной активности, наблюдается сходное нарушение мембранной локализации а2-изоформы Na,K-АТФазы в диафрагмальной мышце. Установлено, что влияние частичного удаления мембранного холестерина с помощью MbCD на распределение а2-изоформы намного сильнее выражено у мышей FUS. Опыты с применением флуоресцентного аналога церамида выявили нарушение механизма везикулярного транспорта церамида у мышей FUS. Применение MbCD в культуре клеток гладких мышц A7r5 подтвердило, что функциональное взаимодействие а2- изоформы Na,K-АТФазы с молекулярным окружением, важные для реализации внутриклеточного Ca2+ сигналинга, существенно зависит от мембранного холестерина и реализуется в специализированных микродоменах плазматической мембраны. При внутривенном введении MbCD in vivo изменений барьерных свойств ткани тощей и толстой кишки не обнаружено. Однако выявлена способность MbCD модулировать экспрессию клаудинов-1 и -5 в эндотелии кровеносных сосудов головного мозга. При остром (in vitro) применении MbCD зарегистрировано увеличение тока «короткого замыкания» в ткани тощей кишки, которое может быть связано с изменением активности Na,K-АТФазы и косвенно указывает на роль липидного окружения в модуляции функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов. II. Моделирования гравитационной разгрузки. Однократное введение уабаина (1 мкг/кг) неспособно предотвращать вызываемую вывешиванием деполяризацию мембраны в камбаловидной мышце крысы. Только хронически циркулирующий уабаин способен модулировать электрогенную активность Na,K-АТФазы и электрогенез мышцы, что может быть основой протективных свойств уабаина в условиях моделирования гравитационной разгрузки. Напротив, в тканях тощей и толстой кишки, а также лобных долей головного мозга, уже при однократном введении уабаина проявлялась его способность модулировать экспрессию клаудинов-1, -2, -5 и окклюдина и предотвращать вызываемые вывешиванием нарушения в тканях кишки. III. Моделирования эндотоксемии. Уабаин (10 нМ) способен предотвращать вызванное липополисахаридами (LPS) нарушение барьерных свойств монослоя клеток линии IPEC-J2 за счет увеличения уровня «уплотняющих» клаудинов-1 и -3 без изменения уровня клаудина-5. Данные подтверждают функциональную значимость взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов в условиях моделирования эндотоксемии in vitro. IV. Ионизирующее излучение. Анализ дозо-чувствительности эпителия тощей кишки крысы по изменениям барьерных свойств показал, что оптимальной для дальнейших исследований является доза общего ионизирующего излучения 10 Гр с пострадиационным периодом 72 ч. Наблюдалось увеличение уровня «уплотняющего» клаудина-1 и порообразующего клаудина-2, ткань толстой кишки была сравнительно резистентна к воздействию излучения. В диафрагмальных мышцах этих же крыс выявлена деполяризация сарколеммы, обусловленная предположительно снижением электрогенной активности а2- изоформы Na,K-АТФазы.
V. Моделирование гипоксии. В опытах in vivo с применением барокамеры моделировали условия гипобарической гипоксии в течение 3-х ч при атм. давлении 530 либо 370 мм рт.ст. Гипоксию в условиях in vitro создавали заменой оксигенации перфузирующего раствора карбогеном на азотсодержащую смесь с последующей реоксигенацией. Данные свидетельствуют об изменении барьерных и транспортных процессов в эпителии тощей и толстой кишки крысы только при гипобарической гипоксии. В диафрагмальной мышце гипобарическая гипоксия вызывала долговременную (24 ч) гиперполяризацию сарколеммы за счет увеличения электрогенной активности а2-изоформы Na,K-АТФазы. Эти изменения сопровождались устойчивым снижением уровня, циркулирующего эндогенного уабаина и увеличением уровня ТБК-активных продуктов. Уровень кортикостерона, редокс статус и активность лактатдегидрогеназы не изменялись. Гипоксия в условиях in vitro в течение 15 мин вызывала аналогичную по величине гиперполяризацию диафрагмальных мышц, которая, однако, была обратимой при реоксигенации карбогеном. VI. Влияние преднизолона на уровень клаудинов в ткани мозга. Впервые в ткани мозга, помимо уплотняющих клаудинов-1, -3, -5, участвующих в организации гематоэнцефалического барьера, обнаружен также порообразующий клаудин-2, что важно для понимания механизма регуляции ионного и водносолевого баланса в гематоэнцефалическом барьере. Внутримышечное введение преднизолона (70 мг/кг) в течение семи суток модулирует экспрессию клаудинов-1, -2 и -3 без изменения их локализации в кровеносных сосудах. Учитывая, способность глюкокортикоидов модулировать Na,K-АТФазу, эти данные дополнительно подтверждают возможность функциональной связи между Na,K-АТФазой и клаудинами in vivo. Заключение. В опытах с новыми экспериментальными моделями функциональных нарушений и воздействий получены дополнительные подтверждения высокой степени пластичности а2-изоформы Na,K-АТФазы в мышечной ткани по сравнению с функционально стабильной а1- изоформой. Клаудин-1, экспрессируемый всеми эпителиальными клетками, характеризуется гораздо большей способностью к адаптивному ремоделированию по сравнению с прочими исследованными клаудинами. Опыты с дестабилизацией липид-упорядоченной фазы плазматической мембраны подтверждают важность липидного окружения в такой функциональной специфичности а2-изоформы Na,K-АТФазы и клаудина-1. Результаты подтверждают также физиологическую значимость функционального взаимодействия Na,K-АТФазы и клаудинов, в частности в условиях эндотоксемии