Исследования сенсорных и коммуникационных систем имеют принципиальное значение для оценки параметров адаптации животных и формирования биологического разнообразия. Исследование сенсилл – составная часть изучения коммуникационных процессов у насекомых, что в перспективе открывает путь к управлению их поведением, а также к созданию искусственных сенсоров, воспроизводящих основные черты сенсилл. Широкое сравнительное
исследование сенсилл у чётко очерченного круга родственных таксонов поможет найти признаки, пригодные для целей практической систематики и оценить их филогенетическое значение. Результаты исследования имеют существенное значение для понимания поведения насекомых, поскольку восприятие химических стимулов играет
ключевую роль для его реализации. Сенсиллы насекомых – органы чувств, построенные на основе модификации подвижных щетинок на теле членистоногих. Они необходимы для обеспечения различных типов рецепции, включая тактильную, хеморецепцию, термо- и гигрорецепцию, обеспечивая ориентацию и ольфакторную коммуникацию насекомых и других членистоногих. Такие структуры служат для поиска пищи и полового партнера, ориентации в среде обитания, видового распознавания и изоляции и способствуют выбору оптимальных местообитаний. Таким образом, исследование сенсорных и коммуникационных систем имеет принципиальное значение для оценки параметров адаптации и формирования биологического разнообразия. Кроме того, исследование сенсилл – составная часть изучения коммуникационных процессов у насекомых, что в перспективе открывает путь к управлению их поведением. Широкое сравнительное исследование сенсилл у чётко очерченного круга родственных таксонов поможет найти признаки, пригодные для целей практической систематики и оценить их филогенетическое значение. Результаты исследования имеют существенное значение для понимания поведения насекомых, поскольку восприятие химических стимулов играет ключевую роль для его реализации. Ожидаемые результаты будут важны для расшифровки системы химической коммуникации у насекомых и понимания факторов эволюции коммуникации животных. Исследование даёт возможность перейти от сравнительного описания строения щупиков к выявлению факторов эволюции структуры сенсорных поверхностей. Помимо этого, структурные исследования сенсилл щупиков предваряют дальнейшие исследования функционирования сенсилл ротового аппарата электрофизиологическими методами.
В качестве объектов исследования данного проекта рассматриваются взрослые насекомые из отряда ручейников. Имагинальные стадии этих насекомых характеризуются значительным разнообразием поведенческих реакций, включая ольфакторную и вибрационную коммуникацию, агрегацию, роение и сложное прекопуляционное поведение. Максиллярные и лабиальные щупики их ротового аппарата разнообразны по строению в противоположность щупикам ротового аппарата личинок. Предлагаемый проект направлен на поиски подходов для сравнительного анализа сенсорных поверхностей щупиков имаго ручейников. В первый год проекта для характеристики предполагаемого основного плана строения сенсорного покрова щупиков будут исследованы наиболее генерализованные семейства (Rhyacophilidae, Philopotamidae и Glossosomatidae), семейства с модифицированными щупиками самцов (Limnephilidae, Phrygaenidae, Brachycentridae, Apataniidae, Sericostomatidae) и отдельные продвинутые семейства (Molannidae, Hydropsychidae, Leptoceridae). Во второй год исследования для охвата всех эволюционных ветвей отряда будут дополнительно изучены представители других семейств ручейников из подотрядов Annulipalpia (Dipseudopsidae, Polycentropodidae, Psychomyiidae) и Integripalpia (Calamoceratidae, Odontoceridae, Goeridae, Uenoidae, Lepidostomatidae, Hydrobiosidae), а также получены данные по внутреннему строения сенсилл. Исходно у насекомых щупики ротового аппарата обращены вниз, к субстрату, и предназначены для поиска и анализа пищи, но у ряда семейств ручейников из инфраотряда Plenitentoria (Phryganeiadae, Limnephilidae и др.) щупики самцов укорочены, имеют меньшее число модифицированных сегментов, направлены вверх и, вероятно, имеют другую функцию. Мы предполагаем, что в таком случае они начинают участвовать в восприятии ольфакторной информации и функционально дублируют антенны. Предполагается, что у видов с половым диморфизмом щупиков должно наблюдаться повышенное сходство сенсорных поверхностей антенн и щупиков. Данные по структуре и распределению сенсилл на антеннах самцов были получены нами для этих семейств ранее (Ivanov, Melnitsky, 2011, 2016; Melnitsky, Ivanov, 2011, 2016; Melnitsky et.al., 2018, 2019; Valuyskiy et.al., 2017, 2019, 2020). Также будет проведена оценка возможности применения морфологии сенсилл щупиков для решения таксономических задач. В исследованиях планируется использовать оба пола имаго ручейников, которые потенциально могут использовать щупики в процессах видового и полового распознавания,
Для выполнения проекта планируется сопоставление структуры сенсилл антенн и щупиков, проведение сравнительной оценки количества и паттернов расположения сенсилл. Дальнейшее развитие этого направления исследований с привлечением большого числа видов и исследования функций сенсилл на щупиках даст возможность как понимания закономерностей эволюции сенсорных поверхностей, так и введения в практический обиход новых таксономических признаков, важных для прикладной систематики и филогенетических исследований.
Исходя из основной цели исследования, предполагается решить следующие конкретные задачи.
1. Изучение сенсорного покрова щупиков и выявление исходного состояния сенсилл у представителей архаичных ручейников. Для этого предполагается получить сравнительные данные по базальным семействам Philopotamidae, Rhyacophilidae, Glossosomatidae; два последних семейства ранее выделяли в подотряд острощупиковых – Spicipalpia (Weaver, 1984), но в последнее время принимают в качестве базальных таксонов подотряда Integripalpia (Kjer et al., 2016), а семейство Philopotamidae является наиболее примитивным в подотряде Annulipalpia.
2. Сравнение сенсорного покрова щупиков у эволюционно продвинутых и базальных семейств.
Для изучения предпосылок к исчезновению щупиков ротового аппарата будет исследовано строение их сенсилл у представителей семейства Hydropsychidae с особым вниманием к подсемейству Macronematinae, где у ряда видов щупики исчезают.
Сравнение структурных и количественных параметров (размеры и число сенсилл) сенсорной поверхности максиллярных щупиков самцов, где они по положению и структуре сегментов напоминают антенны, и самок с обычными щупиками на материале из семейств Phryganeidae, Limnephilidae, Apataniidae, Brachycentridae и Sericostomatidae позволит ответить на вопрос о сходстве и эволюционном становлении сенсорного покрова щупиков и антенн и возможном функциональном дублировании одних придатков головы другими.
Исследование состояния сенсорной поверхности щупиков у представителей эволюционно продвинутых родственных семейств Leptoceridae и Molannidae, относящихся к наиболее эволюционно продвинутым цельнощупиковым ручейникам из эволюционной ветви Brevitentoria, позволит оценить степень специализации сенсилл у продвинутых семейств при отсутствии развития полового диморфизма щупиков самцов.
Дальнейшее изучение сенсорного покрова щупиков у представителей Dipseudopsidae, Polycentropodidae, Psychomyiidae, Calamoceratidae, Odontoceridae, Goeridae, Uenoidae, Lepidostomatidae и Hydrobiosidae, планируемое на второй год проекта, позволит проследить структурные изменения сенсорного покрова щупиков у представителей всех основных эволюционных ветвей отряда.
3. Анализ полученных данных и сопоставление с уже известными сведениями о сенсорном покрове антенн, брачном поведении ручейников и данными по феромонной продукции имаго. Выполнение этой задачи позволит оценить наличие общих путей формирования сенсорных структур у изучаемых насекомых на основе возможного единого онтогенетического механизма образования сенсорной ольфакторной поверхности в том случае, если будет обнаружено высокое сходство структур сенсорных придатков головы. Особый интерес представляют щупики семейств Leptoceridae, у которых наблюдается редукция сенсилл и ольфакторной функции антенн на фоне развития роевого поведения имаго. В этом случае возможны как сильное развитие сенсилл щупиков с переходом к ним восприятия ольфакторного сигнала, так и параллельное с антеннами ослабление сенсорного аппарата щупиков, что будет проверено полученными данными. У семейства Molannidae наблюдается редукция феромонных желёз самцов и продукция феромонов исключительно самками, в то время как у большинства семейств феромонные железы 5-го стернита брюшка присутствуют у обоих полов; будет проверена гипотеза о возникновении структурной половой асимметрии сенсорного покрова щупиков при появлении половой асимметрии в выработке ольфакторных сигналов.
В итоге будут получены новые данные, позволяющие реконструировать исходный план строения и основные модификации сенсорных структур щупиков для ключевого набора видов, впервые будут сопоставлены сенсорные поверхности антенн и щупиков ручейников, проведено пилотное исследование возможного таксономического значения признаков сенсорного покрова щупиков и намечены подходы к перспективному анализу эволюции коммуникационной системы ручейников.
Широкое сравнительное исследование ультраструктуры рецепторов на щупиках ручейников и анализ их распределения по поверхности члеников проводится впервые. В научной литературе имеются данные по сенсиллам щупиков у немногих видов чешуекрылых и представителей других отрядов насекомых, причем, как правило, эти данные ограничены небольшим числом исследованных видов из родственных семейств без сравнительного количественного и филогенетического анализа. Выбор материала для исследования зачастую обусловлен значением конкретного вида как вредителя. Наш подход отличается сочетанием нескольких ультраструктурных методов (сканирующая и трансмиссионная микроскопия), применённых к широкому набору видов разных семейств с последующей интеграцией полученных данных и их статистической обработкой с привлечением данных по поведению и коммуникации имаго. Результаты анализа будут применены для оценки разнообразия сенсорных поверхностей щупиков в пределах целого отряда, включая все наиболее важные эволюционные направления. Такой подход положительно зарекомендовал себя при исследовании антенн и впервые будет применён к сенсиллам щупиков. Использование сканирующей электронной микроскопии в исследованиях структуры поверхности придатков тела ручейников ранее было направлено преимущественно на получение качественных данных. Количественная оценка параметров сенсилл щупиков для большого диапазона видов будет применена впервые как для ручейников, так и насекомых в целом.
Наш коллектив имеет многолетний опыт в исследовании сенсорных структур антенн и коммуникации ручейников. Сравнительные исследования щупиков ручейников в сопоставлении с антеннами и коммуникационными аспектами жизнедеятельности насекомых – новые темы исследований для нашего коллектива. Также новым для нас является сравнение сериальных придатков головы между собой, что потребует совершенствования методов исследования. Мы модифицировали подход к подбору материала, в котором особо рассмотрены виды с половым диморфизмом, что в исследованиях антенн не применялось. Нами ранее было выполнено небольшое исследование апикальных зон на щупиках ручейников (Иванов и др., 2018); оно было направлено на решение только таксономических задач, без привлечения данных по антеннам, поведению, феромонной продукции и без использования количественных методов. Опыт этого исследования свидетельствует о выполнимости поставленных задач нашим коллективом и будет использован в предлагаемом проекте, который направлен прежде всего на сравнительные исследования в области коммуникации имаго ручейников. Работы по щупикам будут проведены по освоенным методикам на имеющемся оборудовании Санкт-Петербургского государственного университета, что в сочетании с приобретённым опытом обеспечат выполнение проекта на высоком уровне. Для исследования у нас имеется достаточный материал, собранный в ряде экспедиций по России и за рубежом. Аналогичные исследования, проводимые нами ранее на антеннах ручейников, показали достижимость поставленных задач.

Современное состояние исследований по данной проблеме
Максиллярные и нижнегубные щупики, как и антенны являются сенсорными придатками головы насекомых и входят в их основной план строения. Известно, что антенны насекомых ответственны за ольфакторную рецепцию, в то время как щупики отвечают преимущественно за контактную хеморецепцию при анализе субстрата и оценке пищи (Hansson, 1995; Chapman, 1998; Roitberg, Isman, 1992; Cardé, Millar 2004; Leal, 2013 и др.). Антенны, с располагающимися на них рецепторными кутикулярными структурами, выполняют важную роль для модуляции брачного поведения, воспринимая феромонные сигналы, чему посвящены многочисленные исследования (обзоры: Schneider, 1964; Callahan, 1975; Breer, 1997). Ольфакторные сигналы могут также восприниматься ротовыми придатками. Так, рецепторы лабиальных щупиков у некоторых видов чешуекрылых реагируют на запах углекислого газа (Gurenstein et al., 2004; Ning et al., 2016, и др.). У кровососущих комаров ольфакторную функцию выполняют максиллярные щупики, реагирующие на запах углекислоты (Syed, Leal, 2007); эти щупики у других двукрылых, например, дрозофил (Charro, Alcorta, 1994) также воспринимают ольфакторные стимулы. В щупиках саранчи присутствуют те же рецепторные протеины, что и в антеннах этих насекомых (Pregitzer et al., 2017), что указывает на возможность восприятия ольфакторной информации. У некоторых насекомых щупики играют важную роль в процессах внутривидовой коммуникации и брачного поведения, например, у тараканов (Barth, 1964; Greven, Zwanzig, 2013). Есть данные, что некоторые виды ручейников, такие как Agapetus fuscipes (Glossosomatidae), также используют щупики в актах прекопуляционного поведения (Ivanov, Rupprecht, 1993). Таким образом, щупики ротового аппарата, помимо анализа пищи, могут участвовать в других типах рецепции и в формировании поведенческих ответов на различные химические стимулы, включая ольфакторную рецепцию.
Рецепторами для химических стимулов служат различные типы сенсилл, строение которых очень разнообразно в пределах насекомых, при этом наибольшее разнообразие наблюдается в строении кутикулярных частей сенсиллярных образований (Snodgrass, 1935; Иванов, 2000; Синицина, Чайка 2006; Чайка, 2010). Напротив, строение чувствительных и вспомогательных клеток в составе рецепторных структур, а также их число и локализация достаточно консервативны и сохраняют относительное однообразие (Елизаров, 1978). Поэтому именно кутикулярные структуры наиболее перспективны для изучения эволюционных процессов и выявления эволюционных тенденций. Разнообразию и номенклатуре сенсилл насекомых посвящены многочисленные публикации (обзоры: Snodgrass, 1935; Slifer, 1970; Tozer, 1982; Елизаров, 1978; Иванов, 2000; Ljungberg, Hallberg, 1992; Faucheux 2004; Синицына, Чайка, 2006); тем не менее, до сих пор это разнообразие до конца не познано и происходят открытия новых типов сенсилл, например, псевдоплакоидных (Ivanov, Melnitsky, 2011, 2016). У ручейников клеточное строение псевдоплакоидных сенсилл изучено на примере представителей архаичного семейства Philopotamidae (Melnitsky et al., 2019). Кроме того, важной задачей является исследование общей структуры сенсорных поверхностей придатков тела, включая антенны и щупики, которые могут быть выполнены на таксонах с большим разнообразием сенсилл и достаточно понятными филогенетическими связями. Наличие сенсорных полей антенн с модифицированным набором сенсилл (Ivanov et al., 2018a; Valuyskiy et.al., 2017, 2019, 2020) и пальпарных органов на концах щупиков (Иванов, 2000; Ivanov et al., 2018b) не исчерпывает всего многообразия вариантов распределения сенсилл, где возможны находки новых паттернов.
Ручейники (Trichoptera) и чешуекрылые (Lepidoptera) известны как пара сестринских отрядов, отношения между которыми в своё время служили для отработки концепций кладистического анализа (Hennig, 1969). В настоящее время ручейники являются восьмым по численности отрядом насекомых (более 16000 видов; Morse, 2021), который вместе с чешуекрылыми объединяют в надотряд Amphiesmenoptera; вместе с сестринским надотрядом Antliophora (отряды Diptera, Mecoptera, Siphonaptera) он входит в состав мекоптероидного комплекса (Kristensen, 1984). Структура отряда ручейников в достаточной мере устоялась: в его пределах имеются две основные линии эволюции – подотряд кольчатощупиковые (Annulipalpia) и подотряд цельнощупиковые (Integripalpia), установленные ещё А. В. Мартыновым (1924). Положение наиболее базальных семейств в системе долгое время вызывало дискуссии (Ross, 1956, 1967; Weaver, 1984, 1992; Wiggins, Wichard, 1989; Ivanov, 1997; Frania Wiggins 1997; Morse, 1997; Wiggins, 2004; Kjer et al., 2002; Ivanov, Sukatcheva, 2002). Сравнительно-морфологическими методами была показана парафилетичность подотряда острощупиковых (Spicipalpia), предложенного Уивером (Weaver, 1984) для наиболее базальных семейств филогенетической схемы, и было показано родство семейств Glossosomatidae и Hydroptilidae из этого подотряда c Integripalpia (в расширенном понимании подотряд предложено назвать Phryganeina), а Rhyacophilidae и Hydrobiosidae с Annilipalpia (подотряд Hydropsychina), включая и ископаемый материал (Ivanov, 1997; Ivanov, Sukatcheva, 2002). В последние годы структуры, участвующие в химической коммуникации, описаны нами на сенсорных придатках головы и брюшке у ископаемых ручейников из семейств Glossosomatidae, Yantarocentridae и Hydrobiosidae (Ivanov, Melnitsky, 2006, 2016, 2017). У Yantarocentridae сенсорные структуры антенн служат важным дополнением диагноза семейства.
Морфологические особенности щупиков широко используются в диагностике и определении насекомых многих отрядов, в том числе и таких крупных, как чешуекрылые (Lepidoptera) и жесткокрылые (Coleoptera), как правило, на уровне родов и семейств. Тем не менее, сравнительно-морфологические данные по строению сенсорного вооружения щупиков редко обсуждаются в литературе. В качестве примеров можно привести обзорную работу В. П. Иванова (2000) и его публикации по отдельным видам насекомых (Иванов и др., 1969), исследование по сенсиллам личинок долгоносиков (Томкович, Чайка, 2001), публикации Шовэна и Фошо по сенсиллам ротового аппарата чешуекрылых (Chauvin, Faucheux, 1981; Faucheux, 2005), монографию по морфологии хеморецепторных органов насекомых (Синицина, Чайка, 2006). Ультраструктура рецепторов подробно изучена лишь для небольшого числа видов. Недостаток данных по морфологическому разнообразию и сенсорному вооружению щупиков препятствует пониманию эволюции сенсорных комплексов ротового аппарата и затрудняет адекватное использование пальпальных структур в филогенетических исследованиях в некоторых отрядах насекомых (Ivanov, 1997; Frania, Wiggins, 1997). Наибольшее влияние строение щупиков оказало на систему отряда ручейников (Trichoptera), где их морфологические особенности неоднократно использовали для разграничения высших таксономических категорий (Kolenati, 1848, 1851, 1859; Мартынов, 1924; Weaver, 1984 и др.). Особые зоны на щупиках широко распространены среди насекомых; они носят общее название пальпальные органы (Иванов, 2000) и сильно различаются по структуре, численности и положению: к ним относятся апикальные сенсорные зоны, органы Рата на лабиальных щупиках чешуекрылых, латеральные сенсорные ямки пальп у некоторых видов ручейников и вислокрылок, скопления сенсилл у некоторых высших цельнощупиковых из семейств Limnephilidae, Brachycentridae и Lepidostomatidae и ряд других структур.
Новые данные в исследованиях последних лет демонстрируют широкое разнообразие кутикулярных структур на сенсорных придатках головы у представителей отряда ручейников, в первую очередь это касается антеннальных сенсилл. Нами обнаружено более 25 типов и подтипов этих структур в отряде Trichoptera (Ivanov, Melnitsky, 2011, 2016; Melnitsky, Ivanov, 2011, 2016; Melnitsky et.al., 2018; Valuyskiy et.al., 2017, 2019, 2020). В ряде зарубежных работ, посвящённых строению сенсилл чешуекрылых (Faucheux, 2007), установлено наличие сходных структур внутри двух отрядов и в то же время подчеркнута необходимость дополнительного исследования взаимосвязей и параллелизмов в эволюции сенсиллярных структур у этих таксонов. Недавнее исследование шведских коллег (Yuvaraj et al., 2018) подтвердило сходство сенсилл ручейников и примитивных чешуекрылых.
В отличие от антенн, сенсиллам щупиков имаго уделяется мало внимания. В середине прошлого века были выполнены исследования по реакции ротового аппарата при стимуляции щупиков у 4 видов ручейников из семейств Phryganeidae и Limnephilidae раствором сахаров (Frings, Frings, 1956). Структуры ротового аппарата ручейников, включая щупики, были исследованы Крайтоном (Crichton, 1957), однако он не рассматривал сенсорные структуры. Имеется широкий круг таксономических работ, начиная со старых работ Коленати (Kolenati, 1851) и Мартынова (1924), которые используют признаки щупиков имаго, но не рассматривают их сенсорное вооружение. Сравнительный анализ структур сенсилл на щупиках ручейников, за исключением апикальной зоны (Ivanov et al., 2018), до сих пор никем не был проведён, и в этом направлении может быть выполнено исследование с установлением отечественного научного приоритета, развивающего намеченное нами научное направление.
Группа Amphiesmenoptera характеризуется широким набором коммуникационных систем (Ivanov, 1993), что даёт уникальную возможность исследования влияния разных типов поведения на структуру сенсорных органов. Ведущую роль у этих насекомых занимает химическая коммуникация (Ivanov, Melnitsky, 1999, 2002, 2014). Ранее для представителей всех основных эволюционных ветвей Trichoptera было произведено сравнительное исследование структур, связанных с продуцированием и выделением химических веществ, входящих в сложные феромонные смеси этих насекомых и установлена химическая структура компонентов феромонных смесей для 49 видов ручейников (Resh, Wood, 1985; Solem, 1985; Löfsted et al., 1994, 2008; Bjostad et al., 1996; Ivanov, Melnitsky, 1999, 2014; Иванов и др., 2000, 2008; Bergmann, 2002; Bergmann et al., 2001, 2002, 2004; Syrnikov et al., 2005; Melnitsky, Deev, 2009; Melnitsky, Ivanov, 2011). Помимо феромонной коммуникации, у ручейников обнаружены вибрационные сигналы в половом поведении (Ivanov, Rupprecht, 1993; Иванов, 1994). В семействах Leptoceridae, Calamoceratidae, Stenopsychidae, Hydropsychidae распространено роение, когда самцы образуют скопления в полёте и визуально или при помощи феромонного сигнала ищут пролетающих самок (Solem, 1978; Иванов, 1985; Ivanov, 1993; Löfsted et al., 1994).
Таким образом, в настоящее время идёт накопление материала, показывающее сложность коммуникационных процессов у ручейников, однако эволюция ольфакторной коммуникационной системы недостаточно ясна как для ручейников, так и для других отрядов насекомых ввиду недостатка комплексных сравнительных исследований. До сегодняшнего времени имеются лишь предварительные данные изучения сенсилл антенн у близкородственных видов в пределах одного рода или разных популяций одного вида (Валуйский и др., 2017; Valuyskiy et.al., 2019), где показана возможность применения данных об антеннальных структурах в таксономии и филогенетических построениях на рецентном и, в отдельных случаях, ископаемом материале (Ivanov, Melnitsky, 2016). Что касается сенсилл щупиков ручейников, их сравнительный анализ в таксономических целях был выполнен только для апикальных групп рецепторов (Ivanov et al., 2018) у небольшого круга семейств. Основной план строения сенсорной поверхности щупиков ручейников и разнообразие сенсилл на максиллярных и лабиальных щупиках не обсуждались в научной литературе. Отсутствуют представления о сенсорном вооружении ротовых придатков при возникновении полового диморфизма или редукции щупиков.
В области сравнительных исследований сенсилл ручейников ранее работали французские исследователи, изучавшие сенсиллы антенн ручейников и чешуекрылых: К. Дени в 1980-х годах (Denis, 1984), позднее Мишель Фошо (M. Faucheux) из лаборатории эндокринологии общественных насекомых Нантского университета. Известны работы шведских коллег (Eric Hallberg, Bill Hansson и др.) по сенсиллам антенн, а в недавнее время ультраструктура сенсилл антенн ручейников и чешуекрылых была исследована в Швеции (Лундский университет) под руководством проф. Лёфстеда (Yuvaraj et al., 2018). Широко известны исследования сенсилл на кафедре энтомологии Московского государственного университета, однако работающие там коллеги изучают сенсиллы жесткокрылых и других насекомых, не захватывая ручейников.
Анализ литературных данных показывает, что запланированное исследование поможет наметить подходы для более широкого использования рецепторных структур в решении проблем филогении ручейников и эволюции сенсорных систем насекомых. Впервые будут выполнены сравнительные ультраструктурные исследования сенсилл на максиллярных и лабиальных щупиках имаго. Количественный анализ сенсилл и реконструкция основного плана строения сенсорного аппарата щупиков в рамках целого отряда насекомых будут выполнены впервые, что в дальнейшем позволит существенно облегчить проведение исследований внутривидовой коммуникации ручейников. На данный момент имеются все предпосылки для проведения исследования сенсорных структур щупиков ручейников и родственных им таксонов. Наша заявка представляет собой пилотный проект для создания основы дальнейших исследований в области сравнительного анализа сенсорного вооружения щупиков ручейников.
Сбор и охват материала
Для выполнения проекта предполагается изучить не менее 30 видов насекомых из отряда ручейников (Trichoptera). Такой широкий круг объектов для сравнительного анализа структуры поверхности щупиков насекомых будет использован впервые. Имеющиеся в нашем распоряжении материалы указывают на относительную стабильность микроструктур ручейников, поэтому их внутривидовая изменчивость будет проверена на малых выборках. Помимо сбора нового материала, будут использованы материалы прежних лет из коллекции кафедры энтомологии СПбГУ. Сбор материала будет осуществляться с использованием общепринятых методик: светоловушек и энтомологических сачков. Насекомые будут зафиксированы в 70% этаноле, фиксирующей смеси Буэна, в 10% формалине, а также в глицерине, в зависимости от поставленных задач. Спиртовой материал будет использован в сканирующей электронной микроскопии, остальные три варианта фиксации будут применены для гистологических методик с окрашиванием препаратов для перспективных исследований второго года работы.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM). Подсчёт количества и измерение сенсилл на антенне с использованием программных средств измерения.
Для оценки разнообразия сенсорных структур планируется применять препараты, изготовленные на основе спиртового материала. Все образцы после извлечения из 70% этанола будут высушены, после чего помещены на столики для сканирующей электронной микроскопии и покрыты 20-нм слоем мономолекулярного золота с помощью вакуумной напылительной станции Leica EM SCD500. Данная методика является общепринятой и ранее применялась к различным биообъектам для решения аналогичных задач. Обработанные образцы на столиках сохраняются в зафиксированном виде, что позволяет использовать их повторно в дальнейших исследованиях.
Для общей оценки особенностей строения щупиков и подсчёта количества сенсилл будет использован сканирующий электронный микроскоп JEOL NeoScope JCM-5000, на котором будут изготовлены серийные фотографии поверхности сегментов. Фотографии сенсорных поверхностей и отдельных сенсилл, предназначенные для публикаций, будут сделаны на микроскопе Tescan MIRA3, который даёт более высокое разрешение.
Измерение размеров сенсилл и подсчёт их количества будет выполнено по серийным фотографиям в бесплатной программе ImageJ 1.50. Полученные данные формируются в виде электронных таблиц, которые в дальнейшем будут обработаны с помощью статистического пакета программы Microsoft Excel 2019, в котором выполняется анализ количественных показателей и закономерностей распределения сенсилл на поверхности тела.

Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM)
Трансмиссионная (просвечивающая) электронная микроскопия будет использована для уточнения типов сенсилл и предварительной оценки их модальности в соответствии с современными данными по функциональным свойствам рецепторов насекомых и запанирована на 2-й год исследования; для её выполнения необходим сбор и фиксация свежего материала, что будет сделано в 2022 году. После определения разнообразия сенсилл на щупиках методами сканирующей электронной микроскопии в 2022 году, особенно в случае обнаружения необычных типов сенсилл, будут изготовлены препараты для ТЕМ участков поверхности щупиков, включающих необходимые сенсиллы. Для изготовления препаратов будет использован специально собранный свежий фиксированный материал, который будет контрастирован осмием с дальнейшей заливкой в полимерную смолу и изготовлением ультратонких срезов, которые позволят установить детали тонкого строения сенсилл. Блоки полимера будут обрезаны триммером Leica EM TRIM2. Срезы будут сделаны с помощью ультрамикротома Leica EM UC7 и исследованы на трансмиссионном электронном микроскопе Jeol JEM-1400 STEM.

Изготовление постоянных гистологических препаратов щупиков и их окраска, изучение особенностей микроструктуры сенсилл
Дополнительно к основному методу исследований (изучение наружной поверхности щупиков при помощи сканирующей электронной микроскопии) в 2023 году планируется исследование поверхности антенн методами световой микроскопии, как на тотальных препаратах, так и на срезах (изготовление гистологических препаратов). Данный раздел работы будет выполнен с использованием стандартных гистологических методик, модифицированных с учётом специфики изучаемого объекта, в частности, наличия у насекомых твёрдой склеротизованной кутикулы. В качестве временных фиксативов при сборе материала будут применены жидкость Буэна и формалин. Для подготовки препаратов планируется помещать образцы в глутаральдегид или параформальдегид с последующей отмывкой в коллидиновом буфере и заливкой в полимерный компаунд EPON-812. Эта модификация метода позволит избежать искажений и повреждения препарата при изготовлении срезов. В ходе работы будет производиться серия срезов фиксированного и окрашенного препарата на ультратоме Leica EM UC7. На окрашенных препаратах будет дана оценка числа нейронов для более надёжной типологизации сенсилл, проверено влияние пространственного расположения тел нейронов на организацию структуры сенсорной поверхности, визуализированы структуры тел нейронов и нервных окончаний, намечены возможные места введения электродов для дальнейших физиологических исследований.
Вся перечисленная аппаратура, включая электронные микроскопы и вакуумную напылительную станцию, имеется в Ресурсном центре СПбГУ.

Анализ количественных данных
Измерения и подсчёты будут выполнены на основе графических файлов фотографий, полученных методом сканирующей электронной микроскопии. Подсчёт и анализ количественных показателей (количество сенсилл и их размеры) будет выполнен с помощью свободно распространяемой программы ImageJ 1.50. База данных количественных параметров сенсилл будет создана в виде серии электронных таблиц MS Excel 2019. Анализ данных планируется провести с помощью оригинального набора скриптов на языке программирования для статистической обработки данных R версии 3.6.2, ранее использованных для аналогичных целей в исследовании антеннальных сенсилл (Valuyskiy et.al., 2019). Предварительный анализ характера распределения выборки планируется выполнить для того, чтобы определить, является ли распределение нормальным. В зависимости от этого будет выбран критерий для сравнения групп количественных показателей между собой.

Общий план работ на весь срок выполнения проекта

2022 год.
Изучение сенсорного покрова щупиков у представителей архаичных ручейников (Rhyacophillidae, Glossosomatidae, Philopotamidae), а также выбранных видов из семейств Hydropsychidae, Phryganeidae, Limnephilidae, Apataniidae, Brachycentridae, Sericostomatidae, Molannidae, Leptoceridae методами оптической и сканирующей электронной микроскопии, сбор материала для гистологических исследований. Подготовка материала для 5 статей, сдача в печать 3 статей в рейтинговые журналы по структурам сенсилл у архаичных семейств ручейников.

2023 год.
Изучение сенсорного покрова щупиков у представителей Dipseudopsidae (Dipseudopsis, 1 вид), Polycentropodidae (Neureclipsis, Plectrocnemia, 2 вида), Psychomyiidae (Psychomyia, 1 вид), Calamoceratidae (Calamoceras, 1 вид), Odontoceridae (Odontocerum, 1 вид), Goeridae (Goera, Silo, 3 вида), Uenoidae (Neophylax, 1 вид), Thremmatidae (Tremma, 1 вид), Lepidostomatidae (Lepidostoma, 1 вид), Hydrobiosidae (Apsilochorema, Tanorus, 2 вида) методами сканирующей электронной микроскопии. Исследование сенсорного вооружения щупиков методами ТЕМ (Rhyacophilidae, Philopotamidae, Limnephilidae): изготовление препаратов и исследование ультраструктуры сенсилл с помощью трансмиссионной электронной микроскопии.
Подготовка 3 статей в рейтинговые журналы по сенсиллам семейств продвинутых ручейников, сравнительному анализу сенсорных поверхностей и путей их специализации и статья по внутреннему строению сенсилл на щупиках ручейников.

У коллектива участников проекта имеется существенный задел в области изучения коммуникационных систем и в проведении сравнительных исследований структурной организации ручейников. За последние годы участниками проекта накоплено огромное количество новых морфологических, ультраструктурных, физиологических и поведенческих данных и обширный сравнительно-морфологический материал в области коммуникации и сенсорных систем ручейников. Эти данные относятся как к строению феромонных желёз и ассоциированных с ними кутикулярных выводных структур Amphiesmenoptera (Мельницкий, 2004; Ivanov, Melnitsky, 1999, 2002), так и к рецепторным структурам, располагающимся на голове у этих насекомых (Мельницкий, Иванов, 2010; Ivanov, Melnitsky, 2016; Melnitsky, Ivanov, 2011; 2016; Melnitsky et.al., 2018, 2019; Valuyskiy et.al., 2017, 2019, 2020a, b), а также исследованию состава феромонов (Bergmann et al., 2001, 2002, 2004; Syrnikov et al., 2005; Löfstedt et al., 2008; Иванов, Мельницкий, 2014), механизмов коммуникационного поведения Trichoptera (Иванов и др., 2000, 2008; Жуковская и др., 2006; Syrnikov et al., 2005; Löfstedt et al., 2008). Использование ископаемого материала позволило впервые проследить становление химической коммуникации в этой группе насекомых (Мельницкий 2004; Ivanov, Melnitsky, 2006, 2014).
Впервые выполненное сравнительно-морфологическое исследование вершин щупиков у ручейников из разных эволюционных линий отряда, а также чешуекрылых и скорпионовых мух (Ivanov et al., 2018) методами световой и электронной микроскопии у 81 вида из отряда Trichoptera, 6 – Lepidoptera и 2 – Mecoptera, выявило 13 типов сенсилл на концевых члениках щупиков. Изучение морфологических особенностей терминальных отделов щупиков ротового аппарата показало высокую степень дифференциации апикальной сенсорной зоны у представителей семейств в группе Spicipalpia; наличие апикальной сенсорной зоны в этой группе признано плезиоморфным признаком по отношению к другим группам ручейников.
Анализ микроструктур на поверхности антенн позволил участникам проекта впервые обнаружить специализированные сенсорные поля, которые независимо появляются в разных эволюционных ветвях отряда и их локализация и строение являются перспективными для целей изучения таксономии и филогении (Ivanov, Melnitsky, 2011, 2016; Ivanov et al., 2018; Melnitsky, Ivanov, 2011). Показаны многообразие и пространственная организация кутикулярных структур сенсилл, выделен новый уникальный тип микроструктур — псевдоплакоидные сенсиллы. Данный тип обнаружен только у ручейников и примитивных чешуекрылых и, возможно, является синапоморфией двух отрядов (Ivanov, Melnitsky, 2011, 2016). В морфологических и поведенческих исследованиях продемонстрирована асимметрия феромонной коммуникации, которая во многих группах связана с половым диморфизмом в строении антеннальных сенсилл. Также участники проекта последние десятилетия интенсивно работают в области эволюции, палеонтологии и таксономии ручейников (Ivanov, Sukatsheva, 2002; Ivanov, Melnitsky, 2006, 2010, 2014 и др.).
Авторы впервые использовали сенсорные структуры антенн, щупиков и брюшка при работе с ископаемым материалом. При описании нового семейства Yantarocentridae из балтийского янтаря важным признаком, позволяющим установить родственные отношения этого семейства, оказались сенсорные поля антенн и признаки щупиков, включая их тонкую структуру (Ivanov, Melnitsky, 2016). В дальнейшем при работе с ископаемыми мы описывали структуры сенсилл у ручейников из таймырского янтаря (Ivanov, Melnitsky, 2017).
Разработанные авторами проекта методы количественной оценки сенсорных структур придатков насекомых структур при помощи обработки серийных фотографий, полученных на сканирующем электронном микроскопе, с использованием программного пакета ImageJ 1.50 впервые позволили сопоставить характер распределения разных типов сенсилл на антеннах широкого круга видов ручейников (Ivanov et al., 2018; Valuyskiy et.al., 2017, 2019, 2020а, b).