Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
Тихоходки (Tardigrada) – древняя группа беспозвоночных животных, в настоящее время рассматриваемая как отдельный таксон высокого ранга (тип), сохраняющая в своей организации многие признаки форм, вероятно давших начало кладе настоящих членистоногих (Euarthropoda). В отличие от другой подобной группы – онихофор, существующей в виде ограниченного числа видов в очень узком спектре местообитаний, тихоходки являются процветающим таксоном (описано более 1400 видов, но это безусловно крайне заниженная оценка), заселившим практически все типы местообитаний. Тихоходки выработали уникальные формы и механизмы анабиоза, по разнообразию которых эта группа не имеет себе равных. Они способны выживать в совершенно экстремальных условиях среды, вплоть до условий открытого космоса. Тихоходки выработали массу уникальных адаптаций, многие из которых помимо фундаментального представляют и совершенно практический интерес. Например, показано, что внедрение гена белка, обеспечивающего защиту генома тихоходок при ангидробиозе, в геном лейкоцитов человека приводит к значительному повышению устойчивости этих клеток к воздействию проникающей радиации, а при внедрении этого же гена в геном растения возрастает устойчивость к химическим загрязнениям.
Тихоходки – микроскопические животные, широко распространенные в природе. В наземных местообитаниях тихоходки связаны с субстратами, содержащими капельно-жидкую пресную воду (почвой, мхами и лишайниками). В этих локациях тихоходки могут достигать значительной численности – до 537000 экз./м2 (Ito, 1999), что сравнимо с показателями для панцирных клещей и коллембол (Nelson et al., 2018). Учитывая эти данные, тихоходки несомненно играют важную, но до сих пор недооцененную, роль в функционировании сообществ, особенно тех, в которых мохово-лишайниковая растительность является доминирующей формой – например сообщества тундры и высокогорные биотопы. В частности, показана важная роль тихоходок в восстановительных процессах почвообразования после интенсивного антропогенного воздействия.
Изучение этой крайне интересной и эволюционно важной группы организмов в значительной степени тормозится чрезвычайно слабой изученностью ее видового разнообразия. В мире существуют лишь отдельные регионы, видовой состав тихоходок в которых достаточно хорошо исследован (например, Сицилия, где работы в этом направлении систематически ведутся начиная с 60х годов), однако нигде в мире не проводилось маштабных фаунистических исследований тихоходок с использованием современных методов молекулярной таксономии. В этом отношении особенно выделяется как "терра инкогнита" территория Российской Федерации, в пределах которой разнообразие тихоходок вообще изучено крайне слабо. Систематические исследования проводились лишь в прошлом веке на территории Европейской части РФ в 80-90х гг. Б.И. Бисеровым и ведутся начиная с 90-х годов Тумановым, в то время как остальные регионы "накрыты" лишь единичными исследованиями, основная часть которых основана на случайных сборах, передававшихся различным, часто зарубежным исследователям. Для азиатской части России имеются лишь единичные публикации. Планомерным, систематическим изучением разнообразия тихоходок на всей территории РФ не занимался никто и никогда.
Актуальность и значимость предлагаемого проекта простираются гораздо шире простого изучения видового разнообразия. С приходом методов молекулярной таксономии радикально изменились подходы к систематике и трактовке понятия "вида" практически у всех микрометазоа. Эти изменения особенно наглядно затронули именно тихоходок. На смену концепции широко распространенных изменчивых видов пришла концепция локальных, хорошо обособленных близких видов (различаемых по весьма тонким морфологическим признакам, которые используются в совокупности с молекулярными данными) и видов-двойников (различаемых исключительно молекулярно-генетическими методами). В настоящее время показано, что практически все «широко распространенные виды», указанные для фауны России (а это значительная часть известного видового разнообразия), являются, в действительности, комплексами видов. Этот подход, по сути знаменующий собой переход от чисто морфологической или чисто молекулярной к так называемой "интегративной" таксономии, представляет собой принципиально важный шаг вперед в изучении проблемы вида у микрометазоа, но он же заставляет совершенно по-новому переосмысливать и во многих случаях - перепроверять практически все ранее накопленные данные. В этой ситуации, работу по изучению видового разнообразия тихоходок России следует начинать практически заново. Достаточно сказать, что на сегодняшний момент для всей территории России современными методами, включающими ДНК баркодинг, показано наличие всего лишь трёх видов тихоходок. Необходимо получить новые современные надежные данные, которые позволят оценить видовое богатство этой группы на территории РФ с точки зрения современных взглядов на проблемы видового разнообразия и генетической структуры видов тихоходок.
Есть и еще одна актуальная фундаментальная проблема, в решении которой можно будет в очень значительной степени продвинуться вперед в случае реализации предложенного проекта. Незначительное число видов тихоходок, для которых получены данные по филогенетически значимым генам, не дает на данный момент возможности надежно реконструировать филогению группы. Практически каждое исследование, проводимое с привлечением новых данных по нескольким (а иногда даже единичным) видам приводит к перестройке системы группы. В результате выполнения проекта будет получен беспрецедентно большой объем сиквенсов филогенетически значимых генов тихоходок (18S и 28S рРНК). Добавление такого объема данных в материалы доступные для изучения молекулярной филогении тихоходок позволит достичь очень серьезного прогресса в этой области исследований и решить многие проблемы, в настоящее время тормозящие развитие молекулярной филогении этой группы организмов.
Интенсивность изучения и уровень вовлеченности разных групп организмов в различного рода исследования во многом (если не в основном) определяются количеством исследователей, работающих в этой области, и возможностью привлекать для работы и активно включать в нее молодых исследователей. В свою очередь, эти возможности прямо зависят от наличия удобных, современных и актуальных работ (сводок, ключей, монографий, баз данных), дающих возможность быстро и надежно идентифицировать обнаруженные виды, и разработанных стандартизированных методик по сбору и обработке фаунистического материала, позволяющих проводить сравнение данных, полученных различными исследователями. В настоящее время не существует доступных для отечественных исследователей современных определительных ключей для тихоходок фауны России, что фундаментально препятствует проведению широкомасштабных работ по изучению этих животных. Поэтому поставленные в проект задачи разработки методического комплекса, создания определительных ключей, базы ДНК-баркодов и подготовки определителя тихоходок территории РФ представляются чрезвычайно актуальными и своевременными. Биоразнообразие является уникальным и во многом невозобновимым ресурсом для любой страны, и его объем и значимость для территорий масштаба Российской Федерации сложно переоценить. Изучение этого разнообразия и вычленение из него видов, углубленное исследование которых способно принести несомненную научную и практическую пользу невозможно без знаний о самом разнообразии, его структуре и его масштабах. Работы такого плана активнейше развиваются сейчас во многих странах. Реализация проекта позволит Российской группе представляющей проект в течении короткого срока внести существенный вклад в эту область исследований и подготовить когорту молодых специалистов "нового" поколения, которые будут способны развивать дальнейшие исследования тихоходок и других микрометазоев на качественном, современном научном уровне.

Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность
(1) Изучить видовое разнообразие наземных тихоходок Северо-Западного региона России с использованием материалов, собранных в ходе экспедиционных выездов и на базе коллекций проб субстратов и природных материалов, хранящихся в СПбГУ. Это позволит впервые получить репрезентативные данные по видовому составу фауны наземных тихоходок для этого региона России.
(2) Разработать стандартизированную методику сбора субстратов, содержащих наземных тихоходок, включая экспериментальное обоснование минимального числа проб субстратов различного типа, дающего достаточно точное представление о фауне тихоходок региона.
(3) Получить данные по морфологии обнаруженных видов современными методами световой и электронной микроскопии, а также провести для обнаруженных видов секвенирование ДНК-баркодов (COI и ITS-2) и генов 18S и 28S рРНК, используемых для построении филогении крупных таксонов этой группы организмов. Изучить генетическую структуру обнаруженных видов тихоходок и впервые реконструировать филогеографию широко распространенных видов фауны России.
(4) Используя полученные данные дать первое описание видового разнообразия группы в пределах региона РФ с использованием современных методов и подходов интегративной таксономии. Составить первую фаунистическую сводку по тихоходкам России, разработать и опубликовать современные определительные ключи для группы. Впервые создать базу ДНК-баркодов для молекулярной идентификации видов тихоходок фауны России.
(5) Используя полученный набор ДНК-баркодов и последовательности, доступные в международных базах данных, впервые спроектировать и протестировать специализированные праймеры для выявления видового разнообразия тихоходок методами метагенетического анализа.
Предлагаемая задача представляет собой масштабное комплексное исследование, результаты которого будут востребованы далеко не только с точки зрения фаунистики и систематики конкретной группы микрометазоа - тихоходок. В рамках выполнения проекта будут получены большие объемы данных, позволяющие провести дальнейшую калибровку методов ДНК-баркодинга применительно к различных группам микрометазоев, новые массивы данных для включения в филогенетичеcкий анализ, которые помимо разрешения локальных ветвей дерева тихоходок вероятно позволят прояснить фундаментальные вопросы связанные с макроэволюцией этой группы организмов и экдизозоа в целом. Будут получены первые данные по филогеографии видов тихоходок на территории РФ, что позволит получить представление о том, как могли появляться и распространяться виды, какая модель распространения для них характерна, и что могло служить движущей силой расселений подобных организмов в глобальном масштабе. Результаты выполнения проекта (в особенности - полученные массивы данных) будут вкладом в решение такой общебиологической проблемы как границы видов живых организмов и проблемы генетической структуры видов микроскопических многоклеточных организмов, проблемы возможных драйверов видообразования, генетической изменчивости в локальных популяциях и целого ряда других общих проблем и вопросов. Полученные наборы последовательнстей ДНК-баркодов позволят включить данные по тихоходкам в анализ структуры и функционирования почвенных и связынных с почвой сообществ, а созданные на основе этих последовательностей специализированные праймеры позволят вовлечь тихоходок в метагенетические исследования ДНК окружающей среды почвенных экосистем.

Научная новизна исследований, обоснование того, что проект направлен на развитие новой для научного коллектива тематики*********, обоснование достижимости решения поставленной задачи (задач) и возможности получения предполагаемых результатов
Предлагаемое исследование является первым современным исследованием разнообразия тихоходок на территории РФ и в этом отношении аналогов не имеет. В ходе реализации проекта предполагается разработка комплексной методики исследования территории для получения репрезентативной выборки, позволяющей максимально точно охарактеризовать видовое разнообразие наземных тихоходок. Все фаунистические исследования, проводившиеся ранее основывались на анализе небольшого количества случайно отобранных проб. Полученные подобных образом данные не могут претендовать на полноту, в следствие чего сравнение фаун, проводимое на их основе не является надёжным. Слишком большое значение имеет фактор неполноты выборки, являющийся источником ошибок при сравнительном анализе. В ходе исследования предполагается провести интенсивный сбор материала в ряде хорошо доступных регионов Северо-Запада России и оценить минимальное число проб субстратов различных типов, обеспечивающее получение репрезентативной информации о видовом разнообразии наземных тихоходок. Выполнение данного исследования позволит превратить Россию из территории, на которой разнообразие тихоходок "практически не изучалось" в одну из наиболее изученных территорий в мире, а нашей исследовательской группе - превратиться в один из мировых центров изучения тардиград и, в перспективе, - свободноживущих микрометазоа в целом. Предлагаемые исследования будут являться развитием новой для коллектива научной тематики, связанной с молекулярной фаунистикой и ДНК-баркодингом, логически выросшей из предшествующих исследований коллектива в области морфологической систематики и фаунистики , а также молекулярной филогенетики тардиград.
Предлагаемый проект является пилотным исследованием, предполагающим разработку подходов к решению более масштабной задачи - выполнению первого современного исследования видового разнообразия наземных тихоходок в масштабах всей Российской Федерации. Учитывая огромный размер территории, которую планируется изучить, и разнообразие географических зон и биоценозов на этой территории данная работа скорее всего будет проводиться на протяжении значительного времени и вероятнее всего различными исследовательскими группами. Создание единого методического комплекса, обеспечивающего получение полных репрезентативных данных крайне важно для обеспечения «совместимости», а следовательно, и сравнимости результатов работы различных исследователей в будущем.
Широкомасштабное применение молекулярно-генетических и электронно-микроскопических методов позволит впервые всесторонне и глубоко проанализировать различные аспекты всего выявленного разнообразия таксонов тихоходок, не фокусируясь лишь на описании отдельных видов. Использование современных методов и подходов интегративной таксономии, основанной на разумном и сбалансированном сочетании морфологических, молекулярных и биологических данных позволит в комплексе решать задачи, связанные не только с изучением разнообразия и инвентаризацией таксономического состава тихоходок на территории РФ, но и изучить и по-новому взглянуть на проблемы филогении этой во многом загадочной группы организмов, изучить филогеографию широко распространенных видов, проанализировать пути формирования фауны России в целом и отдельных регионов, выявить произошедшие в прошлом события непреднамеренной интродукции видов. Созданная в результате работы первая современная сводка по фауне тихоходок России, снабженная определительными ключами, атласом микрофотографий и данными баркодинга станет основой для дальнейшего всестороннего изучения группы, как потенциального источника биоресурсов и модельных объектов для выполнения биологических, экологических и молекулярно-генетических исследований. В этом отношении работа включает элементы биопроспектинга - стремительно развивающегося в последние годы направления исследований нацеленного на широкомасштабный поиск ранее организмов, которые потенциально могут выступать в роли продуцентов химических веществ, биоактивных соединений и ли являться перспективными объектами для генетики и молекулярной биологии.
Новым направлением в работе нашей группы будет также вовлечение тихоходок в метагенетические исследования сообществ с использованием анализа ДНК окружающей среды. Данный метод позволяет анализировать таксономический состав биоценоза не прибегая к выделению и морфологической идентификации отдельных организмов. Этот инструмент активно используется при анализе бактериальных сообществ и сообществ протистов, однако ещё недостаточно широко применяется для изучения микрометазоа. Основным препятствием является отсутствие специфических праймеров, которые позволили бы амплифицировать участки ДНК, достаточно короткие, чтобы сохраняться в пробах ДНК окружающей среды, и при этом достаточно изменчивые, чтобы проводить уверенную идентификацию видов. Такие праймеры могут быть созданы только на основе анализа большого набора «полных» ДНК-баркодов, в настоящее время не существующего (так например для надсемейства Isohypsibioidea, представители которого являются постоянными членами почвенных сообществ, в базе GenBank последовательности маркера COI имеются всего для 16 видов, из более чем 200 описанных к настоящему времени). Полученные в ходе нашей работы данные, вместе с данными, имеющимися в открытом доступе в международных базах данных позволят спроектировать такие праймеры и эффективно протестировать их работоспособность как in silico (на выделенных из отдельных особей пробах ДНК) так и in situ (на пробах субстратов, для которых будет известен набор видов).
Выполнение предлагаемого проекта позволит создать методический стандарт для будущих фаунистических и таксономических исследований тихоходок России, что позволит значительно интенсифицировать изучение этой группы на территории нашей страны.
Для выполнения проекта собран коллектив, включающий молодых исследователей, каждый из которых обладает достаточными знаниями и опытом работы для выполнения "технической" части работ по проекту - сбора материала, выделения тихоходок, приготовления препаратов и проведения морфометрических измерений, имеет опыт подготовки описаний видов тардиград, существенный опыт работы с соответствующей литературой и анализа литературных данных. У коллектива имеются как опубликованные, так и направленные в печать совместные публикации. Однако участие младших членов коллектива не будет ограничиваться только рутинной работой, они будут вовлечены во все этапы обработки материала и обсуждения полученных данных. Мы полагаем, что такая организация работы позволит подготовить высококвалифицированных специалистов по систематике группы, способных, в дальнейшем, к проведению самостоятельных исследований. В условиях практически полного отсутствия других признанных специалистов по изучаемой группе, руководитель проекта сможет сосредоточиться именно на экспертной оценке собранных материалов, формулировании выводов и гипотез, постановке задач и подготовке публикаций. Подобная организация работы, равно как и наличие существенного научного задела, опыта исследований и коллекций материала, позволит нам в сжатые сроки гранта выполнить предлагаемые в проекте исследования.
Методическая база для выполнения проекта нам полностью ясна и никаких сложностей для нас не представляет. Коллективом отработаны методы обработки различных сухих субстратов, позволяющие получить материал, пригодный как для морфологического так и для молекулярно-генетического исследования. Разработан и активно используется в текущей работе новый протокол экстракции ДНК тихоходок, позволяющий во-первых значительно сократить время экстракции (что важно при обработке большого количества материала), а во-вторых получать после экстракции неповрежденный экзоскелет тихоходки, пригодный для морфологического исследования (что решает проблему ваучерного экземпляра, критически актуальную при таксономической работе с микроскопическими организмами). Предварительные результаты, полученные в ходе работы коллектива позволяют уверенно предположить наличие на территории России значительного "скрытого" видового разнообразия тихоходок (неопубликованные данные). Руководитель группы имеет более 30 лет опыта работы в изучении биоразнообразия, морфологии и эволюции тихоходок, знания и навыки современных светомикроскопических и электронно-микроскопических исследований, опыт работы в области молекулярной систематики и филогенетики. В распоряжении коллектива имеются большая справочная таксономическая коллекция и исчерпывающая по объему библиотека, включающая оригинальные описания всех известных на сегодняшний день видов тихоходок. Налажены рабочие контакты с ведущими зарубежными исследовательскими группами, работающими в данной области, ведется активный обмен данными и совместная работа.
Проект предполагается выполнять на базе отлично оснащенных современных микроскопических и молекулярных лабораторий кафедры зоологии беспозвоночных Биологического факультета СПбГУ. Коллектив имеет возможность пользоваться для выполнения исследований (в том числе - молекулярных исследований) всеми необходимыми сервисами и оборудованием ресурсных центров Научного парка СПбГУ ( https://researchpark.spbu.ru/researchpark/centres ). Вся эта база позволяет нам уверенно заявлять, что в случае поддержки проекта мы сможем выполнить его в полном объеме.

Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
Фауна тихоходок в мировом масштабе изучена крайне слабо. Наибольшее количество публикаций посвящено фауне Европы (McInnes, 1994), однако даже для такой небольшой и хорошо изученной территории, как о. Сицилия (где интенсивное изучение фауны тихоходок ведется непрерывно, начиная с 60-х годов прошлого века) постоянно публикуются описания новых находок и видов (Lisi, 2015). Даже в рамках традиционного (морфологического) подхода постоянно публикуются новые данные по видовому разнообразию и распространению тихоходок (например Tumanov, 2018a, b, c). В последнее десятилетие мощным инструментом, позволяющим решать различные вопросы изучения биологического разнообразия является так называемый "интегративный подход", под которым понимается использование всех доступных источников данных для подтверждения видовых гипотез. Применительно к тихоходкам использование интегративного подхода означает анализ всей совокупности морфологических (полученных методами световой и электронной микроскопии) и молекулярно-генетических данных (последовательностей генов). Этот подход позволяет дифференцировать широко распространенные слаборазличимые морфологически (семикриптические) и полностью неотличимые (криптические) виды. Совместный анализ морфологических и молекулярных данных совершенно необходим на данном этапе изучения тихоходок, поскольку нам ещё только предстоит тонко откалибровать метод ДНК-баркодинга применительно к данной группе животных. Среди тихоходок известны как неразличимые морфологически виды, хорошо изолированные генетически (Bertolani et al., 2011), так и виды, для которых характерна значительная внутривидовая изменчивость генов баркода (Zawierucha et al., 2018). Привлечение молекулярных методов в таксономическую практику тардиградологических исследований привело к смене парадигмы, предполагавшей существование широко распространенных (и даже космополитических) видов с большой амплитудой морфологической изменчивости, на новую прадигму наличия большого числа локальных видов, хорошо очерченных генетически, но, зачастую плохо (или совсем не) различимых на морфологическом уровне (Bertolani et al., 2011). Работы последних лет показали, что практически все исследованные «широко распространенные» виды тихоходок (Milnesium tardigradum, Macrobiotus hufelandi, Macrobiotus pallarii, Paramacrobiotus richtersi, Mesobiotus harmsworthi, Richtersius coronifer, Ramazzottius oberhaeuseri, Hypsibius dujardini, Mesocrista spitzbergensis, Pseudechiniscus suillus) при молекулярно-генетическом исследовании оказались комплексами видов, родственные связи и реальное распространение которых ещё предстоит выяснить (Bertolani et al., 2011; Cesari et al., 2020; Gąsiorek et al., 2016, 2018; Guidetti et al., 2016, 2019; Kaczmarek et al., 2018a; Morek and Michalczyk, 2020; Stec et al., 2018, 2021). Однако, при этом, для некоторых видов (например Echiniscus testudo) было показано действительно широкое распространение, по крайней мере в пределах Палеарктики (Gąsiorek et al., 2017). Нахождения этого вида за пределами палеарктического региона рассматриваются как вероятный результат непреднамеренной интродукции, однако, не исключается и вероятность космополитического распространения этого вида. Для обоснованного выбора одной из этих гипотез пока не хватает данных, полученных на широком зоогеографическом материале (Gąsiorek et al., 2019с). Большинство вышеуказанных работ, кроме исследования генетического разнообразия форм в пределах старых «морфологических» видов было посвящено также переописанию типовых видов этих комплексов, что является хорошей «опорной точкой» для дальнейшей работы по выявлению и описанию новых видов, ранее не различавшихся. В этой ситуации практически все фаунистические списки, опубликованные в домолекулярный период систематики тихоходок считаются устаревшими (Kaczmarek et al., 2014, 2015, 2016; McInnes et al., 2017), практически все указания на обнаружение "широко распространенных видов" приходится считать сомнительными, а, следовательно, исследование мировой фауны необходимо начинать фактически «с чистого листа».
В настоящее время в мире практически нет исследовательских групп, систематически занимающихся фаунистическими исследованиями тихоходок, с использованием молекулярно-биологических методов, за исключением японской группы, опубликовавшей две статьи, посвященные распространению ряда видов тихоходок в пределах Японии (Sugiura et al., 2020a, b), и проекта "Swedish tardigrades" (https://www.researchgate.net/project/Swedish-tardigrades), реализуемого командой шведских и итальянских исследователей на базе университета г. Модена (Италия) (Massa et al., 2021). Национальный проект по изучению фауны тихоходок был так же анонсирован в Ирландии (All-Ireland Tardigrade Survey, https://www.irishtardigrades.com), однако, насколько можно судить, он не подразумевает масштабного использования молекулярных методов, единственная работа включающая генетические данные, в рамках этого проекта была проведена в коллаборации с нашим коллективом (DeMilio et al., 2022 in press). Проект "Tardigrades of Polish National Parks" объединяющий исследования по фауне национальных парков Польши, выполняемый в Adam Mickiewicz University, Poznan с 2016 года, не предусматривает широкого использования молекулярно-биологических методов (Kaczmarek et al., 2018b). Основная масса работ, ведущихся итальянскими и польскими исследователями (University of Modena and Reggio Emilia; Adam Mickiewicz University, Poznan; Jagiellonian University, Krakow) преимущественно посвящена изучению филогенетических связей отдельных таксонов тихоходок, состава комплексов близких видов, поиску новых морфологических признаков, которые могут быть использованы для реконструкции филогении наряду с молекулярно-генетическими и переописанию «старых» видов из типовых местообитаний (e.g. Gąsiorek et al., 2019a, b; Gąsiorek and Michalczyk, 2020; Kaczmarek et al., 2020). Такая направленность работы приводит их к необходимости преимущественного использования материала из различных, географически удаленных регионов. В то же время, именно эти исследования итальянских и польских специалистов заложили основу, позволяющую начать систематическую фаунистическую работу.
Фаунистические исследования тихоходок ведутся также в странах Южной Америки (Колумбия, Мексика), в тесной связи с итальянскими и польскими специалистами (García-Román et al., 2022; Lisi et al., 2020; Moreno Talamantes et al., 2015; Pérez-Pech et al., 2016), но опубликованные данные пока имеют в значительной степени предварительный характер, поскольку базируются только на морфологической идентификации обнаруженных форм.
В долгосрочном фаунистическом проекте, проводившемся на ограниченой территории (Great Smoky Mountains National Park, USA), была сделана попытка оценки степени изученности фауны тихоходок методами компьютерного моделирования (Bartels and Nelson, 2007), показавшая принципиальную возможность такого подхода. Однако из-за проблем с финансированием эта работа не была завершена и никаких методических рекомендаций на её основе сформулировано не было. Как и вышеупомянутые исследования, эта работа базировалась исключительно на морфологической идентификации обнаруженных видов, что, согласно современным представлениям, значительно снижает её ценность.
Изучение фауны тихоходок методом метабаркодинга только начинается. Основной проблемой этого метода исследований является слабая совместимость результатов, полученных методом прямой морфологической идентификации и метабаркодингом. Нам известна всего одна работа, в которой была сделана попытка проанализировать эту проблему и найти подходы к её решению (Topstad et al., 2021), однако её результаты далеки от окончательных и достоверных.
В России фауна тихоходок систематически изучалась в течение 80-90-х годов прошлого века преимущественно в пределах Европейской части России. Итогом этого этапа стала обобщающая статья В.И. Бисерова (1991), в которой приведен список из 87 видов тихоходок. Эта работа рассматривалась автором как предварительная, поэтому в ней отсутствуют описания видов и далеко не для всех видов приведены корректные полные данные по их распространению. К сожалению, автор не смог завершить эту работу. Кроме того, в свете современных данных, значительная часть (по предварительной оценке не менее 35) видов, указанных в этой работе являются представителями комплексов криптических и семикриптических видов. Эта работа была продолжена Д.В. Тумановым, описавшим ряд новых для науки видов тихоходок с территории России (Tumanov 1997, 2003, 2018c). Все эти работы относятся к пре-молекулярному периоду таксономии тихоходок и приведенные в них зоогеографические и фаунистические данные приходится рассматривать как требующие проверки и подтверждения методами интегративной таксономии. Для территории России существует всего четыре опубликованных работы, в которых указания на обнаружение видов тихоходок подкреплены данными ДНК-баркодинга. Одна из них (Morek and Michalczyk, 2019) посвящена исследованию филогении рода Milnesium и включает лишь указание на обнаружение вида Milnesium tardigradum на территории России, вторая (Drohvalenko et al., 2019) является лишь предварительным исследованием, не посвященным целенаправленно тихоходкам. К сожалению, приведенные во второй работе данные по генам баркода были получены из смешанных образцов и не сопровождались анализом морфологии исследованных видов, поэтому полученные результаты не могут быть приняты как достоверные. Две другие работы выполнены с участием нашей исследовательской группы и содержат указания на обнаружение двух новых для фауны России видов тихоходок родов Milnesium и Notahypsibius (Маськин и др., 2021; Tumanov, 2021). В ряде публикаций последних лет тихоходки упоминаются, но либо без точного определения либо с исключительно морфологической идентификацией, что совершенно недостаточно (например Zvereva et al., 2019). Таким образом на сегодняшний день для всей территории России достоверно (на современном научном уровне) указаны всего три вида тихоходок.
Филогенетические исследования тихоходок, проводимые в последние годы с привлечением молекулярных данных позволили получить ответы на многие вопросы, казавшиеся неразрешимыми в рамках традиционного морфологического анализа. Так например удалось уточнить филогенетическое и таксономическое положение загадочного рода Apodibius, представители которого полностью лишены коготков, строение которых является основой для выделения крупных таксонов (уровня надсемейства) в пределах Eutardigrada (Dabert et al., 2014). Также были получены данные, позволившие выявить родственные связи форм с сильно редуцированными коготками – родов Haplomacrobiotus и Fractonotus (Cesari et al., 2016; Gąsiorek et al., 2019d). Было уточнено филогенетическое положение эндемичного антарктического рода Ramajendas, в морфологии которого противоречиво сочетались признаки двух надсемейств Eutardigrada; было обосновано выделение самостоятельного семейства Ramajendidae в составе надсемейства Isohypsibioidea (Tumanov, 2022). В ходе ревизии ряда групп (род Echiniscus, надсемейство Isohypsibioidea, подсемейство Itaquasconinae) было показано, что ряд морфологических признаков, ранее считавшихся филогенетически значимыми, вероятно возникали неоднократно в ходе эволюции тихоходок. С другой стороны, некоторые тонкие детали строения, ранее не рассматривавшиеся с точки зрения филогении оказались несущими отчетливый филогенетический сигнал (Gąsiorek et al., 2019a, b; Gąsiorek and Michalczyk, 2020). Полученные результаты привели к значительным изменениям в системе тихоходок, однако практически любые новые данные продолжают вносить коррективы в наши представления о путях эволюции тихоходок. Исследование молекулярной филогении рода Milnesium (Morek and Michalczyk, 2019) неожиданно выявило отсутствие упорядоченности в распределении морфологических признаков по выявленным кладам в пределах рода, вместо этого, клады убедительно группируются по зоогеографическому принципу. Этот результат наглядно демонстрирует, что мы пока крайне слабо понимаем закономерности эволюции морфологических признаков тихоходок, что ставит под вопрос их применимость для реконструкции филогении группы.
Показательным примером совмещения фаунистических и филогенетических исследований в рамках изучения тихоходок является проведенное автором заявки исследование (Tumanov, 2020). Начавшись с обнаружения нового для фауны России вида тихоходок Hypsibius pallidoides, эта работа привела к переописанию этого вида на основе углубленного морфологического анализа типового материала и лабораторной культуры, полученной из европейского локалитета. Морфологическое исследование показало, что комплекс признаков, выявленный у этого вида является уникальным и сочетает в себе признаки различных таксонов семейства Hypsibiidae, а проведенное молекулярно-генетическое исследование и филогенетический анализ показали, что этот вид относится к кладе, ранее включавшей только род Pilatobius, морфологически значительно отличающийся. Для исследованного вида был установлен новый род Notahypsibius, а изучение литературных данных и типовых материалов других видов рода Hypsibius позволило отнести к этому роду ещё два вида, описанных ранее из европейской Арктики и Северной Америки. В результате это, казалось бы рутинное, переописание банального вида из широко распространенного рода привело к пересмотру системы семейства Hypsibiidae, выявило выраженный случай параллельной эволюции признаков, ранее считавшихся филогенетически значимыми и позволило получить новые данные в поддержку альтернативной гипотезы эволюции класса Eutardigrada в целом. Позднее присутствие этого вида в фауне России было подтверждено методами молекулярного баркодинга (Tumanov, 2021), и показано существование ещё нескольких, морфологически неотличимых, но обособленных генетически, видов в фауне Северной Европы и России (неопубликованные данные).

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта и ожидаемые результаты
(1) Проведение массовых сборов в хорошо доступных и предварительно обследованных регионах Северо-Запада России (Ленинградская область – Всеволожский и Лужский районы, республика Карелия – Валаамский архипелаг, Кандалакшский заповедник).
Пробы материалов, потенциально содержащих тихоходок (куртины мхов, лишайников, хвойный и лиственный опад) будут собираться в стандартные бумажные пакеты. Будут охвачены все основные типы несущих субстратов (почва, камни, скалы, стволы деревьев), и различные условия обитания (освещённость, степень увлажнения). Собранный материал будет полностью высушен в тени при комнатной температуре и перенесен для хранения и обработки на кафедру зоологии беспозвоночных СПбГУ. Многолетний опыт работы с наземными тихоходками показывает, что подготовленный таким образом материал может храниться на протяжении длительного времени (до 5 лет) без дополнительной обработки и фиксации, обеспечивая получение материала по тихоходкам пригодного как для морфологического так и для молекулярно-генетического анализа. Нами предполагается сбор 80 проб для каждого региона.

(2) Выделение и первичная морфологическая идентификация тихоходок
Для выделения тихоходок будет использован хорошо себя зарекомендовавший метод промывки субстратов через систему двух сит – грубого, задерживающего материал субстрата и тонкого сита, на котором задерживаются тихоходки и их яйца (Tumanov, 2018c). Содержимое тонкого сита просматривается под бинокуляром и объекты извлекаются пипеткой в стекла с лункой. Для этих исследований в лабораторных условиях будут использованы бинокулярные микроскопы Leica M205C оснащенный системой Leica fusion optics, и осветителем для работы по методу рельефного контраста Ротермана, что значительно облегчает детекцию тихоходок и их яиц в пробах и увеличивает точность работы с микроскопическими объектами. Для определения видовой принадлежности исследуемых тихоходок часть животных будет заключена в постоянные препараты в жидкости Хойера, для исследования современными методами световой микроскопии (фазовый контраст, DIC, с использованием микроскопов Leica DM2500, Leica DMI3000 и Nikon Eclipse NI, оснащенных планапохроматическими объективами, фотокамерами и программным обеспечением для выполнения морфометрических измерений и съемки объектов). Тонкие детали строения будут исследованы методом сканирующей электронной микроскопии. Для подготовки материала для подобных исследований нами разработана методическая база, включающая различные приемы и приспособления для уменьшения или полного исключения потерь материала при подготовительных операциях (например, проводка материала в микрокамерах). Определение материала будет вестись по всей совокупности современных таксономических публикаций (полная библиотека оттисков, копий и электронных версий публикаций, включающая оригиналы описаний всех известных видов тихоходок имеется в распоряжении рабочей группы). Для сравнения будут использованы материалы богатой коллекции препаратов тихоходок руководителя проекта и фотографии препаратов, хранящихся в крупнейших зарубежных коллекциях (университет г. Катанья, Италия, университет г. Модена, Италия, музей естественной истории г. Верона, Италия, зоологический музей г. Копенгаген, Дания) имеющиеся в распоряжении нашей группы.

(3) Молекулярные исследования и ДНК – баркодинг
Для молекулярных исследований ДНК мы будем применять успешно адаптированный нами метод «мягкой» экстракции ДНК методом лизиса одиночного экземпляра тихоходки в специализированной среде QuickExtract™, позволяющий сохранить экзоскелет, пригодный для заключения в постоянный препарат для последующего использования в качестве ваучерного экземпляра и морфологического анализа. В случае необходимости отложенной обработки или сохранения резервных экземпляров, пригодных в дальнейшем для экстракции ДНК, мы будем использовать реактив RNAlater® (или его аналог), позволяющий сохранить в образце неповрежденные нуклеиновые кислоты. Извлечение ДНК из хранившихся в RNAlater® образцов отработано в нашей лаборатории и показало хорошие результаты. Полученная ДНК будет амплифицирована с использованием универсальных или специализированных праймерных систем, разработанных для различных генов отдельных групп тихоходок. При необходимости полученные ампликоны будут клонированы и секвенированы по Сэнгеру. В первую очередь нас будут интересовать последовательности ДНК - баркодов (генов COI и ITS-2), в случае обнаружения форм, филогенетическое положение которых неопределено или нуждается в уточнении будут также секвенированы последовательности консервативных генов (18S и 28S рРНК). Секвенирование будет выполнено на базе ресурсного центра РМиКТ Научного парка СпбГУ специалистами научного парка (сервис, предоставляемый СПбГУ).

(4) Интегративная таксономия и определение статуса видов
Для всех обнаруженных в ходе исследования форм планируется получение полного массива современных светооптических, электронно-микроскопических и молекулярных данных, что позволит надежно дифференцировать морфологически близкие виды и виды-двойники, существование которых известно для тихоходок. В настоящее время для тихоходок принято использовать различие в 3-6% между последовательностями баркодов как границу, при превышении которой можно говорить о межвидовом уровне различий (так называемый баркод-гэп). Однако это значение установлено по аналогии с основной массой исследованных таксонов животных (для которых оно подобрано эмпирически), хотя известно, что для ряда крупных систематических групп используются другие пороговые значения. Среди тихоходок известны виды, отчетливо различающиеся морфологически, но крайне близкие по последовательностям ДНК-баркодов, с другой стороны существуют виды, для которых показана значительная внутривидовая изменчивость генов баркода. В этой ситуации только широкомасштабное исследование с использованием интегративного подхода, включающее анализ большого числа видов и популяций тихоходок, позволит произвести тонкую калибровку метода ДНК-баркодинга для данной группы. Во всех случаях обнаружения генетических различий мы будем проводить тщательный поиск различий на морфологическом уровне для того, чтобы на основании всей совокупности данных понять, возможно ли полагать обнаруженные отличия заслуживающими видового статуса.
Работа по пунктам 2-4 будет выполняться параллельно, поскольку из каждой обнаруженной популяции тихоходок будут выбраны экземпляры для молекулярно-генетического анализа (не менее 10 экземпляров, для оценки генетического полиморфизма), экземпляры взрослых особей и отложенных яиц для исследования методом сканирующей электронной микроскопии и также взрослые особи и яйца для исготовления постоянных препаратов (не менее 30 экземпляров для надёжного морфометрического анализа, согласно рекомендации Stec et al. (2016)).

(5) Определение оптимального числа проб для достоверной оценки видового разнообразия тихоходок.
На основе полученных данных по видовому составу наземных тихоходок регионов, исследованных на первом этапе нами будет определено число исследованных проб субстратов, при превышении которого ожидаемые показатели числа видов для данной территории не будут значительно отличаться от реальных величин видового разнообразия. Таким образом мы определим минимальный объем материала, необходимый для достоверной оценки разнообразия тихоходок для исследуемой территории. Для этого мы предполагаем использовать статистические программные пакеты EstimateS и SpadeR, позволяющие получать кривые зависимости предсказанного числа видов от числа проанализированных проб. Безусловно, данный показатель будет в значительной степени приблизительным, однако это будет реальный и обоснованный ориентир для дальнейшей работы по изучению фауны тихоходок России.

(6) Синтез полученных данных. Сводка по разнообразию тихоходок России.
Полученные данные будут использованы для подготовки определительных ключей по фауне тихоходок России. При этом они будут сопровождаться данными по двум ДНК баркодам (COI и ITS-2), что позволит в будущем проводить уверенное определение видов даже в отсутствие возможности исследования материала на оптическом оборудовании высокого класса (что необходимо при морфологическом определении видов) и без необходимости поиска в пробах отложенных яиц тихоходок (исследование признаков хориона которых необходимо для видовой идентификации). Это значительно расширит возможности работы с группой для исследователей, не являющихся экспертами-таксономистами - специалистов по экологическому мониторингу, экологов, молекулярных биологов.

(7) Молекулярная филогения и филогеография тихоходок
Полученные последовательности генов будут использованы как для ДНК-баркодинга с целью идентификации видов (в этой роли у тихоходок обычно выступают гены COI и ITS-2), так и для реконструкции филогении тихоходок. Для этой цели мы подготовим конкатенированное выравнивание генов 18S и 28S рРНК, и проведем филогенетический анализ используя стандартный набор программного обеспечения (jModelTest, ModelTest NG, PartitionFinder) для выбора оптимальных моделей эволюции последовательностей, RaxML и PhyML для получения ML дерева и MrBayes для получения байесовского дерева. Мы будем анализировать наборы данных различного объема – как локальные – в пределах отрядов и семейств, так и общие для всех Tardigrada. Существенное увеличение набора таксонов, включенных в деревья, как мы полагаем, позволит нам достичь гораздо большего разрешения филогении и сделать обоснованные выводы о взаимоотношениях крупных групп Tardigada.
Полученные нами данные, помимо филогенетических данных, позволят нам провести анализ молекулярной филогеографии тех видов, которые будут обнаружены в нескольких или многих различных точках на территории РФ. Это достаточно мощный инструмент, позволяющий восстановить молекулярную генеалогию вида и показать вероятные точки его происхождения (или интродукции) и проанализировать паттерн формирования и расселения локальных популяций. Для этой цели мы построим выравнивания ДНК-баркодов, полученных из разных локальных популяций для каждого из исследуемых видов и проанализируем полученный паттерн используя программное обеспечение для построение сети гаплотипов (TCS, HapStar или PopART). Анализ полученной сети может показать, где началось распространение вида по территории РФ, была ли его интродукция разовым или системным событием и позволит эффективно установить возможные случаи антропогенной интродукции видов в новые местообитания.

(8) Разработка праймеров для метабаркодинга
Используя полученные нами последовательности ДНК-баркодов и последовательности, доступные в открытых международных базах данных (GenBank) мы спроектируем праймеры для амплификации коротких фрагментов ДНК, пригодных в качестве маркеров для исследования ДНК окружающей среды методами метабаркодинга. Для этого мы планируем импользовать приложения PrimerMiner, ecoPrimers или DegePrime. Работоспособность спроектированных таким образом праймеров мы планируем проверить как in silico (используя пробы ДНК полученные из отдельных экземпляров тихоходок) так и in situ (используя пробы субстратов с уже изученным видовым составом тихоходок).

План работ:
год 2023:
1. Сбор материала в выбранных регионах. Экспедиционные поездки на Валаамский архипелаг и в Кандалакшский заповедник.
2. Выделение материала из проб, первичная сортировка материала, изготовление препаратов, изучение и фотодокументирование материалов современными методами световой микроскопии.
3. Подготовка материалов для сканирующей электронной микроскопии, выделение ДНК методами, обеспечивающими сохранение кутикулы тихоходок и изготовление «ваучерных» препаратов для образцов ДНК.
4. Секвенирование последовательностей ДНК-баркодов, генов 18S рРНК и 28SРрНК.
5. Составление списков видов исследованных регионов, определение оптимального числа проб для исследования фауны наземных тихоходок.
6. Составление выравниваний генов, филогенетический анализ, анализ полученных результатов. Описание новых видов и переописание уже известных с учетом полученных новых данных. Филогеографический анализ полученных молекулярных данных.
Ожидаемые результаты:
1. Современные светомикроскопические и электронно-микроскопические данные по всем обнаруженным видам тихоходок.
2. Препараты ДНК тардиград, «привязанные» к препарату «ваучерного» экземпляра. Первые сиквенсы генов и первые результаты филогенетического анализа. Первые данные о генетической структуре изученных морфологических видов тихоходок.
3. Полные наборы данных (морфологические + молекулярно-генетические) по не менее чем 15 видам тихоходок.
4. Первые фаунистические списки для отдельных регионов. Первые результаты филогеографического анализа.

год 2024:
1. При необходимости дополнительный сбор материала в выбранных регионах.
2. Продолжение выделения материала из проб, изготовление препаратов, изучение и фотодокументирование материалов современными методами световой микроскопии.
3. Подготовка материалов для сканирующей электронной микроскопии, выделение ДНК методами, обеспечивающими сохранение кутикулы тихоходок и изготовление «ваучерных» препаратов для образцов ДНК.
4. Секвенирование последовательностей ДНК-баркодов, генов 18S рРНК и 28SРрНК.
5. Итоговый сравнительно-фаунистический анализ. Ревизия таксономического статуса ряда видовых комплексов тихоходок с использованием результатов молекулярно-филогенетического анализа.
5. Статистический анализ для определения оптимального числа проб, необходимого для получения достоверных данных по видовому разнообразию тихоходок, формулирование методических рекомендаций по сбору проб для фаунистических исследований.
5. Завершение работ по филогеографическому анализу полученных молекулярных данных.
6. Разработка и проверка работоспособности праймеров для метабаркодинга и оценка их эффективности

Ожидаемые результаты:
1. Список видов тихоходок Северо-Запада России, с характеристикой каждого обнаруженного вида, включая молекулярно-генетические данные и атлас микрофотографий.
2. Статьи по частным итогам работы, посвященные описанию новых видов.
3. Обобщающая обзорная работа по таксономическому разнообразию тихоходок России и новые ключи для определения тихоходок фауны РФ. База данных последовательностей ДНК- баркодов, позволяющая оперативно проводить определение видовой принадлежности тихоходок. Справочная коллекция препаратов тихоходок.
4. Данные о филогеографии отдельных видов тихоходок России, и возможных путях их распространения и формирования современной фауны.
5. Новые данные о филогении тихоходок.
6. Последовательности праймеров для изучения фауны тихоходок методом метабаркодинга.
7. Разработка и публикация первого полного комплекса методических рекомендаций для дальнейшей фаунистической и таксономической работы с тихоходками, включая методы молекулярно-генетического анализа.
8. Подготовка молодых специалистов, обладающих опытом таксономической работы с трудной в методологическом отношении группой микрометазоа, с использованием современных методов морфологического и молекулярно-генетического анализа.

Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов (указываются полученные ранее результаты, разработанные программы и методы)
Научным коллективом на протяжении ряда лет выполняются исследования по систематике и филогенетике тихоходок.
Уже первые исследования фауны тихоходок России с привлечением молекулярно-генетических данных показали необходимость ревизии используемой в настоящее время системы группы. Так, например, описанный на основе морфологических данных и отнесенный авторами описания к роду Hypsibius вид Hypsibius pallidoides, при молекулярно-генетическом анализе оказался филогенетически удаленным от рода Hypsibius, а детальный морфологический анализ, с использованием светооптических и электронно-микроскопических данных выявил наличие у этого вида уникального комплекса признаков. Результатами данной работы стали выделение нового рода Notahypsibius и доказательство возможности независимого развития ряда морфологических признаков в эволюции Eutardigrada (Tumanov, 2020). Дальнейшие исследования выявили присутствие этого вида в фауне России (Tumanov, 2021) и существование значительного генетического разнообразия, свидтельствующего о наличии не менее пяти криптических видов этого рода в фауне России и Северной Европы (неопубликованные данные). Исследованиями нашей группы получены данные, позволившие выявить филогенетические связи ещё одного загадочного рода тихоходок - Ramajendas. Для него характерно уникальное сочетание морфологических признаков, характерных для двух надсемейств Eutardigrada (Hypsibioidea и Isohypsibioidea). В рамках морфологического анализа выявить родственные связи этого рода не представлялось возможным, разные авторы склонялись к различным гипотезам (Marley et al., 2011; Bertolani et al., 2014). Данные, полученные нашей группой, позволили однозначно разрешить эту проблему и выделить новое семейство Ramajendidae составе надсемейства Isohypsibioidea (Tumanov, 2022). Проводящиеся нашим коллективом исследования семейства Hypsibiidae позволили получить данные, которые несомненно приведут к радикальной перестройке филогении и системы этого таксона и позволят по-новому взглянуть на эволюционные связи в этой группе (первая статья из запланированной серии публикаций находится на рассмотрении в редакции Zological Journal of the Linnean Society). Проводящиеся нашей группой работы по изучению фауны тихоходок Северо-Западного региона России выявили значительное видовое разнообразие не распознававшееся ранее, поскольку до начала работ по переописанию старых видов методами интегративной таксономии не было возможности дифференцировать новые находки от старых неполных и неточных описаний. Уже первые результаты свидетельствуют о потенциально значительном числе новых видов, которые могут быть обнаружены в ходе исследования. Например, изучение всего одной пробы мха из окрестностей Санкт-Петербурга выявило 4 новых вида относящихся к родам Hypsibius, Pilatobius, Macrobiotus и Minibiotus (неопубликованные данные).
Коллективом освоены методы сбора и хранения субстратов, содержащих тихоходок, в сухом и в замороженном состоянии. Собрана богатая коллекция проб субстратов из различных регионов мира. Все участники коллектива владеют методами выделения тихоходок из субстратов, изготовления постоянных препаратов в жидкости Хойера, подготовки тихоходок и их яиц (детали строения хориона которых используются в систематике) к исследованию методами сканирующей электронной микроскопии. Собрана обширная библиотека таксономической и общебиологической литературы, посвященной тихоходкам, в том числе оригинальные описания всех видов мировой фауны. Большая часть библиотеки переведена в электронный формат. За время работы собрана обширная коллекция постоянных препаратов тихоходок. Созданы компьютерные базы данных, в которых хранится информация о всех хранящихся и обработанных пробах, препаратах, пробах ДНК и полученных сиквенсах. Налажены постоянные связи с крупнейшими мировыми коллекциями тихоходок, ведется постоянный обмен материалами. Отработаны методы выделения тихоходок в постоянную лабораторную культуру. В работе коллективом активно используются молекулярно-биологические методы исследования. Отработан метод неразрушающего выделения ДНК из единичных образцов тихоходок, позволяющий сохранить экзоскелет тихоходки для заключения в постоянный препарат и в дальнейшем использовать его как ваучерный экземпляр (гологенофор). Отработаны методы амплификации генов, используемых для реконструкции филогенетических связей (18S и 28S рРНК, COI, ITS-2), подобраны праймерные пары и протоколы ПЦР. Собраны полные базы сиквенсов филогенетически значимых генов Tardigrada, выровненные и подготовленные для проведения филогенетического анализа.
Организованные в СПбГУ ресурсные центры предоставляют все необходимое оборудование для выполнения электронной микроскопии, секвенирования и других работ, требующих применения дорогостоящего оборудования, обслуживаемого специализированными инженерами.
Ведется эффективное сотрудничество со многими ведущими зарубежными специалистами-тардиградологами, опубликованы совместные статьи, ряд статей в соавторстве с зарубежными коллегами находится в работе.

Публикации
Tumanov D.V (2022) End of a mystery: integrative approach reveals the phylogenetic position of an enigmatic Antarctic tardigrade genus Ramajendas (Tardigrada, Eutardigrada). Zoologica Scripta 51: 217– 231. https://doi.org/10.1111/zsc.12521
Маськин Е.В., Гребенкин П.В., Железнова Л.В, Туманов Д.В. (2021) Новые данные по тихоходкам рода Milnesium (Tardigrada, Eutardigrada, Milnesiidae) Дальнего Востока России, полученные с использованием метода молекулярного баркодинга. Чтения памяти Алексея Ивановича Куренцова 32: 114-122. https://doi.org/10.25221/kurentzov.32.11
Tumanov D.V (2021) Presence of Notahypsibius pallidoides (Tardigrada: Hypsibiidae) in the fauna of Russia confirmed with the methods of DNA barcoding. Biological Communications 66(3): 328–334. https://doi.org/10.21638/spbu03.2021.309
Tumanov D.V., Avdeeva G.S. (2021) Integrative description of Hypsibius repentinus sp. nov. (Eutardigrada: Hypsibiidae) from Sweden. Zoosystematica Rossica 30(1): 101-115. https://doi.org/10.31610/zsr/2021.30.1.101
Tumanov D.V. (2020) Integrative description of Mesobiotus anastasiae sp. nov. (Eutardigrada, Macrobiotoidea) and first record of Lobohalacarus (Chelicerata, Trombidiformes) from the Republic of South Africa. European Journal of Taxonomy 726: 102-131. https://doi.org/10.5852/ejt.2020.726.1179
Tumanov D.V. (2020) Integrative redescription of Hypsibius pallidoides Pilato et al., 2011 (Eutardigrada: Hypsibioidea) with the erection of a new genus and discussion on the phylogeny of Hypsibiidae. European Journal of Taxonomy 681: 1–37. https://doi.org/10.5852/ejt.2020.681
Tumanov D.V. (2020) Analysis of non-morphometric morphological characters used in the taxonomy of the genus Pseudechiniscus (Tardigrada: Echiniscidae). Zoological Journal of the Linnean Society, 188: 753–775. https://doi.org/10.1093/zoolinnean/zlz097/5611165
Stec D, Tumanov D.V., Kristensen R.M. (2020) Integrative taxonomy identifies two new tardigrade species (Eutardigrada: Macrobiotidae) from Greenland. European Journal of Taxonomy 614: 1–40. https://doi.org/10.5852/ejt.2020.614
Tumanov D.V. and Pilato G. (2019) A new species of Eutardigrade (Macrobiotidae) from New Zealand. Zootaxa 4603 (3): 537-548. https://doi.org/10.11646/zootaxa.4603.3.6