Лаборатория Нейробиологии и Молекулярной Фармакологии, созданная в 2014 и возглавляемая Гайнетдиновым Р.Р. является структурной единицей созданного в 2015 году Института Трансляционной Биомедицины СПбГУ (Директор – Гайнетдинов Р.Р.). Деятельность лаборатории направлена на исследование нейрохимических основ поведения и заболеваний человека и разработку новых фармакологических средств для терапии психических и нейродегенеративных заболеваний.
Основные направления научных исследований в лаборатории:
1.Исследование функций дофаминовой системы.
Нейротрансмиттер дофамин (ДА) вовлечён в широкий спектр жизненно важных функций, таких как двигательная активность, пищевое поведение, эмоции, внимание и подкрепление. Основные центры дофаминергической системы находятся в стволе мозга и расположены в черной субстанции и вентротегментальной области. Нейроны черной субстанции главным образом проецируются в хвостатое ядро или дорзальный стриатум (нигростриатальный путь), тогда как нейроны вентротегментальной области посылают свои аксоны в вентральный стриатум, в том числе в прилежащее ядро, а также некоторые другие лимбические (мезолимбическая система) и кортикальные областях (мезокортикальная система). Дофамин синтезируется из тирозина с помощью критического фермента тирозингидроксилазы, сначала в L-ДОФА, который быстро декарбоксилируется декарбоксилазой ароматических кислот в дофамин. Дофамин накапливается в синаптических пузырьках с помощью везикулярного моноаминового транспортера-2 (VMAT2). После высвобождения во внеклеточное пространство дофамин воздействует на Д1 и Д2-подтипа дофаминовых рецепторов, которые относятся к классу G белок-связанных рецепторов. Наконец, в межклеточном пространстве дофамин диффундирует и подвергается метаболической деградации. Тем не менее основным путем элиминации дофамина из синаптической щели является обратный захват медиатора с помощью белка плазматической мембраны – дофаминовым транспортером (DAT). Рециркулированный дофамин в дофаминергических терминалах затем хранится в большом пуле внутриклеточных везикул, доступных для последующего повторного использования. Хорошо известно, что дофаминовая передача в дорзальном и вентральном стриатуме имеет важное значение для нормальной двигательной функции. На клеточном уровне стойкая гипердофаминергия у DAT-KO мышей и крыс приводит к изменению функции рецепторов дофамина.
Различия в функции дофамина в определенных областей мозга (например, VTA, Acb и mPFC) могут быть ответственны за различия в некоторых аспектах физиологического и патологического поведения, и, в целом, в мотивированном поведении. Так как у животных, нокаутных по гену дофаминового транспортера повышен уровень внеклеточного дофамина эти и многие другие функции, в которых принимает участие дофамин, изменены. По сравнению с DAT-KO мышами, DAT-KO крысы обладают гораздо более широким репертуаром сложных поведенческих реакций. Это позволяет использовать DAT-KO крыс для моделирования различных неврологических и нейропсихиатрических нарушений и рутинного тестирования новых фармакологических подходов для их коррекции. Кроме того, ранее, на мышах, нокаутных по гену дофаминового транспортера (DAT) было показано что ингибирование тирозингироксилазы, ключевого фермента в биосинтезе дофамина с использованием селективного ингибитора альфа-метил-пара-тирозина приводит к акинезии и ригидности. Поскольку у данных мышей отсутствует механизм обратного захвата дофамина, весь дофамин является новосинтезированным. Ингибирование синтеза дофамина приводит к полному его отсутствию у DAT-нокаутных животных, тогда как у нормальных животных происходит только частичное снижение без ярких моторных нарушений. В нашей лаборатории мы разрабатываем аналогичную модель на крысах (Дофамин-Дефицитные DAT нокаутные крысы, DDD крысы) которые имеют ряд преимуществ в экспериментальных протоколах по сравнению с мышами. Отсутствие дофамина может позволить оценить не-дофаминовые механизмы регуляции движения, а также оценить действие потенциальных антипаркинсонических препаратов. В лаборатории Гайнетдинова более 25 лет рутинно проводятся скрининг новых лекарственных средств, которые могут быть эффективны при состоянии повышенной дофаминергической передачи (на модели DAT-KO мышей и крыс) и отсутствия дофамина (на модели DDD мышей и крыс). Кроме того, в этом году мы сконцентрировались на исследовании параметров ЭЭГ на DAT-KO крысах под наркозом.
Действие ряда препаратов, применяемых в терапии психических заболеваний, происходит через дофаминовую систему. Исследования механизмов действия препаратов и вовлеченность дофамина в их действие является важным для развития фармакологической терапии психических заболевания. Препарат фонтурацетам оказывает выраженное антиамнестическое действие, активирует интегративную деятельность головного мозга, способствует консолидации памяти, улучшает концентрацию внимания и умственную деятельность и оказывает психостимулирующее воздействие. Фонтеруцетам оказывает воздействие на холинергическую и ГАМКергическую системы, однако его механизмы действия требуют дополнительного исследования. В связи с этим нами было проведено исследование действия фонтурацетама на выброс, внеклеточное содержание и скорость обратного захвата дофамина. Кроме того, нами было проведено исследование действие препарата фонтурацетам на параметры предимпульсного торможения - важного аспекта деятельности головного мозга, нарушения которого происходят при шизофрении.
Биполярное расстройство (БР) – это нейропсихиатрическое заболевание, характеризующееся чередованием маниакальных и депрессивных фаз, плавно перетекающих друг в друга. В то время как симптоматику промежуточных состояний охарактеризовать бывает достаточно сложно, крайние стадии, а именно, мания и депрессия, обладают набором характерных симптомов. Такими симптомами маниакального состояния являются гипертимия, а также психическое и двигательное возбуждение. Во время депрессивной фазы наблюдается обратная картина. Ряд исследований указывает на то, что в патогенезе БР задействована дофаминергическая система, которая контролирует, среди прочего, мотивацию, систему подкрепления и двигательную активность. Ключевые единицы дофаминергической системы – дофаминергические нейроны, способные синтезировать дофамин. Дофаминовая передача в центральной нервной системе (ЦНС) осуществляется посредством дофаминовых рецепторов – семейства рецепторов, связанных с G-белками, в состав которого входят Д1, Д2, Д3, Д4, Д5. Наибольший интерес в контексте БР представляет Д2 рецептор, специфическое ингибирование которого у животных в моделях мание-подобного поведения приводит к нивелированию симптоматики. Активация Д2 рецептора связана с рядом внутриклеточных сигнальных каскадов, в частности, MAPK киназами ERK1/2, а также каскадом Akt/GSK3β. В исследованиях на крысах было показано, что активация данных сигнальных каскадов напрямую связана с возникновением мание-подобного поведения. Одна из наиболее часто используемых моделей мание-подобного поведения – это уабаин-индуцированная. Уабаин входит в группу соединений, получивших название кардиотонических стероидов (КТС). О том, что КТС способны влиять на работу дофаминергической системы стало известно, когда было замечено, что при лечении сердечной недостаточности с помощью КТС дигоксина у пациентов наблюдались колебания настроения. Позже было показано, что КТС активируют вышеупомянутые сигнальные каскады посредством связывания с Na+, K+-АТФазой, которая как косвенно, так и напрямую взаимодействует с дофаминовыми рецепторами. В организме млекопитающих, в том числе в головном мозге, были обнаружены эндогенные КТС. Хроническое увеличение их концентрации в плазме крови было обнаружено при различных патологиях, в том числе, при маниакальной фазе БР. Последствия хронического увеличения количества КТС на физиологические функции ЦНС до сих пор недостаточно изучены, однако известно, что эффект КТС может быть связан с изменением моноаминергических систем передачи.
В последние годы было установлено участие сигнальной молекулы NO в развитии различных психиатрических нарушений. У пациентов с шизофренией было обнаружено повышенное содержание данного соединения в префронтальной области коры головного мозга и в гиппокампе. NO участвует в регуляции глутаматэргической, дофаминэргической и серотонинэргической систем, данное соединение влияет на синаптическую пластичность, жизнедеятельность нейронов и кровоток в сосудах головного мозга, в то же время в высокой концентрации оно может быть нейротоксичным. Синтез NO в организме осуществляется белками семейства NO-синтаз. Полиморфизмы генов этих ферментов связаны с развитием нейропсихиатрических заболеваний. Активность NO-синтаз регулируется с участием ферментов диметиларгинин-диметиламиногидролаз DDAH1 и DDAH2. Развитие психиатрических заболеваний связано как с изменением уровня экспрессии белков, задействованных в NO-сигналинге, так и с изменением их распределения в клетках нервной ткани и нарушением функционирования нисходящих сигнальных путей включая дофаминовую систему из-за системных изменений экспрессии генов.
Цель исследования: исследование функций дофаминовой системы.
Задачи исследования:
• Исследование параметров ЭЭГ на DAT-КО крысах под наркозом.
• Создание модели абсолютного дефицита дофамина на крысах (Дофамин-Дефицитные DAT нокаутные крысы, DDD крысы).
• Исследование параметров дофаминергической передачи у мышей, трансгенных по домену связывания PDZ у DAT.
• Исследование действия фонтурацетама на параметры пред-импульского торможения и дофаминовую систему.
• Исследование действия кардиотонических стероидов на дофаминовую систему на модельных объектах Danio rerio и мышах линии C57Bl/6.
• Сравнительный анализ кластеров генов, ко-эксперссирующихся с генами DDAH1 и DDAH2 в префронтальной коре человека в норме и при развитии психиатрических заболеваний.
• Анализ литературных данных о вовлеченности дофамина в патогенез психических заболеваний и алкоголизма.
2.Исследование функций серотониновой системы
Серотонин – один из основных нейромедиаторов в ЦНС и на периферии. Серотонин(5HT) относится к биогенным моноаминам, как и норадреналин, дофамин и гистамин. Серотонин часто называют «гормоном хорошего настроения». Серотонин участвует в формировании и регуляции различных физиологических параметров организма. Определяет общее качество жизни человека: тесно связан с функциями, вовлекаемыми в регуляцию настроения, реакции на стресс, сна, полового и пищевого поведения. Кроме того, является важным регулятором как других систем головного мозга, так и периферических систем организма. Серотонин имеет решающее значение для эмбрионального развития и постнатального роста в животном мире, включая формирование нервной системы.
Подсемейство цитохрома Р450 2D (CYP2D) является важным посредником в биотрансформации психотропных препаратов и стероидов в печени и играет ключевую роль в локальном метаболизме эндогенных субстратов (нейростероидов, нейротрансмиттеров), лекарств и токсинов в головном мозге. Ферменты CYP2D головного мозга катализируют метаболизм эндогенных нейроактивных субстратов, в т.ч. 21-гидроксилирование нейростероидов и образование моноаминергических нейротрансмиттеров альтернативными путями. Исследования на грызунах показали, что CYP2D мозга катализирует альтернативный путь синтеза дофамина через гидроксилирование тирамина и путь образования серотонина, который проходит через O-деметилирование 5-метокситриптамина.
Так называемые «мостиковые клетки», короткоживущая транзиторная популяция получающаяся из предшественников шванновских клеток и быстро станавящихся зрелыми хромаффинными клетками – клетками мозгового вещества надпочечников, характеризуются экспрессией Htr3a6,8 — гена, кодирующего субъединицу рецептора HTR3 к 5HT. На основании этого недавно было высказано предположение, что 5НТ является частью механизма, связанного с развитием мозгового вещества надпочечников.
В работах по изучению серотониновой системы, удобной моделью являются крысы с дефицитом критического фермента синтеза нейронального серотонина TPH2 (TPH2-KO), для которых характерно полное отсутствие серотонина в головном мозге, чтобы оценить влияние дефицита центрального серотонина на реакцию на поведенческие и биохимические процессы.
Цели исследования:
Исследование функции серотониновой системы
Задачи исследования:
• Исследование состояние дофаминовой системы у ТРН2-нокаутных крыс.
• Исследование уровня и активности белка CYP2D в избранных структурах головного мозга старых самок крыс с дефицитом серотонина, вызванного нокаутом гена Tph2.
• Исследование влияния серотонина на развитие хромаффинных клеток в надпочечниках мышей.
3.Изучение функции следовых аминов и их рецепторов (TAARs)
Долгое время следовые амины считались исключительно «ложными нейротрансмиттерами», модулирующими функцию классических моноаминов, таких как дофамин и серотонин, посредством амфетамин-подобного действия. Все изменилось с открытием в 2001 году рецепторов, связанных с следовыми аминогруппами (TAAR), связанных с G-белком. Показано, что следовые амины причастны к различным заболеваниям человека. У пациентов с депрессией было обнаружено снижение уровня фенилэтиламина. Предполагается, что к другим расстройствам, в которых следуют амины, относятся мигрень, кластерная головная боль, тревожные расстройства и эпилепсии. Рецепторы TAAR, активируются рядом летучих соединений ряда аминов. Долгое время считалось, что в основном, их основная функция связана с обонянием. У мышей 14 из 15 описанных рецепторов TAAR (все, кроме TAAR1) экспрессируются в обонятельном эпителии и в гломерулах отдельных обонятельной луковицы. При и этом в гломеруле может экспрессироваться только один из рецепторов семейства. Гломерулы, экспрессирующие рецепторы TAAR располагается преимущественно в дорсальной области луковицы. Последние исследования показали также, что рецепторы TAAR, по крайней мере, один из членов этого семейства, TAAR5, экспрессируются также в лимбических областях мозга, где расположены проекции от обонятельной системы. Эти части мозга задействованы в регуляции эмоционального поведения, а также являются нейрогенными зонами у взрослых животных. У беспозвоночных животных, следовые амины играют ключевую роль в работе нервной системы. В то время как у позвоночных животных, ясности о функциях следовых аминов гораздо меньше. Это, в частности, связано с тем фактом, что многие следовые амины образуются путем декарбоксилирования аминокислот, их функционирование в синаптической щели не связано с деполяризацией, вследствие чего они долгое время рассматривались только как побочные продукты аминокислот и моноаминов. Только открытие рецепторов к следовым аминам позволило выделить их в обособленную нейромедиаторную систему.
TAAR1 также может участвовать в регуляции щитовидной железы. Первичные реснички (ПР) представляют собой сенсорные органеллы на основе микротрубочек с различными рецепторами и каналами, участвующими в регуляции щитовидной железы. Экспрессия TAAR1 была локализована на ПР эпителиальных клеток щитовидной железы в экспериментах in vitro и in situ. Дальнейшие исследования показали, что делеция гена TAAR1 приводит к фенотипическим изменениям морфологии щитовидной железы и ее функциональной активности. Кроме того, визуализацию переноса мышиного TAAR1 в реснички эпителиальных клеток щитовидной железы проводили с помощью зеленого флуоресцентного белка. Кроме того, было высказано предположение, что высокая экспрессия TAAR1 может быть положительным прогностическим фактором общей выживаемости у больных раком яичников. Интересно, что рак яичников регулируется гормонами щитовидной железы и их производными. Однако роль TAAR в неканонической регуляции тиреоидной системы до сих пор неясна, и необходимы дальнейшие исследования.
Экспрессия рецептора TAAR1 была также обнаружена в β-клетках поджелудочной железы, желудке и кишечнике. Указана значительная роль TAAR1 и, возможно, других TAAR при диабете 2 типа и ожирении. Таким образом, такое воздействие TAAR1 на биологическую систему может привести к дисбалансу метаболизма и липидного обмена. Недавно мы обнаружили значительно сниженные изменения холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL-холестерин) в уровнях холестерина у крыс с нокаутом TAAR9.
В настоящее время предполагается, что рецепторы следовых аминов (TAARs) могут принимать участие в распознавании питательных веществ энтероэндокринными клетками кишечника и регуляции секреции ими биологически активных соединений.
Экспрессия TAAR9 и других рецепторов семейства TAARs была выявлена в слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта. Также установлено, что содержимое кишечника насыщено природными агонистами рецептора TAAR9, такими как полиамины путресцин и кадаверин. Эти соединения участвуют в регуляции гомеостаза слизистой оболочки кишечника, пролиферации клеток, их миграции, формирования между ними контактов и их гибели путём апоптоза. Снижение содержания полиаминов в кишечнике ассоциировано с гипоплазией и развитием воспалительных заболеваний, а повышение их содержания характерно для пациентов со злокачественными новообразованиями кишечника.
Содержимое кишечника включает ряд биологически активных моноаминов и полиаминов, среди которых ряд соединений являются лигандами рецепторов следовых аминов семейства TAAR. Поскольку одним из важных источников этих соединений является нормальная микрофлора кишечника, предполагается, что рецепторы TAAR могут принимать участие в регуляции взаимодействий между организмом и микробным сообществом в кишечнике. Кроме того, было установлено, что рецепторы семейства TAAR экспрессируются кишечным эпителием и различными клетками иммунной системы.
Транскриптомные «большие данные», представленные в биологических базах данных позволяют провести анализ, направленный на определение связей между экспрессией гена и биологическими процессами, происходящими в исследуемом материале. В рамках научной работы лаборатории было проведено исследование «больших данных», отражающих экспрессию мРНК в эпителии кишечника мыши и оценка корреляции между экспрессией мРНК TAAR9 и других генов.
В коллекции линий лабораторных животных, содержащейся в лаборатории, присутствуют крысы, являющиеся нокаутами по гену TAAR9. У данных животных обнаружено снижение содержания в сыворотке холестерола, связанного с липопротеинами низкой плотности. Причина выявленных изменений в настоящее время не установлена, они могут быть связаны как с метаболическими особенностями данной линии, так и со способностью усваивать вещества, поступающие в кишечник. Для определения влияния нокаута TAAR9 на сообщество микроорганизмов, колонизирующих кишечник животных, было проведено исследование микробного сообщества кишечника TAAR9-нокаутных животных и животных дикого типа.
Цели исследования:
Исследование функции рецепторов следовых аминов TAAR
Задачи исследования:
• Исследование сексуальной мотивации мышей TAAR1-KO, гормональных параметров и параметров биохимии крови.
• Биоинформатический анализ экспрессии TAAR9 в кишечнике мышей на основе транскриптомных данных, представленных в базах данных Expression Atlas и исследование кластеров генов, экспрессия которых коррелирует с экспрессией TAAR9.
• Выявление изменений кишечной микробиоты крыс при инактивации гена TAAR9.
Также в рамках проекта были проведены следующие исследования:
А) Изучение стресса социального поражения и его поведенческих последствий
Изучение последствий посттравматического стресса – актуальная тема в настоящее время. Модель стресса социального поражения – широко используемая животная модель для изучения развития ПТСР (посттравматического стрессорного расстройства), наблюдаемого у людей, переживших физическое или психологическое острое, или хроническое психотравмирующее событие, последствия которого могут сохраняться на многие годы. Ранее, с помощью нового метода быстрой сканирующей вольтамперометрии in vivo нами было показано значительное увеличение дофаминовой (ДА) нейротрансмиссии в районе прилежащего ядра, так же снижение эффективности Д2 антагониста раклоприда у крыс через 24 часа после окончания однократного стресса социального поражения.
Целью данной работы послужило изучение поведенческих последствий стресса социального поражения у лабораторных крыс.
Б) Исследование влияния редких однонуклеотидных вариантов в промоторе COL5A1 на восприимчивость к кератоконусу, связанному с rs1536482
Кератоконус – наиболее распространенное первичное эктатическое заболевание, связанное с истончением, растяжением и коническим выпячиванием центральной части роговицы. Прогрессирование этого заболевания может привести к серьезным нарушениям зрения из-за неровностей роговицы и рубцевания. Заболевание чаще всего манифестирует в подростковом возрасте и прогрессирует в течение 10–15 лет. Подходы на основе кератотопографии и оптической когерентной томографии улучшили диагностику кератоконуса на ранней стадии. Однако диагностика субклинического кератоконуса остается сложной задачей. Наличие недиагностированного заболевания у пациента может привести к тяжелым осложнениям после лазерных рефракционных вмешательств в виде проявления реактивного кератоконуса и его атипичного прогрессирования. Таким образом, разработка подходов к ранней диагностике кератоконуса имеет большое клиническое значение. Понимание генетической основы кератоконуса может облегчить его раннюю диагностику. Очаги предрасположенности к кератоконусу, даже те, о которых сообщалось ранее, плохо изучены у российских пациентов с кератоконусом. Пациенты с кератоконусом из России ранее были генотипированы по rs1536482 и rs7044529 в нашем пилотном исследовании на небольшой выборке.
Цели и задачи
Целью данного исследования было изучение репликации трех SNP (rs1536482 вблизи гена COL5A1, rs2721051 вблизи гена FOXO1, rs1324183 вблизи гена MPDZ) при кератоконусе у наибольшей выборки пациентов из России. Кроме того, мы исследовали редкие варианты промотора COL5A1 у пациентов с кератоконусом, по крайней мере, с одним минорным аллелем rs1536482.
В) Противоэпилептические эффекты карбеноксолона in vitro и in vivo
Эпилепсия является широко распространенным заболеванием центральной нервной системы, возникающим в результате аномальной синхронизации нейронов, которая вызывает повторяющиеся припадки, распространяющиеся по всему мозгу. Его основной особенностью является внезапное начало синхронизированной активности многих нейронов, приводящее к различным патологическим психомоторным проявлениям. Сегодня для противоэпилептической терапии используются фармакологические средства, диета, глубокая стимуляция мозга, а в тяжелых случаях и нейрохирургическое лечение. Несмотря на большой прогресс в разработке новых противоэпилептических препаратов, значительное число случаев эпилепсии являются фармакорезистентными. Кроме того, многие противоэпилептические препараты имеют значительные побочные эффекты. Таким образом, существует острая необходимость дальнейшего изучения эпилептогенеза и разработки новых противоэпилептических препаратов.
Гипотеза о том, что щелевые контакты (ЩК) играют значительную роль в механизмах, лежащих в основе эпилептических припадков, довольно популярна. Среди других аргументов в пользу этой гипотезы эпилептическая активность обычно определяется чрезмерной синхронностью нейронов, а ЩК усиливают синхронность. В последнее время накопились данные о том, что ингибитор ЩК карбенолоксон (CBX) регулирует синхронизацию нейронов и подавляет эпилептиформную активность в головном мозге.
Недавно было описано, что периодические сигналы в астроцитарном синцитии во время интериктальной фазы эпилептических приступов, вызванных 4-аминопиридином (4-АР), и эти сигналы коррелировали с синхронизированными нейронными спайками, тогда как иктальные события коррелировали с глубокой деполяризацией астроцитарного синцития и с вазомоторией. Остается неясным, зависят ли эти сигналы от ЩК между астроцитами и как блокирование этих каналов коррелирует с синхронизацией нейронов.
Самый простой способ заблокировать ЩК — с помощью лекарств, а наиболее часто используемым блокатором является CBX, который умеренно эффективен и растворим в воде. CBX уменьшает синхронизацию, связанную с припадками, в различных модельных системах как in vivo, так и in vitro. Однако CBX блокирует как астроцитарные ЩК, так и нейрональные ЩК. Таким образом, противосудорожные эффекты CBX и других блокаторов ЩК часто интерпретируются как свидетельство того, что электрические контакты между нейронами играют критическую роль в возникновении припадков, и поэтому прямые измерения в астроцитах представляют особый интерес.
Цель исследования
В данном исследовании мы исследовали влияние блокатора ЩК CBX на эпилептическую активность астроцитов in vitro, индуцированную широко используемым ингибитором калиевых каналов 4-AP, и соответствующую эпилептическую электрическую активность in vivo.
Г) Анализ данных о половом диморфизме патологических процессов при COVID-19
Обстановка, связанная с пандемией COVID-19, сложившаяся во всем мире в 2020-2022 годах, по сути, явилась вызовом для всего научного сообщества. Рауль Радикович Гайнетдинов вошел в коллектив специалистов по данной проблематике – в 2022 году в ведущем медицинском журнале Lancet Diabetes Endocrinology была опубликована обзорная статья по половому диморфизму при COVID-19: потенциал клинических и общественных последствия для здоровья.
Целью данной работы послужил критический анализ данных о половом диморфизме патологических процессов при COVID-19.
Таким образом, в Лаборатории Нейробиологии и Молекулярной Фармакологии СПбГУ проводятся многоплановые работы по оценке фармакологического потенциала классических и малоизученных моноаминовых систем мозга при различных психиатрических и нейродегенеративных заболеваниях. Эти исследования проводятся с использованием самых современных подходов: от клеточных in vitro методов, до использования трансгенных животных. Кроме того, поддерживается работа Вивариума, в котором содержатся несколько пород трансгенных крыс и мышей и создаются новые.
За время существования лаборатории было опубликовано более 100 полноценных публикаций в международных научных журналах включая Nature Genetics, Nature Communications, Science Translational Biomedicine, Cell Stem Cell, PNAS и др.
Деятельность лаборатории направлена на исследование моноаминергических систем мозга в норме и патологии и разработку на основе этих знаний фармакологических средств для терапии психических заболеваний. Для этого в лаборатории широко используются трансгенные животные как модели заболеваний мозга. Они являются ценными инструментами для изучения этиологии и патогенеза таких расстройств и также используются в исследованиях, направленных на поиск новых методов фармакологической коррекции этих состояний. Таким образом, на данном этапе, проводился комплекс исследований, направленный на исследование функции дофамина с использованием трансгенной модели дофаминергической патологии – крыс и мышей трансгенных по гену дофаминового транспортёра, изучалось влияние кардиотонических стероидов на дофаминовую систему, оценивалась двигательная активность и стереотипичность передвижения у мышей после хронического введения уабаина, проведен сравнительный анализ кластеров генов, ко-эксперссирующихся с генами DDAH1 и DDAH2 в префронтальной коре человека в норме и при развитии психиатрических заболеваний. Также у ТРН2-нокаутных крыс изучалось состояние дофаминовой системы, уровень и активность белка CYP2D в избранных структурах головного мозга, а также исследовалось влияние серотонина на развитие хромаффинных клеток в надпочечниках мышей. У TAAR1-KO мышей изучали сексуальную мотивацию, гормональные и биохимические параметры, проводили биоинформатический анализ экспрессии TAAR9 в кишечнике мышей на основе транскриптомных данных и изучали изменений кишечной микробиоты крыс при инактивации гена TAAR9. Кроме того, продолжились работы по изучению новой коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Таким образом, все запланированные научные цели были достигнуты и до конца года заявленное количество публикаций будет перевыполнено. Продолжение данной работы будет иметь прямое практическое применение в плане разработки новых фармакологических агентов для терапии заболеваний мозга и других нарушений, и, таким образом, иметь важное экономическое и социальное значение.
1)Исследование функции дофаминовой системы
•Исследование параметров ЭЭГ на DAT-KO крысах под наркозом.
Крысы WT, DAT-HET и DAT-KO демонстрируют существенно различающиеся результаты как на высокоомных, так и на низкоомных электродах, а также при пространственной синхронизации. Статистический анализ проводили с использованием двустороннего дисперсионного анализа ANOVA. Различные полосы частот анализировались отдельно. Метод ANOVA показал высокую значимость фактора «Генотип» – P <0,001 для всех четырех блоков данных как для планарного массива, так и для винтового электрода.
По спектральным данным планарной матрицы крысы НЕТ больше всего отклоняются от дикого типа, а крысы КО либо не отличаются от дикого типа, либо изменения были меньше, чем у крыс НЕТ. На некоторых частотах, в высокочастотных диапазонах «бета» и особенно «гамма», у крыс НЕТ была достоверно повышена мощность этих ритмов. Дельта-ритм при ГЭТ, напротив, был значительно ниже, чем при КО и ДТ. Различий в дельта-ритме между KO и WT не наблюдалось.
По данным низкоомного винтового электрода у крыс с КО изменения были более выраженными. У них была аномально высокая мощность дельта-ритма по сравнению с WT и HET (на частоте 2 Гц). Крысы WT и HET не показали различий в дельта-ритме, полученном с помощью винтовых электродов.
Мощность остальных диапазонов (альфа, бета и гамма), полученных от винтовых электродов, была снижена в КО по сравнению с WT и особенно по сравнению с HET. На высоких бета- и гамма-частотах HET имели более высокую спектральную мощность, которая даже отличалась от крыс WT, тогда как крысы KO показали противоположный результат, имея более низкую спектральную мощность, чем крысы WT.
Таким образом, суммируя все спектральные данные, можно сказать, что у HET увеличивается быстрая бета- и гамма-активность и снижается медленная дельта-активность, в то время как у КО, напротив, увеличивается дельта-активность и снижается бета- и гамма-активность. Другими словами, спектр ЭКоГ у КО смещен в сторону медленных волн, а у HET больше в сторону высокочастотной активности.
У крыс KO пространственная синхронизация между всеми 32 сайтами массива NeuroNexus, рассчитанная в гамма-диапазоне 30–100 Гц, была значительно ниже по сравнению с крысами WT (P = 0,0040) и по сравнению с HET (P = 0,0101). Аналогичные результаты мы ранее показали для крыс в пробужденном состоянии в хронических экспериментах с гипотетическим препаратом гипердофаминергия. Пространственная синхронизация у крыс HET близка к норме.
Таким образом, нами было подтверждено, что внеклеточный дофамин у крыс DAT модулирует глубину седации в сходных условиях анестезии, но, как это ни парадоксально, в разных направлениях при HET и KO по сравнению с WT. У HET диссоциативная анестезия нарушает седативный эффект, о чем свидетельствует усиление бета- и гамма-ритмов. Можно предположить, что внеклеточная потенциация D2-рецепторов при HET приводит к умеренной стимуляции (по-видимому, лимбической системы и коры) за счет снижения функции тормозных интернейронов и растормаживания главных релейных нейронов. У КО при диссоциативной анестезии наблюдается более глубокий седативный эффект за счет угнетения таламокортикальной передачи, о чем свидетельствует усиление дельта-ритма и снижение бета- и гамма-ритма. По-видимому, более значительная потенциация D2-рецепторов при КО приводит к подавлению базальной синаптической передачи (глутаматергической) в релейных нейронах.
•Создание модели абсолютного дефицита дофамина на крысах (Дофамин-Дефицитные DAT-нокаутные крысы, DDD крысы).
Поскольку у DAT-нокаутных крыс отсутствует механизм обратного захвата дофамина, весь дофамин является новосинтезированным.
Таким образом ингибирование тирозингироксилазы, ключевого фермента в биосинтезе дофамина с использованием селективного ингибитора альфа-метил-пара-тирозина (250 мг/кг, интраперитонеально) привело к практически полному исчезновению дофамина в стриатуме (0,1%, n=5) и акинезии в течении как минимум 8 часов. DDD крысы рутинно используются в лаборатории для скрининга новых антипаркинсонических средств.
•Исследование параметров дофаминергической передачи у мышей, трансгенных по домену связывания PDZ у DAT.
Чтобы исследовать динамику высвобождения и обратного захвата везикулярного дофамина, мы выполнили записи FSCV на срезах полосатого мозга. Интересно, что в срезах, полученных от мышей DAT-AAA, мы наблюдали повышенные пиковые концентрации DA (примерно в 7,5 раза выше, чем у WT) после стимулированного высвобождения (WT, 0,072 ± 0,025 мкМ; DAT-AAA, 0,544 ± 0,27 мкМ, p < 0,05). В соответствии с заметно сниженными уровнями DAT данные, кроме того, выявили значительно более длительный клиренс DA (примерно в четыре раза дольше) у мышей DAT-AAA по сравнению с WT (WT, тау = 0,62 ± 0,06; DAT-AAA, тау = 2,4 ± 2,8, p < 0,05). Затем мы рассмотрели возможные изменения в функции пресинаптических ауторецепторов D2R, поскольку нарушение функции ауторецепторов может способствовать повышенным уровням высвобождения DA у мышей DAT-AAA. Соответственно, мы определили с помощью FSCV влияние агониста D2R квинпирола на стимулированное высвобождение дофамина. Как у мышей DAT-AAA, так и у мышей WT квинпирола блокировал высвобождение DA, поддерживая сохраненную функцию ауторецептора D2R у мышей DAT-AAA.
•Исследование действия фонтурацетама на параметры пред-импульсного торможения и дофаминовую систему.
При оценке параметров пред-импульсного торможения оценивалась амплитуда вздрагивания животного (амплитуда стартл-рефлекса) на громкий стимул (пульс), а далее на комбинацию тихого и громкого стимулов (пре-пульс+пульс). Амплитуда двигательной реакции крыс в случае наличия предупреждающего более тихого сигнала (комбинация пре-пульс+пульс) достоверно снижалась. На основании разницы между амплитудами вздрагиваний на пульс и комбинацию пре-пульс+пульс по формуле рассчитывали коэффициент пред-импульсного торможения PPI, выраженный в процентах.
Однофакторный дисперсионный анализ средних значений PPI четырех групп крыс показал наличие достоверных различий между группами (one-way ANOVA, p = 0,0064). Сравнение коэффициента PPI по пост-тесту множественных сравнений Даннета у крыс экспериментальных групп по сравнению с группой, получившей растворитель (vehicle), не выявило достоверных изменения данного параметра в группах, получавших фонтурацетам в дозе 50 либо 100 мг/кг по сравнению с контролем. Значения PPI у группы животных, получавших 150 мг/кг достоверно ниже, чем у контрольной группы (# p < 0,0125).
Таким образом, фонтурацетам в дозе 150 мг/кг достоверно снижал коэффициент пред-импульсного торможения PPI по сравнению с животными, получившими растворитель.
Была проведена серия экспериментов по оценке влияния фонтурацетама на механизм обратного захвата дофамина в прилежащем ядре (Nac) методом циклической вольтамперометрии с быстрым сканированием. Были использованы 10 крыс дикого типа (WT), самцы в возрасте 4-6 месяцев. Доза вещества – фонтурацетам в дозе 50 мг/кг (n=3); в дозе 100 мг/кг (n=4); в дозе 150 мг/кг (n=3). Инъекции веществ проводили внутрибрюшинно.
После установки электродов в течении часа проводилась запись, во время которой измерялись параметры выброса и захвата дофамина в ответ на электрическую стимуляцию вентральной области покрышки (VTA) с интервалом в 10 минут без введения веществ. Данные измерения использовались как контрольные значения (Base). Через час вводился препарат заданной дозировки и запись продолжалась в прежнем режиме.
В качестве оценки использовались максимальный уровень дофамина после стимуляции и скорость убывания дофамина на промежутке от его наивысшего значения до 80%. Результаты нормировались, за 1 принимались среднее максимального уровня дофамина после стимуляции и среднее скорости убывания дофамина за последние 4 измерения перед введением препарата.
Измерение максимальных уровней дофамина в ответ на стимуляцию показало достоверных рост при введении животным фонтурацетама в дозировках 100 и 150 мг/кг.
Были получены достоверные различия между размерами скорости убывания дофамина до введения препарата и после введения препарата в дозировках 100 и 150 мг/кг.
Эти результаты можно связать со снижением активности транспортёра дофамина, благодаря чему были увеличены максимальные уровни дофамина и замедлен его обратный захват.
•Исследование действия кардиотонических стероидов на дофаминовую систему на модельных объектах Danio rerio и мышах линии C57Bl/6.
Оценка поведения Danio rerio в тесте нового аквариума после 7-дневного воздействия 2 мкМ/л дигоксина
Через 7 дней после изначального добавления дигоксина растворенного в ДМСО (до конечной концентрации 2 мкМ/л) или чистого ДМСО в аквариумы, поведение рыб оценивали в тесте нового аквариума (ТНА).
7-дневное воздействие 2 мкМ дигоксина вызвало значительные изменения во всех поведенческих параметрах, которые были оценены в данном тесте. 2 мкМ дигоксина вызвало гиперактивность животных в ТНА относительно контрольной группы, выражающуюся в увеличении пройденного расстояния (0,7 раз, p < 0,005), повышенной подвижности (0,5 раз, p < 0,01) и более продолжительными периодами активности животных (1,2 раз, p < 0,01). При этом, 7-дневное воздействие 2 мкМ дигоксина имело анксиолитический эффект, выраженный в большей продолжительности нахождения животных в верхней зоне аквариума и большем количестве переходов между зонами в ТНА. Полученные данные согласуются с экспериментами, проведенными ранее на мышах линии C57/Bl6, где внутрижелудочковое введение кардиотонического стероида уабаина вызывало снижение уровня тревожности в приподнятом крестообразном лабиринте и гиперлокомоцию в тесте открытое поле. Кроме того, полученные на Danio rerio результаты согласуются с результатами, полученными ранее на крысах Wistar при моделировании мание-подобного состояния при помощи внутрижелудочкого введения уабаина.
Измерение количества дофамина, серотонина и их метаболитов в мозге Danio rerio после 7-дневного воздействия 2 мкМ дигоксина
В мозге рыб после 7-дневного воздействия 2 мкМ дигоксина измеряли концентрацию дофамина (DA), серотонина (5-HT), 3-метокситирамина (3-MT), норадреналина (NA) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA). Измеренные концентрации соединений нормировали на количество белка в пробах.
7-дневное воздействие 2 мкМ дигоксина не вызывало значительных изменений в количестве дофамина в мозге рыб. Количество серотонина снижалось с 244 пмоль / мг белка до 176,7 пмоль / мг белка (в 1,38 раза) (p < 0,05). В то же время, количество метаболита дофамина 3-MT увеличивалось с 4 пмоль / мг белка до 12,4 пмоль / мг белка (в 3,1 раза) (p < 0,05), а NA снижалось с 356,1 пмоль / мг белка до 256,4 пмоль / мг белка (в 1,4 раза) (p<0,05). При этом, в отличие от 5-HT, количество его метаболита 5-HIAA не изменялось. Количество гомованилиновой кислоты и 3,4-гидроксииндолуксусной кислоты в образцах оказалось ниже предела чувствительности количественного анализа на использованном приборе.
Исходя из полученных данных можно предположить, что у рыб избыток внеклеточного DA в большей степени метаболизируется катехол-О-метилтрансферазами, в отличие от грызунов, что позволило количественно определить 3-MT. Исходя из данных, полученных на грызунах, можно предположить, что нарушение функции Na+,K+-АТФазы под воздействием дигоксина приводит к нарушению обратного захвата дофамина и его более активной метаболизации, чем в норме. Уменьшение количества NA и 5-TH можно объяснить нейротоксическим воздействием дигоксина, но данное предположение требует дальнейшего изучения.
•Оценка двигательной активности и стереотипичности передвижений мышей линии C57Bl/6 после хронического ICV введения 1,5 мкл 50 мкМ уабаина.
Для исследования того, может ли хроническое введение КТС вызывать изменения в поведении животных через сутки после последнего введения проводили 4-дневное ICV введения 1,5 мкл 50 мкМ уабаина. Двигательную активность оценивали непосредственно после первого введения, а также через сутки после последнего введения.
Однократное ICV введение 1,5 мкл 50 мкМ уабаина вызывало увеличение двигательной активности животных в 2 раза (p<0,05) в 20 мин тесте «открытое поле» непосредственно после введения относительно группы контрольных животных. Через сутки после 4-го введения двигательная активность животных, которым вводили уабаин, в 20 мин тесте «открытое поле» была в 1,9 раза больше (p < 0,05), чем группы контрольных животных. Стереотипичность передвижений по открытому полю также была выше в группе животных, которым вводили уабаин, относительно группы контрольных животных в 8,8 раза (p < 0,05).
Таким образом можно сделать вывод о том, что при многократном введении эффекты уабаина на двигательную активность и стереотипичность передвижений мышей сохраняются в течение суток, что может свидетельствовать о хронических изменениях работы дофаминергической системы.
•Сравнительный анализ кластеров генов, ко-эксперссирующихся с генами DDAH1 и DDAH2 в префронтальной коре человека в норме и при развитии психиатрических заболеваний.
Экспрессия DDAH1 и DDAH2 на уровне мРНК была выявлена в образцах дорзолатеральной коры как у пациентов с психиатрическими заболеваниями, так и в контрольной группе без выявленных заболеваний головного мозга. Существенных различий по уровню экспрессии между указанными группами отмечено не было.
В ходе более детального анализа набора данных GSE112523 было установлено, что в кластерах генов, коэкспрессирующихся с DDAH1 и DDAH2 в префронтальной коре при развитии психиатрических заболеваний семантическое сходство описаний в терминах GO снижается, что может косвенно свидетельствовать о нарушении функциональных связей продуктов этих генов.
Далее, среди генов, коэксперссирующихся с генами DDAH1 и DDAH2, были выявлены те, для продуктов которых ранее было описано взаимодействие с ферментами DDAH1 и DDAH2. В сформированных кластерах был проведён анализ обогащения групп Gene Ontology. В результате было установлено, что в префронтальной коре пациентов с шизофренией отмечается ко-экспрессия гена DDAH1 с генами, продукты которых вовлечены в транспорт и метаболизм белков и аминокислот, в то время как у здоровых пациентов преобладала ассоциация с генами, вовлечёнными в ответ клетки на внешние стимулы. Статистически значимых связей между экспрессией DDAH1 и какой-либо группой генов, характеризуемых общими терминами GO в образцах префронтальной коры пациентов с биполярным расстройством не выявлено. Среди генов, ко-экспрессирующихся с DDAH2 во всех группах преобладали гены, связанные с ответом на гипоксию.
Также было отмечено, что в норме гены, коэкспрессирующиеся с DDAH1 и DDAH2 находятся преимущественно под контролем транскрипционных факторов семейства CxxC. Эта связь утрачивается у пациентов с шизофренией и биполярным расстройством. Среди генов, в норме ко-экспрессирующихся с DDAH2 в образцах контрольной группы, преобладали гены, в промоторе которых присутствовал мотив, распознаваемый транскрипционными факторами C2H2, ассоциация утрачивалась у пациентов с шизофренией, но сохранялась при биполярном расстройстве. Также, при биполярном расстройстве, отмечалось возникновение новых взаимосвязей с многочисленными транскрипционными факторами различных семейств.
Анализ обогащения наборами генов, характеризуемых терминами DO, позволил установить, что в норме гены, связанные с термином “DOID:0060037: a developmental disorder of mental health”, ко-экспрессируются с DAAH1. Эта связь утрачена у пациентов с психиатрическими заболеваниями. Коровая группа генов, определяющая статистически значимую связь, вовлечена в процессы регуляции мембранного потенциала, аксоногенеза и формирования межклеточных контактов.
Сходным образом, только в контрольной группе выявлена ассоциация генов, ко-экспрессирующихся с DDAH2 с ментальными нарушениями, в частности отмечена коэкспрессия DDAH2 с генами, характеризующимися терминами “DOID:0060037: a developmental disorder of mental health” и “DOID:0060041: autism spectrum disorder”/“DOID:12849:autistic disorder”. Гены, определяющие данную ассоциацию, участвуют в формировании синаптической трансмиссии (включая дофаминергическую передачу), а также когнитивных функциях, таких как обучение и память.
•Анализ литературных данных о вовлеченности дофамина в патогенез психических заболеваний.
Прогресс в развитии технологий мониторинга динамики нейротрансмиттеров в режиме реального времени предоставил исследователям эффективные инструменты для изучения этиологии и молекулярных механизмов нервно-психических расстройств. Одним из таких мощных инструментов является циклическая вольтамперометрия с быстрым сканированием (FSCV), метод, который постепенно используется в животных моделях различных патологических состояний, связанных с изменениями в передаче дофамина. Действительно, в течение нескольких десятилетий исследования FSCV обеспечили существенное понимание нашего понимания роли аномальной дофаминергической передачи в патогенетических механизмах наркотической и алкогольной зависимости, болезни Паркинсона, шизофрении и т. д.
Общий принцип электрохимических методов, в том числе и FSCV, основан на окислении и восстановлении электроактивных соединений при приложении к электроду определенного потенциала и измерении возникающего тока. Различия в способах удержания потенциала и измерения генерируемого тока обеспечивают преимущества и ограничения некоторых электрохимических методов. Были рассмотрены особенности, которые делают FSCV подходящим и, возможно, более распространенным, чем другие методы для исследования аномалий, связанных с передачей дофамина, а также рассмотрены недостатки данного метода.
Несмотря на многолетние комплексные фундаментальные и прикладные исследования психических заболеваний, современная медицина все еще испытывает дефицит эффективных фармакотерапевтических средств. Отчасти это связано с необходимостью лучшего понимания молекулярных и нейронных механизмов, лежащих в основе патогенеза заболеваний головного мозга. С одной стороны, это можно объяснить сложностью разработки трансляционных животных моделей патологических состояний. С другой стороны, предыдущие достижения зависели от современного состояния нейробиологических технологий для анализа задействованных молекулярных механизмов. Большинство используемых систем обнаружения в лучшем случае были ограничены во временном и пространственном разрешении, а также в их способности проводить аналитические подходы в реальном времени на системном уровне. Одним из успешных методов, способных преодолеть эти ограничения, является FSCV. Действительно, исследования FSCV на животных моделях позволили лучше понять роль измененной дофаминергической передачи в нейрохимических механизмах наркомании, болезни паркинсона и шизофрении. Возможно, изучение других нейропсихиатрических патологий, таких как синдром дефицита внимания и гиперактивности, болезнь Альцгеймера и синдром Туретта, в связи с аномалиями дофамина, также может принести пользу от FSCV. Например, лишь в нескольких исследованиях болезни Альцгеймера на животных до сих пор сообщалось об использовании FSCV. Точно так же мало исследований роли дофаминового транспортера в моделях животных, связанных с синдромом дефицита внимания и гиперактивности.
Новое многообещающее применение FSCV началось в доклинических и клинических исследованиях. В настоящее время ряд исследовательских групп впервые начали исследования FSCV in vivo на человеческом мозге и предприняли обнадеживающие усилия по внедрению FSCV у пациентов. Тем не менее, научное и клиническое сообщество должно принимать во внимание большую осведомленность при оценке рисков таких стратегий для безопасности пациентов. Наконец, FSCV является постоянно и быстро прогрессирующей методикой. Недавние достижения включают в себя новые электродные технологии, которые обеспечивают более чувствительные, менее опасные, долгосрочные и беспроводные записи, оптимизированную обработку данных и расширенный анализ. Однако будущие разработки требуют сочетания FSCV с другими передовыми технологиями, такими как многосайтовое обнаружение и машинное обучение. Следовательно, дальнейший прогресс в методологии FSCV необходим для облегчения наших знаний о нейрохимических механизмах нарушений головного мозга, которые в конечном итоге могут привести к разработке более эффективных методов лечения.
Используя различные модели животных, которые имитируют ключевые особенности расстройства, связанного с употреблением алкоголя (AUD), был достигнут значительный прогресс в определении нейрохимических мишеней, которые могут способствовать развитию алкогольной зависимости. Долгое время считалось, что в этом поиске дофаминовая (DA) и норадреналиновая (NA) системы играют ведущую роль по сравнению с другими системами мозга. Однако недавнее развитие и применение оптогенетических подходов в области исследований алкоголя предоставило возможность идентифицировать нейронные цепи и специфические паттерны нейротрансмиссии, которые управляют ключевыми компонентами поведения, вызывающего зависимость от этанола. В частности, мы сосредоточились на недавних оптогенетических исследованиях, направленных на выявление причинно-следственных связей между поведением, связанным с употреблением этанола (поиском и потреблением), и динамикой катехоламинов в различных проводящих путях мозга. Эти исследования позволяют получить знания, необходимые для лучшего понимания механизмов зависимости и, следовательно, для разработки более эффективных методов лечения AUD. На основании проанализированных данных были обозначены новые направления, которые могут иметь широкое применение за пределами области алкогольной зависимости.
2)Исследование функции серотониновой системы
•Исследование состояния дофаминовой системы у ТРН2-нокаутных крыс.
По нашим результатам не было обнаружено достоверно значимых различий между животными TPH2 KO и WT в электрически-вызванной концентрации дофамина в прилежащем ядре мозга при электрических стимуляциях с частотами 5-60 Гц.
Исходя из полученных данных были обнаружены достоверно значимые (р<0,04) различия в общей скорости восстановления у крыс TPH2 WT и KO, наиболее значительно они проявлялись через 30 минут после начала теста. Кроме того, в отличие от животных дикого типа (120,8±8,1%), у крысы TPH2 КО не происходит полного восстановления уровня дофамина (84,3±11,2%) до исходных значений.
Эти данные могут свидетельствовать о том, что у животных, нокаутов по гену TPH2 нарушены процессы, связанные с синтезом дофамина.
•Исследование уровня и активности белка CYP2D в избранных структурах головного мозга старых самок крыс с дефицитом серотонина, вызванного нокаутом гена Tph2.
Активность CYP2D и уровень белка достоверно повышались в стволе головного мозга стареющих (18-месячных) самок крыс Dark Agouti WT до 113% и 138%, соответственно, от таковых у половозрелых (15-недельных) крыс. Однако активность CYP2D и уровень белка заметно снижались с возрастом в ряде других структур мозга самок крыс Dark Agouti WT, а именно в гиппокампе (до 86% и 84% от контроля соответственно), коре (до 79% и 84% от контроля соответственно) и мозжечок (до 83% и 89% от контроля соответственно), но не изменились в остальных исследованных структурах (лобная кора, гипоталамус, таламус и стриатум). В печени активность CYP2D и уровень белка значительно снизились у стареющих самок крыс Dark Agouti WT (до 65% и 72% от контроля соответственно). В головном мозге активность CYP2D и уровень белка достоверно снижались в двух структурах стареющих самок крыс линии TPH2-KO: в лобной коре (до 80 и 82% соответственно) и гипоталамусе (до 75 и 68% соответственно). соответственно) по сравнению со стареющими самками крыс WT. Активность фермента в стволе головного мозга заметно снизилась до 81% у стареющих самок TPH2-KO, однако уровень белка не изменился. Активность CYP2D и уровень белка существенно не изменились в других исследованных структурах мозга или в печени самок TPH2-KO по сравнению со стареющими животными дикого типа. Процесс старения и дефицит TPH2 влияют на активность CYP2D и уровень белка в головном мозге и печени самок крыс.
•Исследование влияния серотонина на развитие хромаффинных клеток в надпочечниках.
Для изучения влияния дефицита 5HT на развитие хромаффиновых клеток были проанализированы несколько моделей мышей с редукцией эмбрионального и материнского 5HT. Эмбрионы Tph2-/-, полученные от самок Tph2+/-, лишены 5HT, полученного из центральной нервной системы мутантных эмбрионов, хотя материнский 5HT остается неизменным. Количество хромаффинных клеток TH+ не различалось у эмбрионов Tph2-/- по сравнению с их однопометниками Tph2+/-, выступающими в качестве контроля. Один из основных периферических источников 5НТ у эмбриона представлен энтерохромаффинными клетками, которые начинают секретировать 5НТ на Е15.510 и поэтому не могут участвовать в развитии надпочечников на Е12.5–Е13.5. Таким образом, редукция эмбриональных источников 5HT не является критической для развития хромаффинных клеток, в то время как внеэмбриональный 5HT может быть важен. Чтобы выяснить, как полное удаление 5HT как из материнского, так и из эмбрионального источников влияет на развитие хромаффинных клеток в эмбрионе, мы воспользовались преимуществами модели полного отсутствия серотонина в организме Tph1-/-; Tph2-/-; Модели мышей Tph1-/-; Tph2-/-; у которых отсутствует способность продуцировать центральный и периферический 5HT и избирательно транспортировать его в клетки как у матерей, так и у потомства. Мы проанализировали эмбрионы E13.5 от этих моделей мышей на количество хромаффинных клеток и 5HT+ клеток в надпочечниках. На E13.5 количество 5HT + клеток продемонстрировало снижение от 80% до 95% у всех животных с нокаутом (KO) по сравнению с контролем C57BL / 6. Среднее количество TH+ хромаффинных клеток также оказалось сниженным у KO (в Tph1-/-; Tph2-/- на 11,4%, в Tph1-/-; в Tph1-/-; Tph2-/ −; исходя из разницы между средними значениями). Чтобы проверить, было ли снижение хромаффинных клеток специфичным, мы измерили количество клеток в ганглиях симпатической цепи. Количество TH+ симпатобластов в ганглиях симпатической цепи было значительно ниже у эмбрионов КО по сравнению с эмбрионами дикого типа (у Tph1-/-; Tph2-/- на 17,8%, у Tph1-/-;), что указывает на общую задержку развития и снижение эмбрионального роста, независимо от клеточного происхождения и из-за отсутствия материнского 5HT. Следовательно, снижение количества хромаффинных клеток в моделях с дефицитом 5НТ не является специфичным для мозгового вещества надпочечников. Следует отметить, что количество прекурсоров клеток Шванна не изменилось в мозговом веществе надпочечников и ганглиях симпатической цепи у контрольных и нокаутированных эмбрионов, потому что прекурсоры клеток Шванна зависят от локальной иннервации, исходящей из другого места. Экспрессия мРНК Htr3a была очевидна в надпочечниках Tph1-/-; Tph2-/-; E13.5, что указывает на то, что «мостиковые» клетки все еще присутствуют в KO. В целом, эти эксперименты продемонстрировали, что снижение материнского и эмбрионального 5HT не оказывает специфического влияния на количество хромаффинных клеток, в отличие от избытка 5HT в течение критического временного окна развития.
3)Исследование следовых аминов
•Исследование сексуальной мотивации мышей TAAR1-KO, гормональных параметров и параметров биохимии крови.
Контрольная группа (CTRL) без мышей-самок в камерах показывает, что в отсутствие сексуального стимула мыши-самцы не имеют предпочтения в отношении места в экспериментальной зоне. Отмечено статистически значимое влияние присутствия самок на количество посещений женской зоны и процент времени пребывания в носовой зоне мышей дикого типа (F (1, 107) = 20,93). , p < 0,0001 и F (2, 167) = 26,81, p < 0,0001 соответственно).
При наличии сексуального стимула нет существенных различий в количестве посещений зоны самки и проценте времени пребывания в зоне носа между мышами WT и TAAR1-KO (F (1, 115) = 1,246, р = 0,2666 и F (1, 115) = 1,254, р = 0,2651 соответственно). Все остальные поведенческие параметры сексуальной мотивации также показали минимальные изменения. Кроме того, анализ тестостерона в крови не выявил существенных различий между мышами WT и TAAR1-KO.
Сравнительный анализ TAAR1-KO и WT мышей не выявил существенных различий по основным биохимическим показателям, таким как аланинаминотрансфераза, аспартатаминотрансфераза, общий белок, мочевина, лактатдегидрогеназа, альбумин, общий билирубин, креатинин. Только уровни креатининкиназы были значительно снижены у мутантных мышей.
•Биоинформатический анализ экспрессии TAAR9 в кишечнике мышей на основе транскриптомных данных, представленных в базах данных Expression Atlas и исследование кластеров генов, экспрессия которых коррелирует с экспрессией TAAR9.
Было проведено исследование группы, включавшей 28 образцов тканей слепой кишки. В 75 % образцов была выявлена экспрессия TAAR9 на уровне выше порогового значения 0.5 CPM.
Анализ генов, экспрессия которых коррелирует с уровнем экспрессии TAAR9 позволил выявить связи между экспрессией данного гена и генов, вовлечённых в регуляцию структуры мембраны, ГТФ-азной активности, гидролазной активности, апоптоза, адгезии и дифференцировки клеток.
Было установлено, что TAAR9 ко-экспрессируется с генами, вовлечёнными в регуляцию фундаментальных процессов, необходимых для гомеостаза кишечного эпителия. Также отмечена корреляция с белками комплекса SNARE, задействованного в транспорте белков и липидов через мембрану энтероцитов, а также в формировании контактов между ними. Кроме того, была обнаружена корреляция между экспрессией TAAR9 и генов, задействованных в сигнальных путях дофамина. Ранее были описаны димеризация TAAR1 с рецептором дофамина 2 D2R, модулирующая сигнальную функция данного рецептора, а также влияние гена TAAR5 на дофаминергическую трансмиссию у лабораторных животных, однако взаимосвязи TAAR9 и регулируемых дофамином процессов пока не изучены. При этом дофамин участвует в регуляции секреции и абсорбции в кишечном эпителии.
•Выявление изменений кишечной микробиоты крыс при инактивации гена TAAR9.
На основании полученных данных было проведено сравнение числа таксонов (α-разнообразия) между исследованными группами. Было установлено, что при инактивации гена TAAR9-KO у крыс повышается разнообразие состава кишечной микробиоты на уровне рода (число родов, коэффициенты Chao1, ACE), однако гомогенность сообществ остаётся на прежнем уровне (коэффициент Shannon повышен в группе нокаутных животных, однако коэффициенты Pielou и Simpson имеют сходные значения).
При оценке β-разнообразия сообщества методом анализа главных координат также было выявлено различие между структурами микробиома у животных дикого типа и нокаутных по гену TAAR9 (p < 0,05).
Несмотря на выявленные различия, статистически значимого преобладания определённых таксономических групп у TAAR9-нокаутных животных и животных дикого типа выявлено не было. При этом было отмечено, что представители семейства Saccharimonadaceae не выявляются в образцах, полученных от крыс дикого типа, при этом данное семейство является одним и 10 наиболее представленных в составе микробиоты у крыс с нокаутом гена TAAR9.
Семейство Saccharimonadaceae в составе филы «Candidatus Saccharibacteria» объединяет эпибионтов, колонизирующих поверхность бактериальных клеток. Установлены ассоциации данного семейства с представителями фил Bacteroidetes, Actinobacteria и Proteobacteria. Повышенное содержание представителей Saccharimonadaceae в составе нормальной кишечной микробиоты, согласно имеющимся литературным данным, может быть связано как с более благоприятными состояниями организма, так и с воздействием канцерогенов или риском развития аутоиммунных заболеваний. По всей видимости, присутствие этих бактерий в составе сообщества зависит от обилия видов, с которыми они способны вступать в ассоциации, и может отражать какие-либо изменения, которые не были выявлены в рамках представленного исследования из-за недостаточной чувствительности применённой методики.
4)Другие исследования Лаборатории нейробиологии и молекулярной фармакологии
•Изучение стресса социального поражения и его поведенческих последствий.
Полученные данные наглядно показывают, что однократный стресс социального поражения приводит к выраженному увеличению замирания (p < 0,0001), исследовательской активности (p = 0,02), так же другого поведения (стояние на месте, локомоторная активность) (p = 0,004) в процессе ССП и эффективен для моделирования ПТСР.
Показано достоверное увеличение времени неподвижности в тесте Порсолта у животных после ССП по сравнению с контролем (* – p=0,043), полученные данные могут свидетельствовать о депрессивно-подобном состоянии.
•Исследование влияния редких однонуклеотидных вариантов в промоторе COL5A1 на восприимчивость к кератоконусу, связанному с rs1536482.
Мы обнаружили, что три выбранных варианта, rs1536482, rs2721051 и rs1324183, имели значительную разницу в частоте минорного аллеля между кератоконусом и контрольной группой. Кроме того, мы сравнили объединенные размеры эффектов rs1536482, rs2721051 и rs1324183 из опубликованных исследований ассоциации кератоконуса в когортах европейского происхождения, чтобы охарактеризовать размещение российской когорты кератоконуса. Мы обнаружили, что rs1536482 и rs2721051 имели однородные размеры эффекта в когортах европейского происхождения с кератоконусом, включая российскую когорту. Это может указывать на то, что в этих популяциях имеется постоянная доля пациентов, несущих причинные варианты в блоках неравновесия по сцеплению, содержащих минорные аллели этих вариантов. rs1324183 показал более высокую частоту возникновения в российской когорте кератоконуса, чем в когортах других европейских предков. Этот результат отражал низкие частоты минорных гаплотипов (5,4 и 3,4%) в контрольных группах, что может быть специфической чертой российской популяции. Этот вывод требует дальнейшего изучения на более крупных выборках.
•Противоэпилептические эффекты карбеноксолона in vitro и in vivo.
Анализ записей ЭКоГ показал, что ни у одного из животных, получавших только физиологический раствор или CBX (контрольная группа), не было признаков эпилептиформной спайк-волновой активности (СВА). Анализ поведения животных в экспериментальном боксе после введения этих веществ в кору головного мозга также не выявил патологических проявлений эпилептической судорожной двигательной активности. В опытах после введения эпилептогена 4-АР наблюдалось развитие эпилептиформной СВА, но степень ее выраженности была различной в двух опытных группах.
У крыс 1-й группы, наблюдались более тяжелые формы эпилептиформной активности. Среди крыс, получавших 4-АР после введения физиологического раствора, у 100% животных наблюдался СВА, а у 83% (5 из 6 животных) — развитие эпилептического статуса. У крыс 2-й группы, которым ранее вводили CBX, было значительно меньше проявлений экспериментальной эпилепсии. Таким образом, предварительное интракортикальное введение CBX значительно снижало выраженность эпилептиформной активности после введения 4-AP, при этом только у 17% (1 крыса из 6) наблюдалось развитие эпилептического статуса.
Сравнение латентных периодов возникновения эпизодов СВА показало значительное увеличение латентности первого эпизода у крыс, получавших 4-АР после КБХ, по сравнению с крысами, получившими 4-АР после физиологического раствора. Продолжительность эпизодов СВА (вне эпилептического статуса) у крыс обеих экспериментальных групп достоверно не отличалась (32,9 ± 2,9 с и 30,2 ± 2,9 с соответственно). Количество эпилептических эпизодов также не показало существенной разницы.
Для оценки процента времени, занимаемого приступами, запись ЭКоГ после введения 4-АР была разделена на 5-минутные периоды анализа. Установлено, что крысы, получавшие инъекцию 4-АР с последующим введением физиологического раствора, достигали 100% общей продолжительности эпизодов СВА на эпоху анализа 35 мин в среднем после введения 4-АР, что свидетельствует о наличии эпилептического статуса. У крыс, получавших интракортикальное введение CBX до индукции эпилепсии, не достигали даже 40% уровня общей продолжительности эпизодов СВА за эпоху анализа. Сравнение с помощью двухфакторного ANOVA показало, что у крыс, получавших 4-AP после CBX, общая продолжительность эпизодов СВА была значительно ниже, чем у крыс, получавших 4-AP после физиологического раствора, и эти различия были значимы при p < 0,0001.
Сравнительный анализ мгновенной частоты повторения спайк-волн в составе эпизодов СВА проведен у крыс 1-й и 2-й экспериментальных групп. Статистический анализ с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни показал, что мгновенная частота повторения спайк-волн в составе эпизодов СВА не различалась между анализируемыми группами животных (7,51 ± 0,42 против 7,59 ± 0,43). Сравнение методом двухфакторного дисперсионного анализа показало, что частота повторения спайк-волн в составе приступов не зависела от эпохи анализа.
• Анализ данных о половом диморфизме патологических процессов при COVID-19
Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что тяжесть и смертность от COVID-19 выше у мужчин, чем у женщин, тогда как женщины могут подвергаться повышенному риску повторного заражения COVID-19 и развития затяжного заболевания. Различия между полами наблюдались в отношении других инфекционных заболеваний и реакции на вакцины. Специфические для пола паттерны экспрессии белков, опосредующих связывание и проникновение вируса, а также дивергентные реакции иммунной и эндокринной систем, в частности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, в ответ на острый стресс могут объяснить более тяжелую форму COVID-19 у мужчин. В данном обзоре обсуждается, как половые гормоны, сопутствующие заболевания и набор половых хромосом влияют на эти механизмы в контексте COVID-19. Из-за его роли в тяжести и прогрессировании инфекций SARS-CoV-2 утверждается, что половой диморфизм имеет потенциальные последствия для лечения заболевания, мер общественного здравоохранения и наблюдения за пациентами, предрасположенными к развитию длительного COVID. Предлагается учитывать половые различия в будущем эпиднадзоре за пандемией и лечении пациентов с COVID-19, чтобы помочь добиться лучшей стратификации заболевания и улучшить результаты.В совокупности имеются доказательства того, что половой диморфизм при COVID-19 имеет потенциальные последствия, которые следует учитывать при лечении COVID-19 и последующем наблюдении за пациентами, предрасположенными к развитию затяжного заболевания, а также при определении приоритетности вакцин. В то время как инфекции COVID-19 чаще связаны с тяжелым течением и более высокой смертностью у мужчин, женщины, по-видимому, предрасположены к продолжительному заболеванию. Хотя общие молекулярные механизмы у мужчин и женщин не различаются, различия в характере экспрессии нескольких белков клеточной поверхности, ответственных за связывание и проникновение вируса, а также половые различия в стрессовом и иммунном ответе, вероятно, способствуют наблюдаемому половому диморфизму при COVID-19. Повторный анализ ранее опубликованных собственных данных в отношении полового диморфизма позволяет предположить, что у пациентов мужского пола экспрессия ACE2 и воспалительных маркеров в коронарном древе выше, чем у пациентов женского пола с аналогичными сердечно-сосудистыми заболеваниями. Это может еще больше подчеркнуть особую предрасположенность мужчин к более высокой восприимчивости к тяжелому и летальному исходу COVID-19. Факторы образа жизни и поведения, различия в наличии сопутствующих заболеваний и половые факторы риска также способствуют половому диморфизму при COVID-19, и их всегда следует учитывать. Хотя пока нет известных четких механизмов, объясняющих половой диморфизм при COVID-19, как описано в данном обзоре, есть много возможных версий, некоторые из которых заслуживают дальнейшего изучения. Таким образом, необходимы более масштабные проспективные и механистические исследования, чтобы предоставить научно обоснованные доказательства, чтобы сделать более точные выводы, которые позволили бы дать четкие рекомендации по профилактике и лечению пациентов с COVID-19 на основе половых различий.
