Деятельность центра направлена на разработку и создание генетических конструкций на основе CRISPR/Cas технологии для выключения генов (knockout), встраивания новых генов (knock in), блокировки трансляции мРНК (knockdown), тканеспецифичной детекции экспрессии генов и других задач, связанных с введением мутаций или редактированием генома млекопитающих. Традиционно для поломки гена используют направленную систему редактирования генома CRISPR/Cas9, а для подавления трансляции мРНК малые интерферирующие РНК. В обоих случаях суть заключается в том, чтобы быстро и точно определить целевую последовательность нуклеиновых кислот с помощью направляющей РНК по принципу комплементарности и внести разрыв с помощью нуклеаз. Однако, специфичность связывания как направляющих РНК для Cas9, так и малых интерферирующих РНК не очень точная, что зачастую вызывает побочные эффекты, а именно нецелевое уничтожение генов или их транскриптомов в клетке.
Задача данного проекта - оценить in vitro эффективность и специфичность новой одноэффекторной РНК-управляемой нуклеазы PguCas13b, выделенной из микроорганизма Porphyromonas gulae. Нуклеаза PguCas13b относится к системе CRISPR/Cas типа VI и является одним из ортологов Сas13b. Системы CRISPR-Cas типа VI содержат один эффекторный белок Cas- нуклеазу, управляемый РНК. На данный момент в системе CRISPR/Cas типа VI идентифицировано четыре эффекторных Cas13: Cas13a (ранее известный как C2c2), Cas13b, Cas13c, Cas13d, каждый из которых имеет ряд ортологов, свойства которых может отличаться, несмотря на общий принцип строения: два нуклеотид-связывающих доменов (HEPN), которые обеспечивают расщепление РНК. Предположительно, что все нуклеазы системе CRISPR/Cas типа VI проявляет две различные активности рибонуклеазы: одну для процессинга пре-кРНК, а другую для расщепления цис- и транс-РНК-мишенью. Программируемая природа ферментов Cas13 делает их привлекательной отправной точкой для разработки инструментов распознавания, связывания и разрушения РНК в клетках млекопитающих. Недавние исследования ортолога PspCas13b, выделенного из микроорганизма из Prevotella sp. продемонстрировали высокую эффективность и специфичность расщепления РНК в клетках млекопитающих, что предполагает, что еще не исследованный ортолог PguCas13b будет обладать такой-же высокой эффективностью и специфичностью.
Результаты работы позволят оценить точность взаимодействия PguCas13b с таргетным РНК субстратом. Если результаты эксперимента выявят 100% специфичность направляющей РНК Pgu Cas13b в РНК-мишени, то это откроет новые направления использования данной нуклеазы для быстрого и точного распознавания нуклеиновых кислот в клетке, что важно при программируемом подавлении трансляции мРНК, разработки тест-систем диагностики нуклеиновых кислот и исследования новых инновационных препаратов генной терапии. Каталитически неактивный PguCas13b можно будет также использовать в качестве программируемого РНК-связывающего белка, который мы адаптировали для отслеживания транскриптомов в реальном времени. То, что выбранная нами изоформа PguCas13b к данному моменту не была исследована на эффективность и специфичность, дает нам преимущество в возможности как публикации, так и патентования результатов.
Для информативного сравнения работы генов, выявления их связи с тем или иным заболеванием, а также разработки тест-систем для клинической диагностики различных инфекционных заболеваний, исследователям требуется быстро и точно распознать целевой участок ДНК или РНК. Традиционно для нахождения и поломки ДНК используют направленную систему редактирования генома CRISPR/Cas9, а для нахождения и разрушения РНК - малые интерферирующие РНК. Однако, обе эти системы дают ряд побочных эффектов, так могут связываться с нецелевыми участками ДНК или РНК. Поэтому одна из важных задач исследователей, найти новый подход для направленного и точного распознавания ДНК и РНК в клетке.
Недавние открытие CRISPR/Cas13 системы выявила возможность распознавать и направленно вводить мутации в РНК млекопитающих. Целью данного проекта является определение точности распознавания и связывания с РНК новой нуклеазы PguCas13b, выделенной из микроорганизма Porphyromonas gulae. То, что выбранная нами изоформа PguCas13b к данному моменту не была исследована на эффективность и специфичность, дает нам преимущество в возможности как публикации, так и патентования результатов, а также перспектива использования данной нуклеазы при разработке тест-систем для выявления различных штаммов вирусов, для генотипирования ДНК различных организмов, а также для направленного подавления синтеза исследуемых белков и празработки инновационных препаратов генной терапии
1) Разработана система для наработки в E.coli и выделения в препаративных количествах рекомбинантной нуклеазы PguCas13b. 2) Показано, что активность нуклеазы PguCas13b в условиях in vitro не зависит от наличия дополнительной аминокислотной последовательности SUMO, стабилизирующей белок в растворимом состоянии. 3) Показано, что нуклеаза PguCas13b проявляет коллатеральную активность в условиях in vitro только при наличии дополнительной аминокислотной последовательности SUMO, стабилизирующей белок в растворимом состоянии. 4) Показано, что эффективность направленного расщепления РНК мишени нуклеазой PguCas13b зависит от наличия однонуклеотидных неспаренностей у направляющих РНК (в положении 5, 15 и 24).
Для наработки белка PguCas13b в E.coli была использована плазмида
pC0067PguCas13b, несущая ген PguCas13b, слитый с последовательностью, кодирующей 6 гистидинов, и последовательностью SUMO, а также три экспрессионных штамма E.coli: BL21 (DE3) pLysS, Rosetta (DE3) pLysS, NiCo21 (DE3).
Была проведена индукция экспрессии гена PguCas13b во всех трех штаммах E.coli, наилучшее соотношение по количеству растворимого рекомбинантного белка PguCas13b к общему белку было выявлено для штамма BL21 (DE3) pLysS. Далее было проверено влияние концентрации индуктора (IPTG), температуры инкубации и времени инкубации на количество растворимого белка PguCas13b в штамме BL21 (DE3) pLysS. В итоге выявлено оптимальное сочетание – 1 мМ IPTG, 37°C, 16 часов.
Было оценено влияние наличия последовательности SUMO на стабильность белка PguCas13b в условиях in vitro. В соответствии с полученными результатами после отщепления последовательности SUMO эффективность работы рекомбинантного белка уменьшается. Также полученные результаты говорят о том, что в условиях in vitro для нуклеазы PguCas13b характерна, помимо специфического расщепления РНК, дополнительная неспецифическая коллатеральная активность.
В экспериментах по оценке специфичности был использован белок PguCas13b с
последовательностью SUMO. Была проанализирована специфичность расщепления РНК мишени при использовании направляющих РНК, несущих однонуклеотидные замены (в 1, 15 и 24 положениях) в последовательности, комплементарной РНК мишени.
Однонуклеотидная замена в 15 положении (центральная часть направляющей РНК) приводила к нарушению взаимодействия направляющей РНК и РНК мишени, что в свою
очередь блокировало расщепление РНК мишени за счет действия белка PguCas13b. При этом наличие замен в концевых участках направляющей РНК также приводило к отсутствию расщепления РНК мишени.
1) Была разработана система для наработки в E.coli и выделения в препаративных количествах рекомбинантной нуклеазы PguCas13b
2) Проведен анализ активности нуклеазы PguCas13b и анализ коллатеральной
активности нуклеазы PguCas13b в условиях in vitro.
3) Проведена оценка специфичности нуклеазы PguCas13b в условиях in vitro.
Е.И.Леонова 30 %
Ю.В. Сопова 20 %
А.П. Воронин 20 %
А.В. Чиринскайте 20 %
А.С. Фотина 10 %
На основании системы CRISPR/Cas13 создан ряд методик манипулирования РНК, позволяющих эффективно и более прицельно осуществлять нокдаун транскриптов определенных генов (Abudayyeh et al., 2017; Cox et al., 2017; Konermann et al., 2018), редактирование нуклеотидов РНК транскриптов (Abudayyeh et al., 2019; Cox et al., 2017), модуляцию сплайсинга (Konermann et al., 2018), а также транскриптомный имиджинг in vivo (Abudayyeh et al., 2017) в клеточных культурах млекопитающих, бактерий и растений
Новые технологии, основанные на системах CRISPR/Cas13, мишенью которых
является РНК, будут способствовать развитию как исследовательских, так и
терапевтических приложений. Выявленная нами 100% специфичность по трем
однонуклеотидным заменам в направляющей РНК нуклеазы PguCas13b к РНК мишени открывает широкую перспективу для разработки инструментов подавления транскрипции мРНК (knockdown), тканеспецифичной детекции экспрессии генов и других задач, связанных с направленным редактированием РНК в клетках млекопитающих.
| Short title | GZ-2020 |
|---|
| Acronym | ITBM_2020 - 1 |
|---|
| Status | Finished |
|---|
| Effective start/end date | 10/01/20 → 31/12/20 |
|---|
