Синтез новых соединений

Стратегия синтеза редких иминов с дополнительными гетероатомами в структуре через тандем реакций Штаудингре-аза-Виттиг была применена для получения ряда потенциальных агонистов hTAAR1). Эти соединения были получены через многокомпонентные реакции соответствующих N-фталимидометилиминов. По результатам биотестирования активных соединений выявлено не было. Результаты опубликованы в статье Org Biomol Chem 2024, 22, 1733-1744.

В 2024 году нами проведен синтез серии из 24 N-сульфамоиллактамов ряда тетрагидроизохинолонов по реакции Кастаньоли-Кушмана гомофталевого ангидрида и N-сульфамоилиминов. В серии проведена широкая вариация заместителей в положении 3 (арил/гетероарил/алкил). Результаты по синтезу этой серии опубликованы в работе Tetrahedron 2024, 154, 133890.

Завершены работы по синтезу пирролов и имидазолов, аннелированных с пиперидиновым или азепановым циклом. Было получено 19 новых соединений, для одного из них были достигнуто наномолярное значение EC50 по отношению к hTAAR1, что по уровню активности соответствует тирамину. Был сделан вывод о решающем значении пиррольного цикла, аннелированного с семичленным циклом. Помимо восстановления, получаемые имины были введены в ряд многокомпонентных реакций с получением лактамов, тетразолов и ациклических бисамидов. Результаты по синтезу этих серий соединений и изучению их биоактивности опубликованы в статье Org Biomol Chem 2024, 22, 8328-8336.

Завершен синтез, характеризация и проведено тестирование серии расчетных потенциальных агонистов TAAR с остовом тетрагидроизохинолона или тетрагидроизохинолина с аминоалкильной цепью в положении 2 или 4. По результатам in vitro тестирования наиболее перспективной оказалось соединение на основе 4-(аминометил) тетагидроизохинолина.

Синтезирована серия из 32 производных пирролидин 2- и 3- карбоксамидов с гидрофобными ароматическими остатками в амидной части, а также серия из 38 производных 1,2,4-оксадиазолов с гидрофобными арильными группами в положении 3 и с аминоалкильной цепью или циклом в положении 5. Была расширена серия 2,5-дизамещенных тетразолов, содержащих во 2-ом положении пятичленного гетероцикла аминоэтильный либо метилпирролидиновый фрагменты до 18 штук. Полученные результаты in vitro исследований первой партии данных молекулярных систем, продемонстрировали высокий уровень их активности.

На основании клик-химии нами был разработан двухстадийный протокол получения бициклических триазоло[1,5-a]пиперазинов, а также их гомологов. Также был разработан удобный протокол получения производных пиперидина, содержащих в 3-ем или 4-ом положении пиримидиновый фрагмент. Это позволило сформировать нам библиотеку потенциальных агонистов TAAR1, состоящую из 10 соединений.

Ранее нами было установлено, что два N-арилзамещённых производных 2-(пиперидин-4-ил)этан-1-амина являются мощными агонистами TAAR1. Для проведения дальнейших in vivo экспериментов мы разработали новый протокол получения данных молекул, позволивший наработать эти вещества в граммовых количествах.

Мы продолжили оптимизировать структуру агониста TAAR1 (LK00764) на базе других гетероциклических скаффолдов c целью повышения аффинности, а также улучшения физико- химических характеристик и биодоступности. Ввиду коммерческой ценности этих наблюдений по просьбе индустриального партнёра данные не представлены.

Для направленного моделирования была получена и валидирована модель с использованием вычислительных подходов. Полученная нами структура белка позволяет качественно и полуколичественно описывать контакты и взаимодействия в лиганд-белковом комплексе. Для модификации и оптимизации молекул-лидеров был подобран протокол с использованием высокопрецизионных алхимических методов (FEP/REST2) с экспериментальной точностью предсказания, в частности для серии мочевин на основе 4-(2-аминоэтил)пиперидина. Синтез и тестирование этих соединений будет осуществляться в следующем периоде.

Случайный и направленный поиск агонистов и антагонистов TAARs in vitro (Рис 1-8, Табл 1)

В отчетном периоде продолжался поиск эффективных агонистов hTAAR1. Всего изучено более 300 вновь синтезированных соединений, из которых 19 проявили значительные агонистические свойства. В настоящий момент проводится in vivo оценка специфического действия наиболее активных соединений. Антагонистов hTAAR1 обнаружено не было.

Также продолжались работы, направленные на улучшение метода детекции внутриклеточного выброса кальция по флуоресценции красителя Fura-2. Одним из использованных подходов является оценка активации природных рецепторов, в норме представленных на мембране обычно применяемых для in vitro биологического скрининга клеток, например, адренорецептора типа бета 2, вовлекающего во внутриклеточное проведение сигнала не только цАМФ, но и кальций. Обнаружено, что эффект изопротеренола в данной тест-системе гораздо слабее, чем в случае цАМФ-ответа и достигает максимума при 5 минутах прединкубация, соответственно, возрастает.

В этом году был проведен скрининг (коэскпрессия шаперонов в гетерологичной системе) соединений из библиотеки Sigma LOPAC (80 соединений), а также 40 соединений, включая следовых амины, терпены на агонизм mTAAR6. Был выявлен агонизм двух веществ: 2-метил-1-пироллин (EC50 =112.8 µM), а также N-метилпиперидина (EC50 =75 µM).

Ранее нами была получена конструкция человеческого TAAR9 с N-концевым тагом β2-адренергического рецептора (βN9). В этом году ее и конструкцию рецептора дикого типа (без тага) использовали для скрининга на агонизм человеческого TAAR9. На данный момент в литературе нет данных о веществах, активирующих этот рецептор. Параллельно была проверена контрансфекция вспомогательными белками RTP1S, RTP2, Golf, Ric8b. Наличие тага, а также котрансфекция генам вспомогательных белков позволила выявить агонизм человеческого TAAR9 к спермину (EC50 =212 µM), спермидину (EC50 =200 µM), кадаверину (EC50 =319 µM).

Была проведена оптимизация тестовой BRET системы rTAAR9. При анализе уровня фон-ответ выяснилось, что добавление N-концевого βN9 тага вместе с коэкспрессией вспомогательных белков позволяет наиболее эффективному ответу системы.

Был проведен скрининг соединений из библиотеки Sigma LOPAC (80 соединений), а также нескольких следовых аминов на агонизм rTAAR9. Был выявлен агонизм триэтиламина (EC50 =99 µM), а также диметилциклогексиламина (EC50 =174 µM).

Для получения стабильной клеточной линии на основе используемой нами HEK293T необходим начальный этап трансфекции вектором, несущим ген устойчивости к антибиотику как маркер селекции. В связи с тем, что эта линия уже имеет ген устойчивости к неомицину, который используется в векторах pcDNA3, она не подходит для отбора по этому маркеру. Поэтому в этом году нами была приобретена линия HEK293 (Биолот) и начато ее культивирование. Также была проведена работа по построению кривой доли выживших клеток в зависимости от концентрации генетицина G418 (Grisp) (аналог неомицина). Полученные данные будут далее использованы для отбора после трансфекции.

В дополнение к запланированному началу скрининга на TAAR8 рецепторах человека, мы проанализировали рецептор TAAR2. Для улучшения системы по выявлению активности рецепторов TAAR2 и TAAR8 нами с помощью рестрикционно-лигазного клонирования были получены экспрессионные векторы на основе pcDNA3.1, содержащие в своем составе гены рецепторов с N-концевым родопсиновым тагом (Rho-таг) с а.к. последовательностью MNGTEGPNFYVPFSNATGVV.

Ввиду отсутствия информации о лигандах рецепторов человеческих TAAR2 и TAAR8 в первую очередь были проверены лиганды мышиных ортологов. Дополнительно контрансфецировали набором вспомогательных белков (RTP1S, RTP2, Ric8b, Golf). В случае с hTAAR8 лиганды не вызывали специфическое повышение цАМФ. Для hTAAR2 только 2M1P активировал рецептор, но при очень высоких концентрациях. Стоит отметить, что Rho-таг был более эффективен для hTAAR2, чем ранее проверенный βN9 (от β2-адренергичнского рецептора), а без коэкспрессии шаперонами не было выявлено активности рецептора. Методом BRET был проведен скрининг на агонизм hTAAR2 (80 соединений), hTAAR8 (80 соединений) из библиотеки SigmaLOPAC1280.

Эксперименты на животных (Рис 9-41, Табл 2-5)

Мы продолжили работу по оценке фармакологических свойств приоритетного кандидата (LK1932) на модельных животных. Животным интраперитонеально вводили растворы препарата LK1932 (15 и 30 мг/кг). Для того, чтобы вызвать увеличение двигательной активности вследствие дофаминергии животным (40 самцов мышей линии C57Black) интраперитонеально вводили GBR12909 (10 мг/кг) непосредственно после введения препаратов. Животные были разделены на следующие экспериментальные группы: 1) контроль (N=12), животные которым вводили растворитель; 2) GBR12909 (N=16) - 10 мг/кг GBR12909; 3) LK1932-15 (N=4) - 15 мг/кг LK1932; 4) LK1932-30 (N=4) - 30 мг/кг LK1932; 5) LK1932-15+GBR (N=3) - 15 мг/кг LK1932 и 10 мг/кг GBR12909; 6) LK1932-30+GBR (N=6) - 30 мг/кг LK1932 и и 10 мг/кг GBR12909.

В результате было выяснено, что введение 15 мг/кг и 30 мг/кг LK1932 совместно с 10 мг/кг GBR12909 не вызывало изменения двигательной активности животных относительно группы GBR12909 в течение на всех 10-минутных промежутках после введения и в течение 90 мин после введения.

Мы продолжили изучение экспрессии генов TAAR2 и TAAR5 у нокаутных животных с использованием методов гистохимии, описанных в предыдущих отчетных периодах. Экспрессия TAAR2 обнаружена в клочке мозжечка и латеральном ядре хабенулы головного мозга мыши. Экспрессия TAAR5 обнаружена в черной субстанции, таламусе, в структурах продолговатого мозга и моста.

В 2024 году мы запланировали оценить экспрессию генов, кодирующих TAAR6, TAAR8 и TAAR9, методами ПЦР в реальном времени. Однако ввиду избыточного количества данных по экспрессии TAAR9, было принято решение проанализировать экспрессию TAAR2. Была исследована экспрессия TAAR2 и TAAR6 в ЦНС и периферии крысы. Экспрессия TAAR2 была найдена в гипоталамусе и вентральной области покрышки, а также подтверждена в обонятельном эпителии. В то время как наличие экспрессии TAAR6 удалось подтвердить в семенниках и обонятельном эпителии. Экспрессия гена TAAR8 была найдена только в обонятельной луковице.

В этом году мы провели исследование по вкладу рецептора TAAR9/delC в нейрональную активность мозга при регистрации от префронтальной коры, PFC (DV=3.5, AP=+2.0, ML=±0.5 мм) и стриатума, STR (DV=5.0, AP=0, ML=±3.0) крыс, нокаутных по гену TAAR9 (TAAR9/delC-KO n=8, самцы и самки), в сравнении с животными дикого типа (WT n=8, самцы и самки).

Был проведен анализ частотно-временных характеристик электрической активности в префронтальной коре и стриатуме TAAR9-KO крыс в сравнении с животными WT. Обнаружено достоверное снижение мощности сигнала в префронтальной коре у нокаутов по TAAR9/delC во всех частотных диапазонах. При сравнении мощности сигнала в дорсальном стриатуме достоверных различий зарегистрировано не было.

Было проведено исследование действия социального стресса на TAAR2 нокаутных животных по отработанной в 2023 году методике. Мыши TAAR2-KO и WT подвергались процедуре однократного стресса социального поражения (ССП). Во время ССП, вызванного присутствием в клетке с крысой, животные TAAR2-WT демонстрировали поведение «замирание», характерное поведение во время стресса, по сравнению с группой контроля и животными TAAR2-KO. Через 24 часа после однократного ССП не было выявлено статистически значимых изменений между группами в параметрах двигательной активности, однако обнаружена тенденция (p=0.08) к снижению тревожности у животных TAAR2-KO по сравнению с TAAR2 WT.

В рамках реализации проекта был проведен гематологический анализ мышей с нокаутом гена TAAR2 и TAAR6. Сравнительный анализ лейкоцитарной формулы и осмотической резистентности эритроцитов для обеих линий мышей выявил минимальные отличия. Данные результаты демонстрируют отсутствие скрытых патологий крови, а также высокий потенциал рецепторов TAAR2 и TAAR6 в качестве фармакологических мишеней для будущих терапевтических подходов в области нейропсихофармакологии. Однако, для проведения биохимического анализа требуются дополнительные группы животных ввиду нехватки объема сыворотки крови.

Была проведена оценка влияния нокаута гена TAAR9 у крыс на поведенческие и нейромедиаторные параметры при посттравматическом стрессовом расстройстве (ПТСР). Для оценки воздействия хронического стресса и ПТСР использован экспериментальный протокол, в котором в качестве индуктора выступает хронический предаторный стресс. После 14 дней на восстановление проводилось повторное тестирование на тревожность, но уже в установке ПКЛ. Далее проводился забор стриатума и гиппокампа с последующим анализом моноаминов методом ВЭЖХ.

В тесте ПКЛ параметр «время в открытом рукаве» значительно отличался у TAAR9 нокаутных крыс без стресса и после стресса (n = 5 на группу, **p = 0,0079 против контроля, U-критерий Манна-Уитни. WT — крысы дикого типа). Данные демонстрируют более быструю скорость восстановления после пролонгированного предаторного стресса и значительное снижение тревожного фенотипа по сравнению с контрольной группой.

Анализ уровней моноаминов, также продемонстрировал значительные изменения серотонина (5-HT) у TAAR9 нокаутной группы крыс после стресса (n = 5 на группу, *p = 0,0369 против WTстресс, 2-way ANOVA) и его метаболита 5-гидроксииндолуксусная кислота (5-HIAA) (n = 5 на группу, *p = 0,0472 против WTстресс, *p = 0,0277 против TAAR9-KO, 2-way ANOVA) в гиппокампе. Данные результаты подтверждают поведенческий эксперимент и демонстрируют значительные изменения в работе гиппокампа у TAAR9 нокаутных животных при реакции на предаторный стресс.

Мы изучили действие хронического воздействия антидепрессанта амитриптилина на показатели поведения мышей (3,5 - 4 месяца), нокаутных по TAAR5 по сравнению с мышами дикого типа при моделировании депрессивно-подобного состояния. 10 мышей TAAR5-KO и 10 мышей TAAR5-WT (KO-CUMS и WT-CUMS) были подвержены процедуре хронического непредсказуемого умеренного стресса (CUMS) на протяжении 6 недель. Начиная с четвертой недели CUMS и до конца эксперимента, этим мышам давали разведенный в питьевой воде антидепрессант амитриптилин. Другие 10 мышей TAAR5-KO и 10 мышей TAAR5-WT (KO-intact и WT-intact) выступали в качестве интактного контроля. Хроническое воздействие амитриптилина происходило перорально, с питьевой водой, доступной мышам ad libitum. Концентрация амитриптилина в питьевой воде составляла 160 мг/л.

По завершению эксперимента было проведено исследование поведения (уровень тревожности, исследовательская активность, импульсивное поведение) и двигательной активности мышей в тестах “Открытое поле” и “ПКЛ” по протоколам, описанным в отчете за 2023 год.

По результатам анализа были обнаружены достоверные различия в уровне двигательной активности в тесте “Открытое поле” между группами WT-intact и WT-CUMS (1002,1 см ±167,9, 1614,2 см ± 145,8, p < 0,05). Анализ множественных сравнений показал достоверные различия в уровне двигательной активности между группами WT-intact и KO-CUMS (1002,1 см ±167,9, 1715,1см ± 147,5, p < 0,05).

При оценке тревожного поведения были обнаружены достоверные различия в количестве свешиваний между группами KO-intact и KO-CUMS (15,6 ± 2,2; 6, 9± 6,9, p < 0,01), но не между группами WT-intact и WT-CUMS. Анализ множественных сравнений попарно по воздействиям показал достоверные различия между группами WT-intact и KO-intact (8,7±1,7; 15,6 ± 2,2; , p < 0,05), но не WT-CUMS и KO-CUMS.

По завершению эксперимента мы оценили уровень постнатального нейрогенеза гиппокампа мышей при хроническом приеме антидепрессантов с использованием методов иммуногистохимии, применявшихся в 2023 году. Мы не обнаружили статистически значимых изменений между группами WT-CUMS и KO-CUMS.

Была проведена серия тестов на влияние на терморегуляцию у животных различных типов острого стресса: стресс-индуцированная гипертермия, иммобилизационный стресс, стресс нагревания, стресс охлаждения. Исследования были проведены на 20 самцах мыши (3-3,5 месяцев) линии TAAR5: TAAR5-KO (n = 10) и TAAR5-WT (n = 10) с использованием протоколов, описанных в 2023 году при проведении аналогичных тестов на TAAR2 KO мышах. В тесте “стресс-индуцированная гипертермия” повторное измерение показало достоверное увеличение температуры тела в обеих группах (WT: 36,14°C ±0,15, 37,1 °C ±0, 0,07, p < 0,0001; KO: 35,94°C ± 0,04, 36,98°C ±0,12 , p < 0,0001). В тесте “иммобилизационный стресс” иммобилизация вызывала достоверное увеличение температуры тела в двух группах (WT: 36,27°C ±0,13, 37,23°C ± 0,15, p < 0.001 ; KO: 35,95°C ±0,11, 37,1°C ±0,16, p < 0.0001). Нагревание на протяжении 4 часов не вызывало достоверного увеличения температуры тела в группах WT и KO, однако наблюдалась статистически достоверное различие по температуре тела между группами WT и KO вследствие воздействия (WT: 35,96°C ±0,13, KO: 35,35°C ±0,14, p < 0,05). . При проведении стресса охлаждения статистических различий между группами WT и KO в каждом из измерений не было обнаружено.

Была проведена оценка параметров высвобождения и обратного захвата дофамина методом FSCV на TAAR5 нокаутных животных. При проведении вольтаметрического исследования на животных TAAR5 KO и WT было показано достоверно значимое (p=0.03, тест Манна-Уитни) различие в параметрах ДА выброса в области хвостатого ядра у животных TAAR5 KO по сравнению с WT.

Мы исследовали действие социального стресса на ТААR9-КО крыс. Во время CCП животные TAAR9-WT в отличие от животных TAAR9-KO, чаще демонстрировали поведение «замирания», которое свидетельствует о высоком уровне стресса. У животных TAAR9-KO уровень стресса не отличался от фонового, кроме того, TAAR9-KO демонстрировали повышенный уровень агрессии по сравнению с животными TAAR9-WT, которые не атаковали агрессивного резидента (TPH2-KO), в отличие от животных TAAR9-KO (8 атак за 5-10 мин).

Были показаны фоновые различия в двигательной активности у животных TAAR9-KO и WT, а также что стресс не привел к изменению двигательного, тревожного, и депрессивного компонентов у крыс TAAR9-KO, однако у животных TAAR9-WT были обнаружены достоверное снижение двигательной активности по сравнению с фоном (p≤0.05) и с группой TAAR9-KO (p=0,0007).

На 2024 год было запланировано выполнение и сравнение результатов РНК секвенирования гиппокампа TAAR2-КО животных и животных дикого типа. Однако, ввиду наличия органических примесей и низкой концентрации истинной РНК, было принято решение не использовать полученный материал для дальнейших исследований и использовать реактивы из новой партии для выделения РНК из новой группы животных. Новая группа животных была выбрана и подготовлена для выполнения РНК секвенирования.

В прошлом году мы выявили увеличение плотности нейробластоподобных клеток в субвентрикулярной зоне гиппокампа TAAR8abc KO мышей по сравнению с контролем. В этом году мы проанализировали уровень нейрогенеза у TAAR1-KO и WT мышей, однако статистически значимых изменений выявить не удалось.

В 2024 году мы планировали оценить эффект фокальной ишемии на взрослый нейрогенез у мышей для дальнейшего использования на нокаутных животных. В качестве метода моделирования состояния ишемии было выбрано перевязывание ствола и основных ветвей средней мозговой артерии. Однако, помимо высокой травматичности, ведущей к повышенной послеоперационной смертности, с данным методом не удалось к настоящему моменту получить корково-подкоркового повреждения..

Оценка роли TAARs в онкологических процессах

Мы продолжили исследование роли MAO в реализации эффектов агонистов TAAR на жизнеспособность и пролиферацию культуры нейробластомы человека SH-SY5Y. Выяснили, что 48 ч инкубация культуры с 1 мМ тирамином вызывала снижение ее жизнеспособности (p<0,001), а добавление 1 нМ селегилина уменьшало токсичность тирамина (p<0,05). 48 ч инкубация культуры с 10 мкМ LK764 вызывало снижение ее жизнеспособности (p<0,001). Добавление 1 нМ селегилина не оказывало влияния на токсичность LK764 для культуры.

Проведено исследование изменений экспрессии генов, продукты которых задействованы в регуляции апоптоза, в клетках постоянной линии ВТ-20 (трижды негативный рак молочной железы) в присутствии антагониста рецептора TAAR1 EPPTB, который в высоких концентрациях заметно подавляет рост клеток данной линии. Был проведена количественная оценка уровня экспрессии мРНК генов BCL2, BAK и BAX в присутствии растворителя DMSO, применяемого для растворения EPPTB в среде для культивирования клеток, а также в присутствии EPPTB в концентрации полумаксимального ингибирования (IC50) рецептора TAAR1 и концентрации, ингибирующей активность данного рецептора на 80 % (IC80). Для определения содержания мРНК указанных генов был применён метод количественной ПЦР с использованием интерферирующего красителя SYBR green. Исследование было проведено в трёх биологических повторах. Было показано, что в присутствии EPPTB в клетках BT-20 происходит утрата экспрессии гена противоапоптотического белка BCL-2. В то же время значимого роста экспрессии генов проапоптотических белков BAX и BAK отмечено не было. Кроме того, эффект на экспрессию данных генов проаптотических белков не был стабильным и значительно варьировал в биологических повторах эксперимента. Таким образом, проапоптотический эффект EPPTB не является достаточно выраженным и стабильным.