Description

Научная проблема, на решение которой направлен проект
Участие микрофибрилл целлюлозы в регуляции растяжимости клеточных стенок – ключевой характеристики, определяющей скорость роста растительных клеток in vivo

Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы
Растения обладают уникальным механизмом роста – ростом растяжением, при котором увеличение объема клеток достигается преимущественно за счет накопления в них воды. Данный процесс обеспечивает быстрое, многократное увеличение площади поверхности листьев и корней, способствуя высокой эффективности фотосинтеза и минерального питания растения, определяющих его продуктивность. Соответственно, выяснение точных механизмов растяжения клеток и его регуляции необходимо для управления ростом растений в меняющихся условиях среды с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.
Вода поглощается растягивающимися клетками растений благодаря поддержанию в них более высокой концентрации осмотически активных веществ по сравнению с внеклеточной средой. Поступление воды в растущие клетки ограничивается окружающими их жесткими, но растяжимыми первичными клеточными стенками. Многочисленные исследования в 1960-1980 гг. продемонстрировали то, что главным фактором, лимитирующим скорость роста растительных клеток, является растяжимость клеточных стенок (Cosgrove, 1986). Под растяжимостью понимают способность клеточных стенок необратимо растягиваться в ходе роста (Cosgrove, 1993). Она зависит как от состава полимеров клеточной стенки, так и от многочисленных ферментативных и неферментативных белков, которые непрерывно формируют и разрушают ковалентные и нековалентные связи между структурными компонентами стенок (Bidhendi, Geitmann, 2016). Регуляция растяжимости клеточных стенок является одной из центральных нерешенных проблем физиологии роста растений, главным образом, из-за того, что нам не известна точная архитектура первичных стенок, которая до сих пор описывается альтернативными моделями. Для оценки растяжимости клеточных стенок в настоящее время используют разные способы in vitro и in vivo, включая метод крипа, в котором измеряется зависимая от времени деформация клеточных стенок (крип) при постоянной нагрузке. Считается, что метод крипа дает наиболее точную оценку растяжимости по сравнению с другими методами (Suslov, Vissenberg, 2018).
Независимо от модели архитектуры клеточной стенки, ведущую роль в определении ее механических свойств приписывают целлюлозе – самому прочному компоненту клеточных стенок и самому распространенному биополимеру в живой природе. Представления о роли целлюлозы в определении растяжимости первичных клеточных стенок основываются, главным образом, на косвенных данных: на аномалиях роста и развития растений, которые наблюдаются при нарушении синтеза целлюлозы под влиянием ингибиторов или мутаций (Shedletzky et al., 1992; Zhang et al., 2016). Существует весьма ограниченное число экспериментальных систем, в которых удалось прямо связать механику стенок с организацией в них целлюлозы (Metraux, Taiz, 1978; Suslov et al., 2009). Огромный прогресс в понимании клеточной биологии синтеза целлюлозы был достигнут в последнее десятилетие с использованием мутантов арабидопсиса (Lampugnani et al., 2019). Тем не менее, предпринимаются лишь робкие и не всегда успешные попытки исследования механики их клеточных стенок (Xin et al., 2020). Сдерживающим фактором являются методологические сложности исследования стенок миниатюрных растущих органов арабидопсиса, которые усугубляются карликовостью большинства мутантов по синтезу целлюлозы и увеличением диаметра анализируемых осевых органов, что затрудняет интерпретацию полученных результатов по биомеханике клеточных стенок. Вместе с тем, анализ данных мутантов с использованием усовершенствованного оборудования и методических подходов является весьма актуальным, позволяя устанавливать совершенно новые аспекты участия целлюлозы в определении растяжимости клеточных стенок в ходе реализации разных ростовых ответов растений.
Недавние исследования (Xin et al., 2020) показали, что организация целлюлозы влияет на скорость «кислого роста», который представляет собой раннюю фазу ауксинзависимого роста. В ходе данного процесса происходит подкисление апопласта Н+-АТФазами плазмалеммы, что активирует белки экспансины, увеличивающие растяжимость клеточных стенок (McQueen-Mason et al., 1992; Rayle, Cleland, 1992). Совсем недавно были описаны прикладные аспекты применения данных белков в сельском хозяйстве. Оказалось, что целевая сверхэкспрессия экспансина в ходе раннего развития семени пшеницы значительно увеличивала размер зерна без сопутствующего уменьшения числа зерен, что приводило к повышению урожайности в полевых условиях на 11% (Calderini et al., 2021). Предполагается, что повышенная экспрессия экспансинов в корнях в условиях недостатка воды обеспечивает продолжение роста корня при пониженном тургорном давлении. Это увеличивает соотношение корень:побег, способствуя более эффективному использованию воды растением в условиях засухи и сохранению урожая (Cosgrove, 2021). Влияние целлюлозы на скорость опосредованного экспансинами «кислого роста» показывает, что модуляция организации микрофибрилл также может иметь потенциальное влияние на урожайность сельскохозяйственных культур.
Гравитропизм представляет собой ростовой ответ, при котором органы растения изгибаются после изменение их положения относительно вектора силы тяжести (Morita, 2010). При формировании гравитропического изгиба осуществляется очень тонкая регуляция скорости роста и растяжимости клеточных стенок на верхней и нижней сторонах гравистимулированного органа. Имеются косвенные данные об участии микрофибрилл целлюлозы в механизме формирования гравитропического изгиба. Исследование гравитропизма органов растения представляет большой научный интерес, так как он, в сочетании с фототропизмом и гидротропизмом, определяет оптимальное положение побега и корня в пространстве относительно солнечного света, источников воды и минеральных солей, увеличивая, посредством этого, эффективность фотосинтеза и почвенного питания растительного организма (Blancaflor, 2013).

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб
Проект подразумевает решение нескольких задач для лучшего понимания роли целлюлозы в регуляции растяжимости клеточных стенок и роста растений:
1) Совершенствование анализа механики клеточных стенок методом крипа для более точной оценки растяжимости клеточных стенок, включающее определение площади поперечного сечения исследуемых образцов с использованием по меньшей мере двух независимых способов;
2) Оценка влияния содержания, ориентации и уровня кристалличности целлюлозы на растяжимость клеточных стенок гипокотилей арабидопсиса в ходе «кислого роста» с использованием специфических мутантов и ингибиторов;
3) Изучение влияния содержания, ориентации и уровня кристалличности целлюлозы на гравитропизм гипокотилей арабидопсиса и растяжимость клеточных стенок в ходе формирования гравитропического изгиба с использованием специфических мутантов и ингибиторов.
Успешное решение описанных выше задач приведет к созданию универсального алгоритма для оценки участия целлюлозы в регуляции растяжимости клеточных стенок во время разных ростовых реакций растения. Полученные данные могут быть использованы для селекции сельскохозяйственных культур с повышенной скоростью роста и продуктивностью, а также для создания технических культур, обеспечивающих более высокий выход биотоплива.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов
Целлюлоза является самым прочным компонентом клеточных стенок и самым распространенным биополимером на Земле. Однако ее роль в регуляции растяжимости клеточных стенок до последнего времени оставалась плохо изученной, главным образом, из-за недостатка удобных экспериментальных моделей и методических сложностей. Арабидопсис – основной модельный организм в современной биологии растений – является не самым удобным объектом для исследования биомеханики клеточных стенок из-за миниатюрных размеров и хрупкости его растущих органов. Применительно к изучению целлюлозы данная проблема усугубляется, так как многие мутации, затрагивающие целлюлозу, дают растения с карликовым фенотипом. Тем не менее, в последнее десятилетие в связи с открытием новых компонентов комплекса целлюлозосинтазы были получены многочисленные мутанты с тонкими изменениями организации микрофибрилл целлюлозы, отличающиеся умеренным ингибированием роста. Размеры данных мутантов допускают оценку растяжимости клеточных стенок классическими методами биомеханики, в том числе методом крипа, и они ожидают своего изучения. Мы были пионерами в использовании метода крипа для изучения биомеханики клеточных стенок миниатюрных растущих органов арабидопсиса (Vandenbussche et al., 2011). Впоследствии используемый для измерения крипа клеточных стенок прибор – экстенсометр – был нами усовершенствован для работы с гипокотилями арабидопсиса, имеющими сильное угнетение роста (Ivakov et al., 2017). Их длина – 5-7 мм - соответствует длине гипокотилей мутантов арабидопсиса по целлюлозе, которые планируется исследовать в настоящем проекте. Несмотря на отсутствие методических ограничений, это будет нашим первым опытом работы с мутантами арабидопсиса по целлюлозе. Впервые будет исследовано влияние трех разных аспектов организации целлюлозы – ее ориентации, степени кристалличности и содержания – на растяжимость растущих клеточных стенок Arabidopsis thaliana - основного модельного организма в современной биологии растений. Правильная интерпретация полученных данных по растяжимости будет достигнута за счет поправки на площадь поперечного сечения клеточных стенок, которая будет впервые определена с использованием двух независимых методов анализа. Достижимость решения поставленных задач и возможность получения предполагаемых результатов обеспечивается высокой квалификацией и большим опытом работы заявителей проекта в области биомеханики гипокотилей арабидопсиса и электронной микроскопии.

Современное состояние исследований по данной проблеме
Рост клеток растяжением, при котором их объем многократно возрастает за счет накопления воды, является одной из отличительных особенностей растений. Общий биофизический механизм данного процесса стал понятен к середине 1980 гг.: движущей силой поступления воды в растущие клетки является более высокая концентрация осмотически активных веществ в клетке по сравнению с внеклеточной средой, которая поддерживается на относительно постоянном уровне осморегуляцией, а лимитирующим фактором, сдерживающим поглощение воды и определяющим скорость роста является растяжимость клеточной стенки (Cosgrove, 1986). Таким образом, для понимания молекулярных механизмов роста растений на уровне клеток необходимо выяснить, как регулируется растяжимость клеточных стенок. Для ответа на этот вопрос требуется знание состава клеточной стенки и трехмерной организации ее компонентов, т.е. архитектуры. Состав первичных клеточных стенок изучен достаточно хорошо и включает микрофибриллы целлюлозы и полимеры матрикса: преимущественно нейтральные полисахариды гемицеллюлозы, преимущественно кислые полисахариды пектины и структурные гликопротеины. По составу матрикса принято различать клеточные стенки I типа, характерные для всех двудольных и части однодольных, содержащие много пектинов, заметное количество структурных белков и ксилоглюкан в качестве преобладающей гемицеллюлозы, и клеточные стенки II типа, типичные для злаковых и нескольких родственных групп, содержащие мало пектинов, меньше структурных гликопротеинов, а также арабиноксилан и глюкан со смешанным типом связи в качестве преобладающих гемицеллюлоз (Albersheim et al., 2011). Проблемой является то, что мы до сих пор не знаем точную архитектуру клеточных стенок. В последнее десятилетие наблюдается быстрая эволюция представлений по этому вопросу. Долгое время была популярной модель «связанной сети» (tethered network) клеточных стенок I типа, в которой цепочки ксилоглюканов связывают соседние микрофибриллы целлюлозы за счет образования многочисленных водородных связей с поверхностью микрофибрилл, и эта несущая нагрузку целлюлозо-ксилоглюкановая сеть погружена в аморфный матрикс пектинов и структурных гликопротеинов (Carpita, Gibeaut, 1993). Относительно нормальный фенотип мутанта арабидопсиса с полным отсутствием ксилоглюканов в клеточных стенках (Cavalier et al., 2008) и данные ЯМР о том, что пектины образуют значительно больше связей с целлюлозой, чем ксилоглюканы (Dick-Perez et al., 2011; Phyo et al., 2017), поставили под сомнение модель связанной сети. По результатам действия специфичных ферментов на растяжение клеточных стенок была предложена альтернативная модель «горячих точек» (hot spot), в которой прочность и растяжимость стенок определяется небольшими участками, в которых соседние микрофибриллы прилипают к друг другу за счет расположенного между ними участка цепи ксилоглюкана (Park, Cosgrove, 2012b). Еще одна модель первичной клеточной стенки предполагает участие пектинов в связывании соседних микрофибрилл целлюлозы (Phyo et al., 2017). Наконец, по результатам исследования структуры внутренних слоев клеточной стенки абаксиального эпидермиса лука (Zhang et al., 2019) и построения физических моделей (Zhang et al., 2021) было показано, что микрофибриллы целлюлозы спонтанно собираются в двумерные сети, и прямые взаимодействия соседних микрофибрилл вносят решающий вклад в обеспечение механической прочности и растяжимости клеточных стенок, в отличие от крошечного вклада пектинов и ксилоглюкана (Cheung et al., 2021). Таким образом, нетрудно убедиться в том, что по мере эволюции представлений об архитектуре первичных клеточных стенок все больший вклад в определение их растяжимости приписывают микрофибриллам целлюлозы. Это не удивительно: целлюлоза является самым прочным компонентом клеточных стенок: индивидуальные микрофибриллы имеют модуль упругости вдоль их оси от 0,7 до 3,5 ГПа (Chanliaud et al., 2002), что примерно в 100 раз больше, чем модуль упругости первичных клеточных стенок (Ryden et al., 2003). Отсюда следует, что микрофибриллы никогда не растягиваются вдоль своей оси во время роста растяжением, вместо этого они расходятся друг от друга, изгибаются, скользят друг относительно друга или переориентируются в направлении максимального роста (Preston 1982; Refregier et al., 2004; Zhang et al., 2017). Огромная продольная механическая прочность микрофибрилл и часто встречающаяся предпочтительная ориентация целлюлозы в клеточных стенках лежат в основе анизотропии механики стенок (Baskin, 2005): они гораздо легче растягиваются в направлении, перпендикулярном предпочтительной ориентации целлюлозы (Suslov, Verbelen, 2006; Suslov et al., 2009). Анизотропия механики клеточных стенок является одной из ключевых причин анизотропии роста растительных клеток (ситуация, при которой скорость роста вдоль одной оси клетки выше, чем скорость роста в ортогональном направлении, благодаря чему формируются вытянутые растительные клетки). Микрофибриллы целлюлозы определяют вектор анизотропии роста растительных клеток (т.е. направление максимального роста) (Baskin, 2005), соответственно, нарушения организации микрофибрилл обычно приводят к более изотропному росту – органы растения укорачиваются и утолщаются. Такие изменения создают сложности при оценке влияния целлюлозы на растяжимость клеточной стенки и при интерпретации полученных данных.

Микрофибриллы целлюлозы синтезируются локализованными в плазмалемме комплексами целлюлозосинтазы (CSC), которые имеют вид гексамерных розеток, построенных из каталитических субъединиц – целлюлозосинтаз (CESA) - и многих вспомогательных белков. CSC первичных клеточных стенок растений включают от 12 до 36 субъединиц CESA, которые одновременно синтезируют цепочки целлюлозы, спонтанно взаимодействующие друг с другом при помощи водородных связей и вандерваальсовых взаимодействий с образованием микрофибриллы. Соответственно, считается, что микрофибрилла может иметь от 12 до 36 элементарных цепочек целлюлозы в толщину (McFarlane et al., 2014). В процессе синтеза микрофибрилл CSC линейно перемещаются в плазмалемме в направлении, задаваемом кортикальными микротрубочками (Paredez et al., 2006). Геном арабидопсиса содержит 10 генов CESA (Richmond, Somerville, 2000). CSC первичных клеточных стенок обязательно содержит CESA1 и CESA3, тогда как CESA6, также входящая в состав комплекса, может частично функционально заменяться одной из CESA2, CESA5 и CESA9 (Desprez et al., 2007; Persson et al., 2007). В последнее десятилетие был достигнут огромный прогресс в понимании процесса синтеза целлюлозы CSC (Lampugnani et al., 2019), благодаря легкости осуществления генетической модификации модельного растения арабидопсиса, широкому применению флуоресцентно меченных белковых субъединиц CESA гексамера розеток, которое позволяет прижизненно отслеживать направление и скорость синтеза целлюлозы (Crowell et al., 2011; Ivakov et al., 2017), и анализу коэкспрессионых сетей, который позволил выявить множество новых белковых компонентов аппарата синтеза целлюлозы (Lampugnani et al., 2019). Соответственно, создали множество новых мутантов арабидопсиса по синтезу целлюлозы с различной организацией микрофибрилл в клеточных стенках (Nicol et al., 1998; Pagant et al., 2002; Bringmann et al., 2012; Sanchez-Rodriguez et al., 2012; Endler et al., 2015; Liu et al., 2016; Zhang et al., 2016). Размеры растущих органов некоторых из них, например, pom2 (Bringmann et al., 2012), stl1-1stl2-2 (Zhang et al., 2016) и ixr1-1 (Scheible et al., 2001) позволяют исследовать связь между механикой клеточной стенки в направлении максимального роста и организацией целлюлозы. У мутанта pom2 не функционирует белок, обеспечивающий физическую связь между CSC и кортикальными микротрубочками, определяющими направление движения CSC в плазмалемме (Paredez et al., 2006), и наблюдается более хаотичная ориентация микрофибрилл целлюлозы по сравнению с растениями дикого типа. У двойного мутанта stl1-1stl2-2 нарушается сборка комплекса CSC в аппарате Гольджи и его доставка в плазмалемму, что приводит к меньшему содержанию целлюлозы в клеточных стенках (Zhang et al., 2016). У мутанта ixr1-1 замена глицина на аспарагин в трансмембранном домене CESA3 снижает уровень кристалличности микрофибрилл без изменения общего содержания целлюлозы в клеточных стенках (Scheible et al., 2001; Griffiths et al., 2015).

Центральная роль микрофибрилл целлюлозы в архитектуре первичных клеточных стенок предполагает их участие в регуляции большинства ростовых процессов через изменение растяжимости клеточных стенок. Однако экспериментальные данные по этому вопросу до сих пор остаются ограниченными из-за двух главных методологических сложностей:
(1) многие мутанты по синтезу/организации целлюлозы отличаются карликовостью (Nicol et al., 1998), что затрудняет закрепление их миниатюрных органов в экспериментальных установках, используемых для оценки растяжимости клеточных стенок. Для классических методов биомеханики, в которых растительные образцы растягиваются вдоль их длинной оси, т.е. в направлении максимального роста клеток, длина образца должна составлять минимум 5-7 мм. Причем реально растягивают 2-3 мм отрезок ткани, а остальная часть образца находится внутри зажимов системы или используется для приклеивания к системе. Образцы значительно меньшего размера можно исследовать при помощи самых современных методик анализа на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ), обладающих огромным пространственным разрешением (Peaucelle et al., 2011, 2015; Petrova et al., 2021). Однако в случае АСМ происходит продавливание поверхности образца ортогонально направлению максимального роста клеток, что затрудняет связывание полученных данных с растяжимостью клеточной стенки (Cosgrove, 2016). Открытие новых компонентов комплекса целлюлозосинтазы (Lampugnani et al., 2019) было связано с получением мутантов, в которых изменения организации целлюлозы не сопровождались сильнейшим подавлением роста. Их размеры позволяют анализировать биомеханику клеточных стенок при помощи классических методов.
(2) Нарушение организации целлюлозы часто снижает степень анизотропии роста клеток (Baskin, 2005) – осевые органы растения становятся более короткими и толстыми. В исследованиях биомеханики таких утолщенных органов необходимо делать поправку на площадь поперечного сечения клеточных стенок, чтобы знать, обусловлены ли различия с более тонкими контрольными органами растения неодинаковым количеством материала клеточных стенок или его качественными характеристиками (или сочетанием двух этих факторов). Поэтому правильная интерпретация данных по влиянию целлюлозы на биомеханику клеточных стенок требует точного определения площади их поперечного сечения, желательно с использованием по меньшей мере двух независимых методов.

Несмотря на то, что в 1980-е гг. были разработаны методики прямого анализа растяжимости клеточных стенок in vivo (Cosgrove, 1986), они не используются в настоящее время из-за сложности и ограниченного функционала. Вместо них применяют разные биомеханические анализы in vitro, результаты которых дают приближенную оценку растяжимости клеточных стенок in vivo (Suslov and Vissenberg, 2018). Среди методик in vitro наилучшую оценку растяжимости обеспечивает метод крипа, при котором измеряется деформация образца изолированных клеточных стенок при постоянной нагрузке с течением времени. Преимуществом метода крипа над другими методиками in vitro является то, что напряжение (сила, поделенная на площадь поперечного сечения образца, через которую она действует), генерируемое во время измерения, остается по существу постоянным, что имеет сходство с действием тургора, который растягивает клеточные стенки in vivo во время роста и также мало изменяется со временем. Кроме того скорость крипа (крип – зависимая от времени деформация образца) является относительно низкой и сопоставимой со скоростью роста in vivo, это предопределяет сходную динамику перестроек полимеров клеточной стенки в ходе обоих процессов. Наконец, направление деформации клеточных стенок при измерении крипа обычно совпадает с направлением максимального роста in vivo. Именно эти преимущества метода крипа позволили открыть белки экспансины (McQueen-Mason et al., 1992), размягчающие клеточные стенки в ходе роста клеток растяжением. В настоящее время способность выделенного белка изменять скорость крипа клеточных стенок in vitro рассматривается как главное прямое доказательство его участия в регуляции растяжимости клеточной стенки in vivo.

Организация целлюлозы, по-видимому, играет важную роль в механизме кислого роста (Xin et al., 2020). Теория кислого роста объясняет ранний этап ауксинзависимого роста у растений (Hager et al., 1971; Rayle, Cleland, 1992; Arsuffi, Braybrook, 2017). Она предполагает, что фитогормон ауксин индуцирует подкисление апопласта благодаря активации протонных насосов плазмалеммы, а меньший рН активирует в клеточной стенке белки, увеличивающие ее растяжимость, что стимулирует рост растительных клеток. В 1992 году было показано, что ключевыми белками, опосредующими эффект подкисления апопласта на растяжимость, являются экспансины, разрушающие водородные связи между компонентами клеточных стенок (McQueen-Mason et al., 1992). Результаты недавнего анализа крипа клеточных стенок гипокотилей мутанта арабидопсиса по синтезу целлюлозы jia1-1 и по организации целлюлозы csi1-3 продемонстрировали то, что для вызванного ауксином или фузикокцином кислого роста, опосредованного экспансинами, требуется интактная перекрестно-многослойная организация микрофибрилл целлюлозы в клеточных стенках (Xin et al., 2020). Однако данные результаты требуют перепроверки, т.к. вызывает сомнение корректность расчета площади поперечного сечения клеточных стенок у мутантов и не учитывается то, что эффект экспансинов на скорость крипа изолированных клеточных стенок при кислых значениях рН тем выше, чем больше механическое напряжение, генерируемое в клеточных стенках (Miedes at al., 2013; Suslov et al., 2015). В настоящей заявке для краткости изложения выражение «кислый рост» описывает и механизм раннего этапа ауксинзависимого роста in vivo, и значительное ускорения растяжения изолированных клеточных стенок в присутствии кислого буфера in vitro.

Гравитропизм является другим ростовым ответом с вероятным участием микрофибрилл целлюлозы в регуляции растяжимости клеточных стенок, при котором органы растения изгибаются в ответ на изменение их положения относительно вектора силы тяжести (Morita, 2010). Гравитропический изгиб формируется за счет разной скорости роста клеток на верхней и нижней стороне гравистимулированного органа (Miller et al., 2007) c соответствующей дифференциальной регуляцией растяжимости клеточных стенок (Ikushima et al., 2008). Известно, что при гравитропическом изгибе побега и корня у разных видов растений происходят однотипные перестройки кортикальных микротрубочек: они приобретают поперечную ориентацию на выгнутой стороне и продольную ориентацию на вогнутой стороне гравистимулированного органа (Blancaflor, Hasenstein, 1995; Himmelspach et al., 1999; Zhang et al., 2008). Поскольку кортикальные микротрубочки определяют направление отложения целлюлозы (Paredez et al., 2006), в гравистимулированных органах растений можно было бы ожидать соответствующих перестроек микрофибрилл. Насколько нам известно, до сих пор не проводилось исследований организации целлюлозы при гравитропизме. Если перестройки микрофибрилл действительно участвуют в тонкой регуляции растяжимости клеточных стенок на противоположных сторонах гравистимулированных органов, тогда можно ожидать влияния ингибиторов биосинтеза целлюлозы и мутаций, затрагивающих целлюлозу, на гравитропизм и сопровождающие его изменения механики стенок.

Cчитается, что в первичных клеточных стенках во внутренней части микрофибрилл цепи целлюлозы уложены высокоупорядоченно с образованием кристаллической структуры, тогда как на поверхности микрофибрилл наблюдается более аморфная организация данного полисахарида (Pauly et al., 1999). В зависимости от соотношения между этими доменами изменяется степень кристалличности целлюлозы в клеточных стенках. Влияние степени кристалличности целлюлозы на ростовые ответы растений, включая кислый рост и гравитропизм, не изучено, но может представлять интерес с практической точки зрения. Менее кристалличные микрофибриллы целлюлозы легче подвергаются кислотному гидролизу с образованием глюкозы, которую далее сбраживают для получения биоэтанола (DeBolt et al., 2013). Соответственно, растения, у которых снижение степени кристалличности микрофибрилл целлюлозы не сопровождается значительным уменьшением скорости роста и накопления биомассы, были бы более перспективным сырьем для производства биотоплива.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта
Объектами исследования в экспериментах по влиянию организации целлюлозы на растяжимость клеточных стенок будут гипокотили этиолированных проростков арабидопсиса дикого типа (Col-0), выращенных в присутствии фитогормонов и ингибиторов, и гипокотили мутантов pom2, stl1stl2, ixr1-1. Проростки арабидопсиса будут выращиваться в темноте при 21С в стерильных условиях на вертикальных квадратных чашках Петри со средой Мурасиге-Скуга, разбавленной вдвое. В экспериментах по гравитропизму гравистимуляция будет проводиться поворотом вертикальных чашек Петри с проростками на 90 градусов против часовой стрелки. Проростки будут сфотографированы в разные моменты времени после гравистимуляции, а угол гравитропческого изгиба гипокотилей будет определен на фотографиях при помощи программы ImageJ. Анализ биомеханики клеточных стенок будет проводиться на замороженных/оттаявших образцах, что устраняет тургор, усложняющий интерпретацию данных, но сохраняет активности белков клеточных стенок. Проростки арабидопсиса будут заморожены целиком. Механика клеточных стенок будет проанализирована методом крипа (определение зависимой от времени деформации клеточных стенок при постоянной нагрузке) на сделанном на заказ экстенсометре, описанном в Suslov and Vissenberg (2018). В состав данного прибора входит индуктивный датчик смещения Meas 200HR-006 (США), усилитель Althen MC-IP-12E-B10 (Германия), аналогово-цифровой преобразователь Dataq DI-710-EH (США) и два микроманипулятора Thorlabs RB13M/M (США). Исследуемые образцы будут закреплены между зажимами экстенсометра, герметичная камера нижнего зажима будет заполнена буфером, таким образом, что экспериментальный образец оказывается полностью погруженным в раствор, после чего будет приложена постоянная нагрузка, вызывающая крип – зависимую от времени деформацию клеточных стенок. Растяжение клеточных стенок in vitro будет изучено под действием широкого диапазона нагрузок, которые имитируют влияние разных значений тургора на клеточные стенки. Измерения крипа в зависимости от задач эксперимента будут осуществляться при рН 5, 6 и при рН 5 в сочетании с тепловой инактивацией клеточных стенок. При рН 5 активируются эндогенные экспансины клеточной стенки (McQueen-Mason et al., 1992), опосредующие феномен «кислого роста», при рН 6 экспансины теряют активность, зато активируются ксилоглюканэндотрансглюкозилазы/гидролазы (XTH) и другие белки, которые связывают с регуляцией растяжимости клеточной стенки (Maris et al., 2011; Van Sandt et al., 2007). Наконец, при рН 5 в сочетании с тепловой инактивацией теряется активность по существу всех ферментов клеточной стенки, и ее растяжение определяется только механикой структурных полимеров и характером статичных взаимодействий между ними. Помимо определения скорости крипа – традиционной характеристики биомеханики клеточной стенки – в некоторых экспериментах будут измерены более точные показатели, характеризующие растяжимость клеточной стенки - скорость крипа/напряжение, растяжимость клеточной стенки in vitro, порог податливости клеточных стенок in vitro (Miedes et al., 2013; Suslov et al., 2015). В общем, скорость крипа любого образца клеточных стенок пропорциональна механическому напряжению, генерируемому в них приложенной силой. Механическое напряжение равно отношению силы к площади поперечного сечения, через которую она действует. Соответственно, для адекватности сравнения механики разных клеточных стенок необходимо учитывать генерируемое в них напряжение, зная силу и площадь поперечного сечения образца. Сила, действующая на клеточную стенку при анализе крипа, рассчитывается из хорошо известного соотношения, согласно которому нагрузка 102 г генерирует силу 1 Ньютон в условиях нормальной гравитации. Площадь поперечного сечения клеточных стенок в данном проекте будет рассчитана по меньшей мере двумя независимыми способами. Во-первых, будет использован классический способ на основе взвешивания высушенных отрезков гипокотилей, которые растягиваются в экстенсиометре, используя известную плотность материала клеточных стенок 1,5 г/см3, которая мало изменяется в зависимости от источника клеточных стенок, и формулу, приведенную в литературе (Cleland, 1967; Gibson, 2012; Miedes et al., 2013; Suslov et al., 2015). Во-вторых, будет проведено прямое измерение площади сечения клеточных стенок с использованием крио-сканирующей электронной микроскопии, которая позволяет избежать артефактов, обусловленных фиксаторами и обезвоживающими агентами, поэтому применение этого метода позволит получить максимально точные данные (Derbyshire et al., 2007). Фрагменты гипокотилей будут заморожены погружением в жидкий этан, охлажденный жидким азотом до -183ᵒС или с помощью устройства для замораживания под высоким давлением HPM100 (Leica), расколоты поперек вручную или в устройстве для скалывания BAF 060 (Leica). После напыления углеродом и платиной образцы будут изучены в сканирующем микроскопе Mira3 (Tescan) с охлаждаемым столиком при температуре -100-120ᵒС и получены изображения для последующих измерений.
Для оценки изменений организации микрофибрилл целлюлозы будет использована рутинная сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Для рутинной СЭМ планируется получить образцы очищенных клеточных стенок (Mullendore et al., 2010). Замороженные в жидком азоте фрагменты гипокотилей будут погружены в охлажденный жидким азотом 70% этанол, медленно согреты до -20°C, затем постепенно гидратированы и проинкубированы в среде, содержащей 0.1% протеиназы K при 55˚C в течение 14 дней со сменой среды на свежую после первых 7 дней инкубации. Затем из фрагментов гипокотилей будут получены срезы толщиной 0.5-1 мм, лиофильно высушены, смонтированы на столики и напылены слоем платины толщиной 3 нм и изучены в сканирующем микроскопе Mira3 (Tescan) при стандартных условиях.
ОБЩИЙ ПЛАН РАБОТЫ НА ВЕСЬ СРОК ВЫПОЛНЕНИЯ ПРОЕКТА
2023 г.
1. Отработать на гипокотилях арабидопсиса метод анализа площади поперечного сечения клеточных стенок с использованием электронной микроскопии и анализа изображений и сравнить его результаты с результатами классического расчетного способа определения площади поперечного сечения клеточных стенок на основе взвешивания высушенных образцов.
2. Провести анализ биомеханики клеточных стенок гипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса с нарушенной ориентацией целлюлозы под влиянием фитогормона эпибрассинолида (100 нМ), ингибитора микротрубочек оризалина и мутации pom2.
3. Провести анализ биомеханики клеточных стенок гипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса с подавленным синтезом целлюлозы под влиянием ингибитора изоксабена и двойной мутации stl1stl2.
4. Провести анализ биомеханики клеточных стенок гипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса с пониженной кристалличностью целлюлозы под влиянием мутации ixr1-1.
5. Провести анализ организации микрофибрилл целлюлозы в гипокотилях этиолированных проростков арабидопсиса дикого типа (Col-0), выращенных в присутствии 100 нМ эпибрассинолида, с использованием электронной микроскопии.
2024 г.
1. Оценить влияние ингибитора микротрубочек оризалина, ингибитора биосинтеза целлюлозы изоксабена и мутаций pom2, stl1stl2 и ixr1-1 на формирование гравитропического изгиба гипокотилей арабидопсиса.
2. Измерить площадь поперечного сечения клеточных стенок гипокотилей у этиолированных проростков арабидопсиса дикого типа, обработанных 0,2 мкМ брассиназолом (ингибитор биосинтеза фитогормонов брассиностероидов), и тройного мутанта csla2csla3csla9 с отсутствием маннанов в клеточных стенках, которые отличаются формированием усиленного гравитропического изгиба гипокотилей.
3. При помощи электронной микроскопии проанализировать организацию микрофибрилл целлюлозы на выгнутой и вогнутой стороне гравистимулированных гипокотилей арабидопсиса, гравитропизм которых изменяется под влиянием исследованных ингибиторов и мутаций.
4. Проанализировать биомеханику гравистимулированных гипокотилей арабидопсиса, гравитропизм которых изменяется под влиянием исследованных ингибиторов и мутаций.

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту
Исследования биомеханики клеточных стенок, оценка их растяжимости методом крипа являются одним из основных направлений работы руководителя группы в течение уже почти 20 лет. В 2003 году в Бельгии (Университет Антверпена), а затем в 2018 в России (Санкт-Петербургский государственный универститет) Суслов Д.В сконструировал экстенсометр – прибор позволяющий отслеживать деформации миниатюрных образцов клеточных стенок растений (Suslov, Verbelen, 2006; Suslov, Vissenberg, 2018). На основе адаксиального эпидермиса чешуй луковиц Allium cepa была разработана модель, позволяющая связывать механику первичных клеточных стенок с предпочтительной ориентацией в них микрофибрилл целлюлозы (Suslov, Verbelen, 2006; Suslov et al., 2009). Инактивированный нагреванием адаксиальный эпидермис растущих луковиц далее был успешно использован в качестве модели для оценки влияния белков на растяжимость клеточных стенок. С использованием данной платформы впервые были получены прямые доказательства того, что ферменты ксилоглюканэндотрансглюкозилазы/гидролазы (XTH) способны регулировать растяжимость клеточных стенок (Van Sandt et al., 2007; Maris et al., 2009). В 2008 г. началась разработка новой модели – гипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса – для исследования роли клеточных стенок в регуляции роста и развития растений. На гипокотилях арабидопсиса было показано, что эффект брассиностероидов на гравитропизм связан с изменениями механики клеточных стенок (Vandenbussche et al., 2011). Эта работа оказалась первой в мире, в которой было описано успешное применение метода крипа для анализа клеточных стенок арабидопсиса – самого популярного модельного организма в биологии растений, использование которого в исследованиях биофизики клеточных стенок долгое время было ограниченным из-за миниатюрных размеров его органов. В дальнейшем осуществлялись постоянные усовершенствования методики крипа применительно к клеточным стенкам гипокотилей арабидопсиса. В исследовании по влиянию сверхэкспрессии ХТН на скорость роста гипокотилей (Miedes et al., 2013) было показано, что в интерпретации результатов анализа методом крипа чрезвычайно важно учитывать площадь поперечного сечения клеточных стенок. Для гипокотилей арабидопсиса был адаптирован и усовершенствован классический расчетный способ определения данного показателя на основе взвешивания большого количества высушенных отрезков данного органа. В исследовании о связи сверхэкспрессии экспансиноподобного белка AtEXLA2 со скоростью роста арабидопсиса был разработан оптимизированный для гипокотилей арабидопсиса способ тепловой инактивации клеточных стенок (Boron et al., 2015). В исследовании по механизмам снижения скорости роста по ходу развития гипокотилей этиолированных проростков арабидопсиса дикого типа (Suslov et al., 2015) были разработаны новые показатели крипа клеточных стенок, которые лучше коррелируют со скоростью роста in vivo, чем традиционный показатель – скорость крипа. К ним относятся растяжимость клеточной стенки in vitro, порог податливости клеточных стенок in vitro и скорость крипа/напряжение. Было продемонстрировано, что со скоростью роста лучше всего коррелируют показатели крипа клеточных стенок при рН 5, т.е. при физиологическом значении рН, оптимальном для проявления активности эндогенных экспансинов. Важная роль экспансинов в контроле роста гипокотилей арабидопсиса также подтверждается результатами нашего исследования, в котором циркадные колебания скорости роста были четко связаны с активностью эндогенных экспансинов (Ivakov et al., 2017). В самой свежей публикации группы было показано, что нарушения гравитропизма гипокотилей арабидопсиса в присутствии 24-эпибрассинолида (EBL) сопровождаются дезорганизацией целлюлозы в клеточных стенках у основания данного органа (Somssich et al., 2021). Любопытно, что EBL увеличивает крип клеточных стенок при рН 6, однако скорость роста гипокотилей при этом снижается. Возможным объяснением является то, что большая скорость крипа при рН 6 (при котором экспансины не активны) отражает ослабление клеточных стенок из-за нарушения организации целлюлозы, тогда как снижение скорости роста связано с падением уровня экспрессии и/или активности эндогенных экспансинов, или с менее оптимальной для работы экспансинов организацией целлюлозы. Таким образом, гипокотили проростков арабидопсиса, выращенных в присутствии EBL, являются перспективной моделью для выяснения роли организации целлюлозы в феномене «кислого роста». В этом же исследовании (Somssich et al., 2021) было установлено, что снижение уровня гемицеллюлоз маннанов в клеточных стенках под влиянием брассиназола (ингибитор биосинтеза фитогормонов брассиностероидов) или тройной мутации csla2csla3csla9 усиливает гравитропизм гипокотилей арабидопсиса.
Тарасова М.С. является специалистом в области анатомии растений. Она владеет всеми основными методами световой, просвечивающей и сканирующей электронной микроскопии. Бакалаврская работа М.С. Тарасовой была посвящена изучению строения и распределения трихом проростков растений сем. Cleomaceae, Для исследования она использовала самые современные методы: EnvSEM (Environmental SEM, сканирующая микроскопия в естественных условиях) и SBF SEM (Serial Block Face SEM, серийное сканирование поверхности блока) для построения трехмерных реконструкций клеток, а также математическую обработку морфометрических данных.
Таким образом, большой опыт заявителей в исследовании биомеханики клеточных стенок с использованием гипокотилей арабидопсиса в качестве модели (Д.В. Суслов) и электронной микроскопии (М.С. Тарасова) является достаточным для успешной реализации проекта.
Публикации по темам, связанным с проектом:
1) Ivakov, A. A., Flis, A., Apelt, F., Fuenfgeld, M., Scherer, U., Stitt, M., Kragler, F., Vissenberg, K., Persson, S., & Suslov, D. (2017). Cellulose synthesis and cell expansion are regulated by different mechanisms in growing Arabidopsis hypocotyls. Plant Cell, 29(6), 1305-1315. https://doi.org/10.1105/tpc.16.00782111
IF 8,228 (2017)
Q1 in Plant Science (2017)
2) Suslov, D., & Vissenberg, K. (2018). Cell Wall Expansion as Viewed by the Creep Method. In A. Geitmann, & J. Gril (Eds.), Cell Wall Expansion as Viewed by the Creep Method (Plant Biomechanics, pp. 305-320). Springer Nature. https://doi.org/10.1007/978-3-319-79099-2_14
3) Medvedev, S., Voronina, O., Tankelyun, O., Bilova, T., Suslov, D., Bankin, M., Mackievic, V., Makavitskaya, M., Shishova, M., Martinec, J., Smolikova, G., Sharova, E., & Demidchik, V. (2019). Phosphatidic acids mediate transport of Ca 2+ and H + through plant cell membranes. Functional Plant Biology, 46(6), 533-542. https://doi.org/10.1071/FP18242
IF 2,617 (2019)
Q1 in Plant Science (2019)
4) Gorshkov, O., Chernova, T., Mokshina, N., Gogoleva, N., Suslov, D., Tkachenko, A., & Gorshkova, T. (2019). Intrusive Growth of Phloem Fibers in Flax Stem: Integrated Analysis of miRNA and mRNA Expression Profiles. Plants, 8(2), [47]. https://doi.org/10.3390/plants8020047
IF 2,762 (2019)
Q1 in Plant Science (2019)
5) Zdanio, M., Boron, A. K., Balcerowicz, D., Schoenaers, S., Markakis, M. N., Mouille, G., Pintelon, I., Suslov, D., Gonneau, M., Höfte, H., & Vissenberg, K. (2020). The Proline-rich Family Protein EXTENSIN33 Is Required For Etiolated Arabidopsis thaliana Hypocotyl Growth. Plant and Cell Physiology, 61(6), 1191-1203. https://doi.org/10.1093/pcp/pcaa049
IF 4,927 (2020)
Q1 in Plant Science (2020)
6) Somssich, M., Vandenbussche, F., Ivakov, A., Funke, N., Ruprecht, C., Vissenberg, K., Van Der Straeten, D., Persson, S., & Suslov, D. (2021). Brassinosteroids Influence Arabidopsis Hypocotyl Graviresponses through Changes in Mannans and Cellulose. Plant and Cell Physiology, 62(4), 678-692. https://doi.org/10.1093/pcp/pcab024
IF 4,927 (2020)
Q1 in Plant Science (2020)
Реализованные научно-исследовательские работы:
1) грант РФФИ 15-04-04075 "Роль клеточных стенок в контроле гравитропизма растений", 2015-2017 гг., руководитель
2) грант СПбГУ 32809316 "Командировка в Университет Антверпена для выполнения совместной научной работы по теме Разработка нового метода оценки растяжимости клеточных стенок у высших растений", 04.10.2017-08.11.2017 г., руководитель
3) грант РФФИ 19-04-00424 "Новая функция маннанов как ключ к пониманию эволюции клеточных стенок наземных растений", 2019-2021 гг., руководитель
Доклады по тематике исследования на российских и международных научных (научно-практических) семинарах и конференциях:
1) Суслов, ДВ, Пожванов, ГА, Липчинский, АА, Ферни, А, Виссенберг, К & Перссон, С 2018, 'РОЛЬ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТАБОЛИТОВ, БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ СТЕНОК В ФОРМИРОВАНИИ ГРАВИТРОПИЗМА ПОБЕГОВ ARABIDOPSIS THALIANA' IV Всероссийская конференция Фундаментальная гликобиология, Киров, Российская Федерация, 23/09/18 - 28/09/18, стр. 27-28. Тезисы опубликованы в виде электронного сборника и размещены на сайте конференции: http://glycobiologyrussia2018.ru/ustnyye-doklady . Устный доклад.
2) Lipchinsky A. Durovin K., Suslov D. Effect of microfibril diameter on defect-mediated wall loosening. XV Cell Wall Meeting, 7-12 July 2019, Cambridge, United Kingdom, международная, сборник тезисов был разослан участникам конференции по электронной почте в виде pdf файла, https://cellwall2019.org/, стр. 241; постерная презентация.
3) Суслов Д.В., Сомссих М., Ванденбуше Ф., Иваков А., Функе Н., Рупрехт К., Виссенберг К., Ван Дер Стратен Д., Перссон С. Влияние брассиностероидов на гравитропизм побегов выявляет новую функцию маннанов клеточных стенок. IX Съезд общества физиологов растений России «Физиология растений – основа создания растений будущего», 18-24 сентября 2019 г., Казань, Россия, всероссийская с международным участием, электронный сборник тезисов доступен для скачивания на сайте конференции, https://congresskazan2019.ofr.su/speakers, стр. 418; устный доклад.
4) Пожванов Г.А., Липчинский А.А., Суслов Д.В. Влияние маннанов на гравитропизм побегов растения и его возможные механизмы. V Всероссийская конференция «Фундаментальная гликобиология», 21-24 сентября 2021 г., Гатчина, Россия, всероссийская, тезисы опубликованы в электронном сборнике на сайте конференции и размещены на платформе научной электронной библиотеки http://elibrary.ru с индексацией в базе Российского индекса научного цитирования (РИНЦ); https://glycobiology.pnpi.nrcki.ru/wp-content/uploads/2021/09/glycobiology2021_abstracts_v2.pdf, стр. 15-16; устный доклад.
5) Suslov D, Pozhvanov G, Lipchinsky A. Control of Arabidopsis thaliana shoot gravitropism at the level of cell wall biomechanics and metabolomics. 2022. 13th International Multiconference on “Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology” – BGRS/SB-2022, 4-8 July 2022, Novosibirsk, Russia, международная, электронный сборник тезисов, https://disk.icgbio.ru/s/ejG5gRfYGRpML25, рр. 663-664, устный секционный доклад.
AcronymRSF_SRG_2023 - 2
StatusActive
Effective start/end date1/01/2431/12/24

ID: 115665316