Научная проблема, на решение которой направлен проект
Проект направлен на изучение вклада материнского генома в оогенез и раннее развитие на уровне эволюционноконсервативных гомеобоксных транскрипционных факторов из класса ANTP. Известно, что начальные этапы развития многоклеточных животных протекают под контролем материнских РНК и белков. Функции некоторых из них хорошо изучены на классических модельных объектах (мышь, шпорцевая лягушка, дрозофила, нематода). Вместе с тем пока не существует сравнительных эволюционных исследований материнского вклада в развитие. Новый модельный объект -
эррантная аннелида Platynereis dumerilii, принадлежит к группе спиральных животных и никогда системно не
изучалась в отношении эволюционно-консервативных материнских факторов. Успешная реализация проекта позволит
консолидировать данные о материнских факторах семейства ANTP по всем трём ветвям EuBilateria (Nephrozoa).
Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы
Развитие любого многоклеточного организма начинается с деления единственной клетки, под контролем РНК и белков,
которые синтезированы другим геномом, а именно геномом материнским. У большинства животных дробление
протекает до активации зиготического генома и целиком зависит от ресурсов, запасённых в ооците. В частности, у
амфибий, энуклеированная яйцеклетка развивается до стадии бластулы (Briggs et al., 1951), т.е. исключительно за счёт
материнского вклада.
Материнский геном обеспечивает дробящийся эмбрион строительным материалом в виде предшественников
макромолекул, инструментами для строительства в виде housekeeping-РНК и белков, и набором молекулярных
инструкций, которые управляют ранним развитием. Эти инструкции существуют в виде не случайно распределённых
структурных и регуляторных белков и их иРНК. В большинстве случаев именно сегрегация таких материнских
детерминант и определяет всю архитектуру дальнейшего развития, потому что устанавливает геометрические оси в
эмбрионе и специфицирует клеточные линии.
Перед материнским геномом стоят очень сложные и противоречивые задачи. Во-первых, он должен подавить раннюю
активацию зиготического генома, поскольку транскрипция и репликация контрпродуктивные друг для друга события.
Во-вторых, материнские детерминанты должны активировать зиготический геном по прошествии фазы быстрого
дробления и настроить его работу, в том числе, с учётом дозовой компенсации материнских и отцовских аллелей.
Третья задача – своевременная элиминация материнских РНК и белков к моменту перехода зародыша под контроль
собственного генома. Все эти функции реализуются при помощи большого набора макромолекул, среди которых
особенно интересны уникальные РНК (считываются с однокопийных локусов ДНК). Известно, что по количеству
уникальных РНК ооциты в несколько раз превосходят любые дифференцированные клетки организма (Davidson and
Britten, 1979, Davidson, 1986; монография «Gene Activity in Early Development»). Функции большинства уникальных
материнских РНК не исследованы даже у модельных животных.
Гены из класса ANTP - эволюционно консервативные и иерархически высокие регуляторы. Класс ANTP состоит из 49
семейств, которые принято делить на истинные Hox-гены, Hox-подобные гены, ParaHox-гены и NK-гены (Ferrier, 2016).
Все они критически важны для развития и эволюции многоклеточных животных. Первые гены ANTP (из подкласса NK)
появляются у гребневиков и губок, поэтому эволюцию Metazoa из одноклеточного предка часто ассоциируют с
возникновением класса ANTP (Larroux et al., 2007; Moroz et al., 2014). Несмотря на консервативность, гены из класса
ANTP легко приобретают материнские функции. Так, у насекомых описаны материнские транскрипты генов bicoid, zen,
even-skipped, fushi-tarazu и caudal (Dearden et al. 2000;Wilson and Dearden 2012). Кроме того, в открытой базе данных
in situ у Drosophila обнаруживаются и другие ANTP-гены с материнскими РНК ( abd-A, unpg, Distal-less, Ind) (BDGP in situ
hybridization database: https://insitu.fruitfly.org/cgi-bin/ex/insitu.pl). Важно, что многие из них (Hox и Hox-подобные
гены, ParaHox-ген caudal) являются материнскими и у млекопитающих. Если спиральные животные используют
ортологи этих генов в оогенезе и раннем развитии, значит EuBilateria в целом унаследовали этот принцип регуляции от
общего предка. Филогенетическое положение нереид, как модельных объектов эволюционной биологии развития,
убеждает, что на них удобно исследовать анцестральные функции гомеобоксных генов. Нельзя исключить, что
некоторые из этих функций связаны с до-билатеральным или даже до-метазойным прошлым этих генов. Материнские
функции ANTP-генов могут оказаться первичными по отношению к более поздним каноническим функциям
паттернирования многоклеточного тела.
Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и
комплексность
Проект направлен на изучение материнских транскриптов эволюционно-консервативных генов из класса ANTP у нового
модельного объекта – нереидной аннелиды Platynereis dumerilii. Основная задача проекта – найти и охарактеризовать
гены с материнским эффектом на качественном и количественном уровне (RT-PCR, Q-PCR) и изучить рисунок
распределения их РНК в раннем развитии (in situ-гибридизация). Эти данные помогут выявить консервативные
ансамбли регуляторов в оогенезе и раннем развитии билатеральных животных или укажут на высокую эволюционную
изменчивость материнского вклада на уровне этих генов-инструкторов.
Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов
Появление нового объекта в биологии развития всегда предвещает интересные открытия. Аннелида Platynereis
dumerilii оказалась замечательной моделью для изучения структурной и функциональной эволюции генов,
управляющих морфогенезами. Многие эволюционные вопросы, которые возникают при изучении модельных
позвоночных и членистоногих, связаны с поиском базального состояния регуляции того или иного процесса.
Например, позвоночные и беспозвоночные животные из линии Ecdysozoa отличаются наборами нейропептидов и
нейромедиаторов. У спиральных животных (Platynereis) обнаружены оба набора молекул (Williams and Jekely, 2019),
что закрывает вопрос об их предковом репертуаре. Схожая картина возникает при изучении эволюции сигнальных
путей (RA, Hh, Wnt) или работы транскрипционных факторов (Saudemont et al., 2008; Janssen et al., 2010; Dray et al.,
2010; Handberg-Thorsager et al., 2018). Platynereis станет очень перспективным объектом для изучения материнских
детерминант. Недавно мы нашли транскрипты Hox-генов в ооцитах Platynereis и описали их на уровне RT-PCR и in situгибридизации (Maslakov et al., 2021). Наш проект – более масштабное продолжение этого исследования с
привлечением всех ANTP-генов и более точного метода анализа (Q-PCR). Нереидные аннелиды используют ярко
выраженную R-стратегию при репродукции и одна самка P. dumerilii производит ~ 2500-3000 икринок, поэтому у нас не
будет проблем с получением качественной РНК. Все аналитические и экспериментальные методы, используемые в
проекте, освоены заранее, поэтому задачи достижимы, а получение интересных и важных результатов очень
вероятно.
Современное состояние исследований по данной проблеме
Все известные материнские гены можно разделить на три большие группы, исходя из их функций и скорости
эволюции. В первую группу попадают гиперконсервативные гены. Оказалось, что у человека, мыши, асцидии,
нематоды, мухи и прудовика примерно 10% (~300-400 генов) всех материнских транскриптов отчётливо гомологичны
(Liu et al., 2014). Большинство из них относится к генам «домашнего хозяйства», но функциональный баланс этого
консервативного набора факторов смещён в сторону жизнеобеспечения не любой клетки, а именно ооцита и ранних
бластомеров (Liu et al., 2014).
Во вторую группу попадают материнские гены, которые управляют развитием на нескольких разных этапах, т.е., имеют
зиготические функции. Закономерным образом эти гены оказались умеренно консервативными. Скорее всего, они
были кооптированы в процесс оогенеза и раннего развития, но стабилизирующий отбор, основанный на сохранении их
поздних и анцестральных функций, ограничил их дивергенцию. Самые известные примеры таких генов описаны у
Drosophila и других насекомых. В первую очередь это гены Hunchback (Hb) и Caudal (Cad). Оба они имеют материнские
матрицы и вовлечены в раннюю разметку тела эмбриона. Вместе с тем, это важные зиготические регуляторы более
поздних событий (в том числе у имаго). Ген Hb, по всей видимости, унаследован первичноротыми животными от
предковой последовательности, которая у современных позвоночных дуплицировалась и образовала семейство генов
Ikaros (John et al., 2009). Hb-подобные гены аннелид, моллюсков и членистоногих экспрессируются очень рано и иногда
имеют материнские РНК (Capitella sp., Ilyanassa obsoleta, Crepidula fornicata). Ген Cad – универсальный маркер заднего
конца тела и контролёр гаструляцией у большинства билатеральных животных. У него множество функций во взрослых
тканях, поскольку он управляет работой Hox-генов. Материнские РНК гена Cad и его гомологов найдены у насекомых и
позвоночных, но пока нет информации о спиральных животных.
Надо сказать, что эмбриональные гены насекомых легко приобретают материнские функции. Хорошо известные
зиготические сегментационные гены из группы pair-rule - even-skipped (eve), fushi tarazu (ftz), runt и hairy (h) находятся
у Drosophila под контролем материнских и ранних зиготических детерминант. Однако эти же гены у медоносной
пчелы Apis mellifera приобрели материнские функции (Wilson and Dearden 2012). Функциональные тесты (RNAi) выявили, что все они стали координатными генами и регулируют распределение материнских и ранних зиготических
РНК (Otd, Cad, Hb). У Drosophila зиготический ген zen (дивергентный Hox3) работает в дорзальной внезародышевой
эктодерме. У саранчи Schistocerca gregaria он приобрёл материнскую функцию и его материнский белок локализуется
на заднем полюсе раннего эмбриона (Dearden et al. 2000).
Гены из третьей группы кодируют специализированные материнские транскрипты, задействованные только на этапе
раннего развития. Они оказались самыми эволюционно-вариабельными. Из-за того, что их экспрессия и
фенотипические проявления разнесены на уровне поколений (ген работает у матери, но его функция проявляется в
потомках), а также потому, что только материнский аллель испытывает давление отбора, скорость эволюции таких генов
выше, чем зиготических (Barker et al., 2005). В частности, материнский ген bicoid, устанавливающий переднезаднюю
ось зародыша у Drosophila, оказался достоверно изменчивей, чем зиготический ген zen, от которого он произошёл
примерно 115 млн. лет назад (Barker et al., 2005). Самый известный материнский ген млекопитающих – мышиный ген
Mater (NLRP5 у человека). Его функция критична для гомеостаза Ca2+, распределения цистерн эндоплазматического
ретикулума и реорганизации цитоскелета ооцитов (Kim et al., 2014). Гаплоидные мутанты по гену Mater не имеют
фенотипических нарушений, но мыши-самки стерильны, потому что развитие эмбрионов прерывается на двуклеточной
стадии (Tong et al., 2000). Зиготический геном у таких эмбрионов не активируется. Mater и его ортологи не встречается
вне клады млекопитающих. Вероятно, из-за высокой изменчивости все материнские гены с исключительно
материнскими функциями имеют очень короткую эволюционную историю.
Вклад материнского генома в развитие ещё не изучался у аннелид системно, хотя ранние экспериментальные работы
указывают, что у Platynereis есть материнские детерминанты. В 1977 году профессор Альбрехт Фишер поставил
эксперимент, проверяющий гипотезу о влиянии материнских факторов на пигментацию глаз у Platynereis (Fischer,
1977). У червя есть ген (or+), отвечающий за темную пигментацию глаз. Мутантные гомозиготы (or-) имеют
слабопигментированные оранжевые глаза. Инъекция ооплазмы нормального ооцита в мутантный, восстанавливает
фенотип, но не наоборот, что говорит о нарушении у мутантов работы гена (or), а не о появлении у него новой функции
(or-). Фишер обнаружил, что у рецессивных гомозигот (or-/or-), полученных от гетерозиготных самок, в первые тричетыре дня развития глаза имеют темную пигментацию, которая затем пропадает. Он предположил, что это происходит
вследствие действия материнских факторов. В ходе экспериментов по пересадке ооцитов генетически разным самкам
Фишер определил, что цвет глаз личинок определяют именно материнские детерминанты, причём синтезирует их
геном самого ооцита (Fischer, 1977).
У P.dumerilii был описан материнский транскрипт гена Twist - раннего спецификатора мезодермы. До зиготической
активации (~8 часов после оплодотворения) материнский транскрипт Twist распределяется между потомками Dмакромера - 2d- и 4d-бластомерами. При этом зиготический транскрипт будет синтезироваться только в потомках 4d.
Функция материнского фактора Twist не изучена, но предполагается, что он необходим для ранней спецификации
линии мезодермальных клеток (Pfeifer et al., 2014).
Как и в случае с моллюсками, асимметричное спиральное дробление P. dumerilii находится под контролем материнских
факторов, изначально запасенных в ооците в виде транскриптов (Nakama et al., 2017). К ним относятся компоненты
установления кортикальных доменов (комплексы Par), кортикальных веретен, клеточной полярности и различные
адгезионные комплексы (в том числе продукты генов neuroglian, contactin и neurexin IV, работа которых была описана
в нервной ткани) (Nakama et al., 2017). Примечательно, что большая часть материнских РНК, необходимых для
асимметричных клеточных делений, резко деградирует, начиная с двух часов после оплодотворения. Эти материнские
факторы могут влиять не только на дробление клеток и их позицию в эмбрионе, но и на распределение других
материнских факторов, например β-катенина (Schneider and Bowerman, 2007).
В 2016 году Стефан Шнейдер и его коллеги исследовали транскрипционный ландшафт раннего спирального дробления
Platynereis на полногеномном уровне, начиная с двух часов развития (Chou et al., 2016). Несмотря на то, что к этому
сроку значительная часть материнских транскриптов червя деградирует, по остаточным (не нулевым) значениям
можно сделать заключение о примерно 4000 разных материнских РНК, среди которых есть транскрипты генов из
многих гомеобоксных классов (ANTP, PRD, POU, TALE, LIM). Это исследование мы планируем использовать для
первичной навигации при поиске материнских РНК.
Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта
Для успешного выполнения проекта понадобится:
- Самовоспроизводящаяся культура лабораторных животных (P. dumerilii)
- Высококачественная суммарная РНК из ооцитов и ранних эмбрионов для получения кДНК
- Репрезентативный набор генов интереса из открытых баз данных (GenBank (NCBI) и из собственных
транскриптомных баз (регенерационные транскриптомы P.dumerilii).
- Несколько пар праймеров на каждый кандидатный ген для оценочной RT-PCR, Q-PCR и для дальнейшего клонирования
- Фиксированные ооциты и ранние эмбрионы для in situ-гибридизации
Содержание лабораторной культуры P. dumerilii
На протяжении всего срока выполнения проекта будет поддерживаться культура лабораторных животных. В настоящий
момент ювенильные особи P. dumerilii содержатся в пластиковых контейнерах, в объеме ~300 ml. При помощи
аэратора в воду подаётся кислород. Два раза в неделю вода заменяется на свежую и животные получают еду
(измельчённые шпинат и креветки). Морскую воду мы получаем, растворяя коммерческую соль Красного моря (Red Sea
Coral Pro Salt) в дистиллированной воде и доводя соленость до нужного показателя (~ 32-34 ‰).
Для стимуляции вымета ооцитов зрелые самки отсаживаются в отдельную емкость. В шприц с фильтром (d = 0.22 um), в
небольшой объём воды помещается зрелый самец, выделяющий стимулирующие феромоны (L-Овотиол А) (Röhl et al.
1999). Водой из шприца самок стимулируют к вымету ооцитов. Ооциты используются для выделения суммарной РНК
и/или фиксируются в 4% PFA /1x PBS(T) в течение суток для in situ-гибридизации. В дальнейшем, после отмывки от
фиксатора, материал хранится в 100% MeOH или 70 % этаноле (-20C). Метод получения ооцитов хорошо отработан и
используется в нашей лаборатории на протяжении нескольких лет.
Выделение высококачественной суммарной РНК и синтез кДНК
Суммарная РНК из ооцитов и ранних эмбрионов понадобится на протяжении всего срока выполнения проекта. РНК
будет получена при помощи реагента QIAzol Lysis Reagent (QIAGEN, Venlo, Netherlands) и колоночных китов для очистки
суммарной РНК (Qiagen RNeasy Mini Kit, Евроген). Реагент уже закуплен в достаточном количестве. Качество
полученной РНК будет оцениваться при помощи фореза в агарозном геле. Количество и чистота образцов будет
определяться на спектрофотометре. Для исследования будет использована только высококачественная РНК с
показателями A 260/280 = 1.95-2. Такую РНК мы планируем дополнительно очищать от примесей геномной ДНК с
помощью ДНК-азы (TF Scientific). Готовые образцы РНК будут использованы в реакции обратной транскрипции с
применением высокотемпературной ревертазы Maxima H- (TF Scientific). Фермент уже закуплен и успешно
использовался для первичного анализа транскрипции и клонирования многих генов. Для решения основных задач,
поставленных в нашей работе, достаточно будет случайных гексамерных или декамерных праймеров при реверсии.
Отдельные кандидатные гены будут протестированы с использованием геноспецифичных праймеров, чтобы
определить ориентацию транскриптов (sense или antisense).
Выбор репрезентативного набора генов из класса ANTP и их филогенетический анализ
Этот этап будет реализован в первый год работы над проектом. Из разных стадий развития P.dumerilii получены
транскриптомы, которые представлены в открытой международной базе данных (GenBank (NCBI). Кроме того, мы
располагаем собственными аннотированными регенерационными транскриптомами очень хорошего качества. Для
всех генов, принадлежащих к классу ANTP, будут построены филогенетические деревья с применением on-line
сервиса Clustal Omega: https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/, (выравнивание аминокислотных
последовательностей) и набора алгоритмов на основе байесовского метода реконструкции предковых
последовательностей (MrBayes). Этот шаг необходим для выявления дуплицированных и дивергентных
последовательностей, которые с высокой вероятностью могут приобрести новые функции (например, материнские).
Проверочная RT-PCR
В течение первого года работы мы сконструируем наборы праймеров, позволяющие амплифицировать небольшие
фрагменты (~ 200 nt) каждого из выбранных генов. Мы предполагаем, что один и тот же набор праймеров можно будет
использовать для качественной и количественной оценки транскрипции методами RT-PCR и Q-PCR соответственно.
Чтобы упростить процедуру приготовления контрольных проб мы будем использовать интрон-фланкирующие
праймеры, которые не срабатывают на геномной ДНК из-за малого времени синтеза в реакции PCR. Подбор праймеров
будет осуществляться в утилите NCBI-Primer Tool и в программе PerlPrimer v.1.1.21.
Для постановки проверочной RT-PCR будет использована кДНК из ооцитов и контрольная кДНК из ювенильных червей.
Фермент – Hot start DreamTaq DNA Polymerase (TF Scientific) уже приобретён и апробирован. Теоретическая
температура отжига праймеров для каждого гена будет подобрана при помощи утилиты Tm Calculator (TF Scientific) и
затем скорректирована эмпирически.
Q-PCR
К концу первого года работы над проектом мы выясним, какие из генов имеют материнские транскрипты и
перспективны для количественного анализа. Дальнейшее исследование материнских РНК этих генов будет
проводиться при помощи рутинной Q-PCR, с использованием неспецифического интеркалирующего красителя SYBR
Green I. Это недорогой и достаточно надёжный метод подходит для количественной оценки транскрипции большинства
генов. Все необходимые реактивы для стандартной Q-PCR закуплены. Гены с антисмысловой транскрипцией будут
анализироваться с применением специфических внутренних зондов (FAM - BHQ1; ROX - BHQ-2), поскольку SYBR Green
I не позволяет различить транскрипты, считываемые с разных нитей ДНК одного и того же гена.
Клонирование, синтез зондов и in situ-гибридизация
Гены, с которых считывается большое количество материнских РНК, будут клонированы. Мы амплифицируем
фрагменты белок-кодирующих областей генов интереса (800-1000 bp), лигируем их в вектор pGEM-T Easy (Promega) и
трансформируем штамм E. coli Jm109. Это позволит синтезировать РНК-Dig-пробы для гибридизации in situ.
Гибридизация in situ – рутинный метод в нашей лаборатории и он адаптирован для работы с ооцитами (Maslakov et al.,
2021).
К середине второго года работы над проектом мы получим данные о репертуаре материнских генов, узнаем
количественные характеристики их транскрипции и увидим пространственное распределение этих транскриптов в
ооцитах и ранних эмбрионах. Оставшееся время мы посвятим подготовке публикаций по проекту.
Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (указываются основные ранее полученные результаты (за последние 3 года), связанные непосредственно с темой НИОКТР, которые могут быть использованы для достижения цели.
Научный коллектив имеет опыт совместной работы над близким, но менее масштабным проектом, который завершился
публикацией (Maslakov GP, Kulishkin NS, Surkova AA, Kulakova MA. Maternal Transcripts of Hox Genes Are Found in Oocytes
of Platynereis dumerilii (Annelida, Nereididae). J Dev Biol. 2021 Sep 4;9(3):37. doi: 10.3390/jdb9030037).
Мы обнаружили и описали на уровне RT-PCR и in situ-гибридизации материнские РНК почти всех Hox-генов Platynereis.
Кроме того, мы установили, что многие из них сплайсируются каноническим образом и потенциально могут
транслироваться. Для нескольких генов найдены антисмысловые РНК.
У самого младшего члена научного коллектива (Потапова Софья, второй курс бакалавриата) есть опыт участия в
конференции с постерным докладом на тему: «Ретиноевый сигналинг у личинки и ювенильного червя Platynereis
dumerilii различается на уровне ядерных рецепторов» (https://www.vij.ru/images/conf-22/Pushchino/programm.pdf).
Софья самостоятельно клонировала два гена из ретиноевого сигнального пути, проанализировала их транскрипцию
методом in situ-гибридизации и выявила материнский транскрипт гена Pdum-Cyp26.
Все члены коллектива владеют рутинными методами молекулярной биологии (выделение нуклеиновых кислот, PCR, RTPCR, in situ-гибридизация).
