Целью проекта является выявление мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Abeta42 (связанного с болезнью Альцгеймера), и изучение механизма их эффектов.
Учитывая динамику роста болезни Альцгеймера в мире (по прогнозам Всемирного общества болезни Альцгеймера к 2030 г. ожидается более 150 млн. больных) если в ближайшее время не будут разработаны методы лечения болезни Альцгеймера, уже в следующем поколении она может выйти на первое место как главная причина смертности в человеческих популяциях. Решение проблемы болезни Альцгеймера является ключевым пунктом в общей проблеме обеспечения нормального функционирования человеческого общества в условиях увеличения продолжительности жизни и общего старения человеческой популяции.
В Задачи проекта входит:
1. Получить данные о мутациях в пептиде Abeta42, снижающих или усиливающих нуклеацию амилоида в дрожжевой модели.
2. Провести анализ эффектов выявленных мутаций на структуру амилоида в соответствии со структурными моделями для Abeta42 и предсказаниями существующих компьютерных алгоритмов.
3. Получить данные об агрегации мутантных вариантов Abeta42 с использованием цитологических и биохимических методов
4. Получить данные о взаимодействии и взаимных эффектах различных мутаций в Абета42.
5. Исследовать эффекты, выявленные в дрожжах мутаций Abeta42, in vitro и на модели клеток человека.
6. Исследование эффектов взаимодействия и взаимного влияния различных мутаций в Abeta42.
7. Определить последовательности пептидов, потенциально блокирующих нуклеацию амилоида Abeta42.
Для поиска мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Abeta42 человека, в проекте будет применена разработанная руководителем проекта Ю.О. Черновым и его коллегами оригинальная дрожжевая тест-система для выявления амилоидогенных свойств белков млекопитающих (Chandramowlishwaran et al., 2018).
Для конструирования библиотеки челночных плазмид с конструкцией SUP35N-Abeta42, содержащих мутагенизированные варианты Abeta42 будет проведён мутагенез методом ПЦР.
Мутантные варианты Abeta42, выявленные при скрининге в дрожжевой тест-системе, в дальнейшем будут проверены биохимическим анализом (с использованием метода полуденатурирующего агарозного гель электрофореза, SDD-AGE, см. Kryndushkin et al., 2003) и цитологическим анализом с использованием флуоресцентной микроскопии и конструкций, содержащих пептид Abeta, слитый с флуорофором YFP или CFP (амилоидная агрегация таких конструкций в клетках дрожжей была продемонстрирована нами ранее, см. Rubel et al., 2013). Для того чтобы исключить эффекты, специфичные только для клеток дрожжей, наиболее перспективные мутации, выявленные в фенотипическом скрининге в дрожжах, будут проверены в культуре клеток нейробластомы человека. Для этого будут получены генетические конструкции, в которых последовательность, кодирующая мутантный вариант Abeta42 будет слита с белками YFP/CFP.
Позиции идентифицированных мутаций будут сопоставлены со структурными моделями Abeta42 (например, Walti et al., 2016). Будет также проведён анализ потенциальных эффектов мутаций на амилоидогенез с использованием компьютерных алгоритмов, таких как ArchCandy, Aggrescan, AmylPred, Waltz (см. обзор Wilson et al., 2018 ).
Амилоидные фибриллы Abeta42 представляют собой кросс-бета полимеры нековалентного димера (Walti et al., 2016). Мутации, влияющие на процесс амилоидизации Abeta42, могут действовать на разные этапы в формировании амилоида: а) возникновение нековалентного димера; б) формирование кросс-бета структур; в) стабильность кросс-бета олигомера; г) иммобилизацию новых молекул и рост олигомера в амилоидную фибриллу. Возникающие в результате продукты будут выявлены с помощью анализа мутантных конструкций in vivo. Физическое взаимодействие между мутантными пептидами Abeta (а также между мутантным пептидом и пептидом дикого типа) будет исследовано с помощью метода FRET (Forster resonance energy transfer) (для конструкций, содержащих разные флуорофоры). Применимость этого подхода к анализу взаимодействий между амилоидами (включая Abeta) в клетках дрожжей была продемонстрирована нами ранее (Rubel et al., 2013). В случае, если наш анализ выявит новые мутации, эффекты которых не объясняются существующими структурными моделями, детальная характеристика эффекта этих мутаций на структуру амилоида может быть проведена с использованием методов ЯМР и крио-электронной микроскопии. Ресурсные центры СПбГУ располагают инфраструктурой и всем необходимым для проведения таких исследований оборудованием.
В числе полученных мутантных вариантов Abeta со сниженной нуклеацией амилоида мы рассчитываем получить варианты с доминантным эффектом, которые будут блокировать амилоидизацию пептида Abeta дикого типа. Это возможно в ситуации, когда мутантный пептид способен образовать димер с пептидом дикого типа, или включаться в состав кросс-бета олигомера, но при этом блокирует присоединение новых молекул пептида Abeta через кросс-бета связи. Возможно также дальнейшее усиление свойств антиамилоидных пептидов с помощью конструкции укороченных и-или модифицированных вариантов, которые будут проверены в описанных выше экспериментальных системах. Доминантные амилоидные пептиды представляют наибольший интерес для наших исследований, поскольку в потенциале, они могут быть использованы в терапевтических целях. Abeta способен проходить гематоэнцефалический барьер, поэтому ввод мутантных пептидов в организм возможен как путём инъекций, так и с использованием экспрессионных конструкций (генотерапии).
Болезнь Альцгеймера (БА) – одна из наиболее распространённых форм деменции, возникающая, как правило, у людей старшего возраста, характеризующаяся необратимым ухудшением когнитивных и физических функций. На данный момент, БА неизлечима обычно развивается на протяжении целого ряда лет и лишает пациента способности существовать самостоятельно, что приводит к колоссальным расходам на уход за пациентами. БА поражает, по разным расчётам, от 5 до 13% людей в возрасте старше 65 лет, и более 30% - в возрасте 85 лет и старше. Одним из ключевых факторов развития этого заболевания является патологическое накопление и агрегация в головном мозге амилоидного пептида бета (Aβ), приводящие к дисфункции синапсов и к гибели нейронов. В настоящее время нет ни достаточно чёткого понимания механизмов агрегации Aβ, ни данных о структуре формируемых in vivo амилоидных агрегатов пептида Aβ. В этой связи, важна информация о роли аминокислотных остатков в организации амилоидной структуры пептида Aβ и о мутациях, которые влияют на его агрегацию in vivo. Целью проекта является выявление мутаций, влияющих на амилоидогенез пептида Aβ42, и изучение механизма их эффектов. Для поиска мутаций, приводящих к изменениям агрегации пептида Aβ, была использована разработанная под руководством Ю.О. Чернова новая экспериментальная тест-система для фенотипической детекции агрегации амилоидов в дрожжах. В предложенной тест-системе последовательность, кодирующую исследуемый белок, сливают с репортерной последовательностью Sup35N и анализируют эффекты в специальных штаммах дрожжей, содержащих нонсенс-мутацию Ade1-14. Агрегацию белка в исследуемых штаммах выявляют по росту дрожжей на селективной среде. В ходе проекта, с помощью случайного ПЦР-мутагенеза была получена библиотека плазмидных ДНК, кодирующих мутантные последовательности пептида Aβ42, слитые с репортерной последовательностью Sup35N, пригодная для экспрессии в дрожжах. Последовательности SUP35N-Aβ42 в полученной библиотеке находятся под контролем регулируемого, индуцибельного промотора гена CUP1. Высокое качество библиотеки было подтверждено выборочным секвенированием плазмид, выделенных из отдельных бактериальных клонов.
Проведён массовый скрининг библиотеки плазмидных ДНК в дрожжевой тест-системе, и отобрано 463 дрожжевых трансформанта, в которых выявлены фенотипические изменения. Из каждого варианта была выделена плазмидная ДНК и проведено секвенирование. По результатам анализа выявлены мутации в пептиде Aβ42, которые блокируют или ослабляют его агрегацию, а также мутации, усиливающие агрегацию Aβ в дрожжевой модели. Среди мутаций обнаружены замены аминокислот в позициях, роль которых в формировании кросс-бета структуры была известна на основании исследований in vitro, а также клинических данных, а также мутации в позициях, эффект которых на структуру амилоидных фибрилл ранее не был известен. Эффекты мутаций на агрегацию пептида Aβ в дрожжах были подтверждены при использовании генно-инженерных конструкций, в которых разные варианты пептида Aβ слиты с зелёным флуоресцирующим белком (GFP). Кроме того, для отдельных мутаций эффекты на агрегацию Aβ были подтверждены in vitro и при анализе в культурах клеток человека, продуцирующих мутантные варианты Aβ слитые с GFP. Одним из значимых результатов работы является то, что только множественные мутации (замены не менее двух аминокислот), могли полностью элиминировать агрегацию Aβ, тогда как одиночные мутации лишь снижали эффективность агрегации и увеличивали время необходимое для агрегации пептида Aβ.
Используя дрожжевую тест-систему, были проанализированы эффекты взаимодействия и взаимного влияния разных аллельных вариантов пептида Aβ42. Показано, что варианты Aβ42 несущие мутации, препятствующие его агрегации, могут также негативно влиять на эффективность агрегации Aβ42 дикого типа. Используя биоинформатические алгоритмы, а также данные о мутациях, блокирующих агрегацию Aβ полученные в работе, были смоделированы короткие пептиды на основе Aβ, которые могут взаимодействовать с полноразмерным Aβ, препятствуя его агрегации, при этом сами не будут формировать амилоидные структуры. В дальнейшем планируется синтезировать такие пептиды и исследовать их влияние на агрегацию Aβ, в клеточных моделях и мышах, моделирующих болезнь Альцгеймера. Мы полагаем, что в случае успеха, на основе пептидов можно получить лекарственные препараты, направленные на лечение и профилактику БА.
В ходе выполнения НИР получены следующие научные результаты:
с помощью дрожжевой тест-системы выявлены мутации в пептиде Aβ42 влияющие на его агрегацию. Эффекты выявленных мутаций были исследованы как in vitro, так и in vivo в дрожжевой модели и культуре клеток человека HEK293T. Получены данные об агрегации мутантных вариантов Aβ42 с использованием цитологических и биохимических методов. Исследованы эффекты ко-продукции мутантных вариантов Aβ в дрожжевой модели. Выявлены мутантные варианты Aβ42, оказывающие негативное влияние при совместной продукции на агрегацию пептида Aβ42 дикого типа. In silico определены последовательности пептидов, потенциально блокирующих агрегацию пептида Aβ42, не формирующие при этом амилоидных структур.
| Acronym | RFBR_Sirius_2019 - 2 |
|---|
| Status | Finished |
|---|
| Effective start/end date | 30/11/20 → 28/10/21 |
|---|
