В связи с увеличением продолжительности жизни человека резко возросло значение нейродегенеративных заболеваний, наблюдающихся преимущественно у людей пожилого возраста, таких как болезнь Альцгеймера (БА), поражающая 5% людей в возрасте старше 65 лет и являющаяся одной из основных причин старческой деменции. БА, связанная с образованием агрегатов бета-амилоида, неизлечима, смертельна и приводит к колоссальным экономическим потерям из-за необходимости ухода за пациентами. Решение проблемы ранней диагностики и успешной терапии БА является ключевым пунктом в общей проблеме обеспечения нормального функционирования человеческого общества в условиях увеличения продолжительности жизни и общего старения человеческой популяции. Для разработки диагностических тест-систем и поиска терапевтических подходов целесообразно использование модельных животных, у которых развитие БА происходит в короткие сроки. В частности, широко применяются трансгенные мышиные модели, несущие мутатные человеческие гены предшественника бета-амилоида и пресенилина.
В настоящее время выдвигаются новые гипотезы мультифакторного патогенеза БА, согласно которым нарушение регуляции ионов Ca2+ может быть одним из ключевых патологических факторов (Zhong et al, 2021). При развитии БА наблюдается гиперактивность рецепторов NMDA, который является основным медиатором поступления ионов Ca2+. Так как GluN3A является ингибирующей субъединицей рецепторов NMDA, было выдвинуто предположение, что GluN3A имеет решающее значение для устойчивого гомеостаза Ca2+, и его дефицит является патогенным для БА (Murillo et al, 2021).
Другим фактором патогенеза при развитии БА может быть концентрация оксида азота (II) (NO), который является важным медиатором различных процессов в организме: от передачи нервного импульса до защиты от патогенов (Moncada and Higgs 1993). Основной функцией NO в организме является индукция расслабления гладкой мускулатуры сосудов (Palmer, Ferrige, and Moncada 1987). Изменения в синтезе NO играют весомую роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний, диабета, рака и ряда других заболеваний (Suschek et al. 2022). За синтез эндогенного NO из L-аргинина отвечает фермент синтаза оксида азота, у человека представленная тремя генами Nos: Nos1, Nos2, Nos3. Ген Nos3 (также называемый eNOS) – основной ген синтазы оксида азота, конститутивно экспрессируемый клетками эндотелия (Moncada and Higgs 1993). Белок NOS3 является консервативным среди млекопитающих: аминокислотная последовательность белка Nos3 совпадает на 94% у человека, коровы, свиньи и мыши (Li, Wallerath, and Förstermann 2002), что позволяет использовать мышей в качестве модельного объекта для исследования заболеваний, связанных с нарушением активности белка NOS3. Нокаутирование гена NOS3 вызывает повышение кровяного давления, а также снижение частоты сердечных сокращений (Shesely et al. 1996; Leo et al. 2021). Мышей с нокаутом гена NOS3 используют при изучении кардиомиопатии, болезней почек и преэклампсии. Было показано, что частичная инактивация гена NOS3 приводит к повышению вероятности возникновения спонтанного ишемического инсульта и амилоидной ангиопатии у мышей в возрасте 3-6 месяцев (Tan et al. 2015). Был проведен ряд исследований по оценке влияния нокаута гена NOS3 на протекание и развитие болезни Альцгеймера на мышиных моделях (Austin, Santhanam, and Katusic 2010; Austin et al. 2013; Austin and Katusic 2020; 2016; Ahmed et al. 2022).
Дисфункция Nos3 в эндотелии мозга вызывает опосредованное изменением NO/cGMP-сигналлинга нарушение нормального сплайсинга мРНК предшественника бета-амилоида (APP), приводя к увеличению концентрации амилоидогенного пептида Abeta (Austin, Santhanam, and Katusic 2010; Austin, d’Uscio, and Katusic 2013). В 2016 году было показано, что у мышей, несущих так называемую шведскую мутацию в гене APP и делецию участка гена пресенелина 1 (мыши APP/PS1), нокаутирование гена NOS3 уже на 4-5 месяце жизни приводило к повышению активности циклин-зависимой киназы Cdk5 и повышению фосфорилирования тау-белка по сравнению с мышами с геном NOS3 дикого типа, что указывает на то, что факторы кардиоваскулярного риска (в частности, эндотелиальная дисфункция, индуцированная инактивацией Nos3) могут негативно влиять на патогенез болезни Альцгеймера (Austin and Katusic 2016). При частичном нокаутировании NOS3 у мышей APP/PS1 наблюдались когнитивные нарушения, повышение накопления амилоида бета в агрегатах в мозге, а также повышенная активация клеток микроглии и сниженная активность инсулин-деградирующего фермента (Ahmed et al. 2022).
В приведенных работах были использованы мыши, нокаут гена Nos3 в которых был получен с помощью методик предыдущего поколения, приводящих к наличию в геноме вставок неомициновой кассеты длиной 1,2 т.п.н. Наличие данной кассеты в геноме может оказать влияние на чистоту экспериментов по комплексному анализу биохимических процессов в организме мышей. Наша методика позволяет направленно получить нокаут по гену NOS3 без внесения лишних конструкций в геном. В дальнейшем полученная модель может быть использована для разработки подходов генной терапии при помощи вирусных конструкций, обеспечивающих локальную экспрессию NOS3.
Мы предполагаем создание мышиных моделей, нокаутных по генам GluN3A и NOS3, соответственно, с тканеспецифичной продукцией гибридного белка Вольтрон (Voltron) (Abdelfattah et al, 2019). Полученные нами модели будут использованы в экспериментах по изучению нейрональной активности у мышиных моделей болезни Альцгеймера. В дальнейшем полученные модели могут быть использованы для разработки подходов генной терапии при помощи вирусных конструкций, обеспечивающих локальную экспрессию GluN3A, связанной с дефектом быстрых потенциал-зависимых кальцевых каналов, и/или локальную экспрессию NOS3.
Крио-консервация спермы и эмбрионов важна для сохранения ценных ресурсов генетически модифицированных мышей. На сегодняшний день более 60 000 линий мышей были заморожены в криохранилищах по всему миру. Крио-консервация эмбрионов мышей осуществляется с помощью контролируемого замораживания и предусматривает их длительное хранение при очень низких температурах (-196оС). Для того, чтобы клетки выжили в условиях замораживания, необходимо чтобы образование кристаллов льда было контролируемым и инициировалось во внеклеточном пространстве, но при этом структура клеток сохранялась. В замороженном состоянии эмбрионы мышей могут храниться несколько десятков лет. Как правило, для замораживания используют зиготы, двух-клеточные эмбрионы, ооциты и сперму. Этот способ дает возможность не только сохранить любую линию мышей в чистом виде, но и быстро воспроизвести ее после размораживания и имплантации в яйцевод суррогатной матери (Thorat et al., 2012). Более того, этот способ упрощает транспортировку животных из одного вивария в другой. В случае необходимости в размороженные зиготы можно вводить любые конструкции для модификации генома, включая CRISPR/Cas9. В рамках данного проекта мы планируем создание биоколлекции криоконсервированных эмбрионов и спермы созданных нами мышиных моделей.
Технология направленного редактирования генома эукариотических организмов CRISPR/Сas, позволяет не только вносить мутации в геном, но и поставить получение нокаутных животных на поток. Принципиальным моментом является подтверждение «удачности» прохождения направленной мутации в целевом гене. Однако, детекция небольших CRISPR/Cas9- индуцированных мутаций с помощью ПЦР затруднена, что вынуждает проводить многочисленные секвенирования полученных образцов ДНК. При этом необходимо принимать во внимание мозаицизм полученных мышей и потенциальные нецелевые мутации в геноме, которые возникают при использовании системы CRISP/Cas9. Для решения этой проблемы требуется разработать новый метод экспресс-генотипирования генномодифицированных животных с помощью Cas нуклеаз. Нуклеаза Cas12a, управляемая РНК, образует комплекс с РНК CRISPR (crRNA) для расщепления двухцепочечной ДНК-мишени. Мы исследовали новый TTAA PAM для нуклеазы LbCas12a и обнаружили, что специфичность расщепления увеличивается. Высокая специфичность позволяет типировать одиночные нуклеотидные замены и небольшие делеции/инсерции (1-2 нуклеотида) в гетерозиготе и искать целевые мутации при нокауте (Misiurina MA et al, 2022). Эта система может быть успешно использована для экспресс-генотипирования полученных нами мышей, нокаутных по генам Grin3A и NOS3.
Описание задач, предлагаемых к решению
Раскрывается содержание научных и научно-технических задач
В рамках данного проекта мы предполагаем создание мышиной модели , нокаутной по гену NOS3, с тканеспецифичной продукцией гибридного белка Вольтрон (Voltron) (Abdelfattah et al, 2019). Полученная нами модель будет использована в экспериментах по изучению нейрональной активности у мышиных моделей болезни Альцгеймера. В дальнейшем полученная модель может быть использована для разработки подходов генной терапии при помощи вирусных конструкций, обеспечивающих локальную экспрессию NOS3. В рамках данного проекта также планируется создание тест системы для экспресс-генотипирования мышей, нокаутных по гену NOS3, с использованием нуклеазы LbCas12a.
В рамках данного проекта мы также планируем создание биоколлекции криоконсервированных эмбрионов и спермы созданных нами мышиных моделей.
Для достижения этой цели планируется:
● Создание новой линии мышей, гомозиготных по нокауту гена NOS3 c измененным NO/cGMP-сигналлингом и нарушенным сплайсингом мРНК предшественника бета-амилоида.
● Создание новой мышиной модели болезни Альцгеймера, с помощью CRISPR/Cas направленного введения трансгена, который кодирует гибридный белок Voltron, в локус Rosa26 эмбрионов мышей, с одновременным отключением гена NOS3
● Разработка и валидация системы быстрого генотипирования мышей, нокаутных по гену NOS3, на основе нуклеазы LbCas12а
● Создание биоколлекции криоконсервированных эмбрионов и спермы, созданных нами генетически модифицированных мышей: мышиной модели с тканеспецифичной продукцией индикатора мембранного потенциала - гибридного белка Вольтрон (Voltron) (Abdelfattah et al, 2019) в локусе ROSA26, линии мышей с нокаутом генов Glun3A, NOS3, а также мышиных моделей, нокаутных по гену GluN3A и NOS3, соответственно, с тканеспецифичной продукцией гибридного белка Вольтрон (Voltron).
