Проект направлен на разработку и изучение свойств новой системы доставки полимиксинов на основе гибридных наночастиц, состоящих из наночастиц серебра (ядро), покрытых отрицательно заряженной поли(глутаминовой кислотой) (оболочка). Данные разработки помогут снизить побочные эффекты полимиксинов, а также могут стать основой для комбинированной терапии, сочетающей в себе антимикробный эффект серебряного ядра с антибактериальным воздействием антибиотика.
Химическая часть проекта выполнялась в Институте химии Санкт-Петербургского государственного университета, в ходе которой нужно было получить и охарактеризовать гибридные наночастицы (гидродинамический диаметр, распределение по размерам, ζ-потенциал), а также изучить процесс инкапсулирования полимиксинов в них.
В свою очередь биологическая часть исследований, которая поможет определить перспективы применения гибридных наночастиц с позиции дальнейшего медицинского применения, проводилась в сотрудничестве с Ганноверским университетом имени Лейбница (Германия) в рамках проекта G-RISC. Для выполнения были запланированы следующие эксперименты:
Изучение цитотоксичности разработанной гибридной системы доставки на клеточных линиях печени и почек как в случае пустых наночастиц, так и инкапсулированных форм. И сравнение полученных результатов с данными по цитотоксичности для свободных полимиксинов.
Изучение кинетики поглощения макрофагами наночастиц трех типов: гибридных, полиаминокислотных и серебряных, стабилизированных цистеином. И сравнение результатов между собой для оценки влияния присутствия серебра в полученной системе.
Химические эксперименты, выполненные в Институте химии СПБГУ:
Разработана методика получения гибридных частиц, состоящих из наночастиц серебра (ядро), покрытых отрицательно заряженной поли(глутаминовой кислотой) (оболочка), которая включает в себя 5 стадий. Полученные системы были охарактеризованы методами динамического и электрофоретического рассеяния света. Результаты показали, что частицы имеют гидродинамические диаметры в диапазоне от 150 до 1200 нм в зависимости от используемой среды для анализа. При этом ζ-потенциал гибридных частиц был отрицательный, что было хорошо для дальнейших экспериментов с полимиксинами.
Проведено инкапсулирование полимиксинов в гибридные частицы и определены основные параметры, характеризующие процесс, методом ВЭЖХ-анализа. Показано, что в случае полимиксина В эффективность инкапсулирования в исследуемом диапазоне падала от 100 до 75%, в свою очередь полимиксин Е демонстрировал практически 100% эффективность в том же диапазоне. Наблюдаемые различие в эффективности можно объяснить более высокой гидрофобностью полимиксина В, что снижает взаимодействие с наночастицами.
Биологические эксперименты, выполненные в университете Лейбница (Ганновер, Германия):
Проведена оценка цитотоксичности образцов in vitro на клеточных линиях Hep-G2 и HEK 293. Для линии Hep-G2 установлено, что ярко выраженный токсический эффект начал проявляться при концентрации 250 мкг/мл для всех исследованных образцов. При этом при уменьшении концентрации наблюдалась значительная положительная динамика выживаемости клеток в случае пустых частиц и инкапсулированных форм. В свою очередь, для полимиксинов динамики практически не было. Для HEK 293 оценку выживаемости клеток в присутствии наночастиц следует повторить, поскольку полученные результаты выглядят ненадежными.
Изучена кинетика поглощения наночастиц макрофагами с помощью проточной цитометрии. Для этого частицы предварительно модифицировали флуоресцентной меткой Cy-5. Результаты показали, что наименьшее поглощение макрофагами наблюдалось для полимерных наночастиц p(D-Phe-co-L-Glu), используемых в качестве контроля. Введение серебра в частицы привело к увеличению поглощения, что было показано для гибридных наночастиц. Однако по сравнению с наночастицами серебра, стабилизированными цистеином (Ag-Cys), гибридная система продемонстрировала меньшее поглощение макрофагами. Это говорит о том, что покрытие наночастиц серебра полимером оказывает положительное влияние, и полученные гибридные наночастицы можно рассматривать как перспективные системы доставки полимиксина. Процесс поглощения гибридных частиц макрофагами был также дополнительно визуализирован с помощью фотометра-имиджера Cytation 5. Для этого мембраны клеток были окрашены зеленым флуоресцентным красителем.
Таким образом, в рамках проекта G-RISC были синтезированы и охарактеризованы гибридные наночастицы, состоящие из наночастиц серебра (ядро), покрытых отрицательно заряженной поли(глутаминовой кислотой) (оболочка) . Проведено инкапсулирование полимиксинов и изучены особенности данного процесса. А биологические эксперименты, сделанные совместно с Ганноверским университетом, продемонстрировали, что полученная система доставки полимиксинов является многообещающей для медицинского применения.
