Научная проблема, на решение которой направлен проект: Механика устьичных движений.

Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы: Устьичные комплексы – структурные элементы эпидермы растений. Каждый комплекс включает в свой состав пару замыкающих клеток, составляющих устьице, и примыкающие к ним околоустьичные клетки (побочные или соседние клетки). Замыкающие клетки способны к обратимым деформациям, в результате которых между ними открывается и закрывается сквозное отверстие – устьичная апертура, или устьичная пора. Через нее осуществляется транспирация и эффективный газообмен внутренних тканей с атмосферой. От работы устьиц зависят фотосинтез и оводнённость тканей растений. Данный факт определяет актуальность выявления всей совокупности факторов, включая структурные особенности клеток устьичного комплекса, влияющих на скорость и величину деформаций замыкающих клеток при изменении в них тургорного давления. Говоря о научной значимости проекта, необходимо отметить два момента, Во-первых, будет рассмотрено поведение не изолированных замыкающих клеток, а замыкающих клеток в составе устьичных комплексов. Во-вторых, будет оценено влияние на устьичные движения конкретных структурных особенностей околоустьичных клеток, вопрос о роли которых в устьичной механике остается открытым.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб: Оценить на основе данных компьютерного моделирования влияние геометрии околоустьичных клеток на устьичные движения. Под геометрией околоустьичных клеток мы понимаем их форму, неравномерное утолщение стенок, наличие выростов на наружных тангентальных стенках, а также изменение объема этих клеток при устьичных движениях. Отмеченные особенности околоустьичных клеток свойственны значительному числу цветковых растений. По этой причине полученные в ходе исследования результаты будут носить достаточно общий характер и смогут быть экстраполированы на разные объекты. Исследование будет носить комплексный характер. В него будут вовлечены растения разного систематического положения; использованы различные гистологические и цитологические методы, а также компьютерное моделирование; рассмотрено поведение совокупности клеток структурно-функционального комплекса; оценено влияние на это поведение различных структурных особенностей клеток.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов: При изучении устьичных движений, в том числе методом моделирования, исключительное внимание уделяется замыкающим клеткам. Новизна данного исследования состоит в том, что в нем в равной степени будет учтено строение не только замыкающих, но и околоустьичных клеток. Это позволит понять вклад последних в работу устьичного комплекса. Данный подход является новым не только для нашего коллектива, но и вообще для работ, посвященных устьичной механике. Сам факт влияния околоустьичных клеток на устьичные движения не вызывает сомнений. Вопрос заключается в выяснении характера этого влияния и его зависимости от строения побочных клеток. Решить его можно с помощью моделирования. Наш коллектив располагает опытом построения моделей, демонстрирующих деформацию клеток при изменении в них тургорного давления, о чем свидетельствует серия выполненных нами публикаций (Pautov et al., 2019, 2021). В случае удачного решения поставленных задач, в дальнейшем планируется построение моделей локальных участков листа, включающих не только клетки устьичных комплексов, но также основные клетки эпидермы и подстилающие их клетки мезофилла.

Современное состояние исследований по данной проблеме: Поскольку устьица несут крайне важную функциональную нагрузку, им посвящено большое число работ. По мнению некоторых исследователей очень немногие приспособления были столь же важны для эволюции растений, как устьица (Gray, Facette, 2020). Согласно существующим представлениям, устьичные движения зависят от множества факторов, в том числе от формы замыкающих клеток, неравномерного утолщения их стенок, механических свойств этих стенок, отражающих их молекулярное строение, степени развития устьичных выступов и колец, взаимодействия замыкающих и околоустьичных клеток и др. (Sharpe, Wu, Spencer, 1987; Woolfenden et al., 2017; Yi et al., 2018, 2019; Pautov et al., 2017,2019, ). Взаимодействие замыкающих и околоустьичных клеток рассмотрено в нескольких работах. Согласно классической точке зрения, околоустьичные клетки имеют механическое преимущество над замыкающими клетками (De Michele, Sharpe, 1973; Edwards et al., 1976; Mac Robbie, 1980). Это явление известно также как «антогонистические отношения» (Cooke et al., 1976). Тургорное давление в замыкающих клетках должно вырасти до определенного уровня по сравнению c давлением в околоустьичных клетках перед тем, как устьичная пора начнет открываться (Willmer, Fricker, 1996). Позднее эта точка зрения была дополнена новой информацией. По мнению P.J. Franks и G.D. Farquhar (2007) существуют механизмы, обеспечивающие согласованное функционирование замыкающих и околоустьичных клеток. Иными словами, функционируют не отдельные устьица, а устьица в совокупности с околоустьичными клетками. Одновременно с переносом осмотиков, прежде всего ионов калия, в замыкающие клетки и одновременным увеличением в них тургорного давления происходит снижение тургорного давления в побочных клетках (Franks & Farquhar, 2007). Этот механизм уменьшает механическое преимущество околоустьичных клеток, которое могло бы резко ограничить возможность для открывания устьиц во влажных условиях. Кроме того, он увеличивает скорость открывания устьиц. Необходимо, однако, отметить, что взаимодействия околоустьичных и замыкающих клеток, сама механика устьичных движений могут сильно отличаться у высших споровых, голосеменных и покрытосеменных растений (Franks & Farquhar, 2007; Brodribb, Mc Adams, 2011).
Существенный интерес представляют данные о наличии структурных особенностей у околоустьичных клеток. Они не многочисленны, но достаточно показательны. Известно, что замыкающие клетки симпластически изолированы. Между околоустьичными и остновными клетками эпидермы, а также между ними и клетками мезофилла симпластические связи существуют. При этом наибольшее число плазмодесм обнаруживается именно между околоустьичными клетками (Fitzgibbon et al., 2013; Паутов и др., 2019). Кроме прочего, это может способствовать быстрому выравниванию давления в совокупности примыкающих к устьицу клеток.
Далее, согласно наиболее распространенной версии, если околоустьичные клетки отличаются от основных клеток эпидермы, то эти различия ограничиваются размером и формой этих клеток. В действительности различия между ними могут затрагивать внутреннее строение клеток. Например, долгое время считалось, что в клетках эпидермы листьев в отличии от клеток мезофилла, отсутствуют крупные липидные капли. Вопреки этим представлениям установлено, что такие капли образуются в околоустьичных клетках ряда растений. Более того, они могут заполнять практически всю полость клетки (Pautov et al., 2018). Известно, что значительные потери воды имеют место с внутреннх поверхностей побочных клеток, обращенных к подустьичным полостям. Заполнение клеток липидами снижает вероятность гидропассивных движений.
Выявлены некоторые особенности строения стенок околоустьичных клеток ряда растений. Так, согласно гистохимическим данным, полученным K.Gallagher, L.G. Smith (2000), стенки побочных клеток у кукурузы характеризуются повышенным содержанием пектинов, что, предположительно свидетельствует об их большей эластичности (Gray, Lin, Facette, 2020). Предполагается специфическое, отличное от других клеток эпидермы, расположение в их стенках микрофибрилл целлюлозы, по сути параллельное дорсальным стенкам замыкающих клеток (Shtein et al., 2017). Легкость вдавливания замыкающих клеток в побочные зависит не только от тургорного давления в последних, но и от механических характеристик их стенок.
Приведенные примеры указывают на то, что в процессе эволюции не только замыкающие, но и околоустьичные клетки приобретали целую серию особенностей, влияющих на состояние и работу устьиц. К их числу могут быть отнесены, по аналогии с замыкающими клетками, специфическая геометрия побочных клеток, их способность к существенному изменению размера и формы. Удобный объект для изучения влияния геометрии стенок побочных клеток на устьичные движения – устьичные комплексы с перистоматическими кольцами. Эти кольца окружают устьица. Они образованы наружными тангентальными стенками околоустьичных клеток. Существует большое количество работ, в которых упоминаются перистоматические кольца. Их используют в качестве диагностических признаков, в том числе и в палеоботанике (Wilkinson, 1979; Баранова, Остроумова, 1987). Эти структуры неоднократно возникали в эволюции растений, что позволяет предполагать, что им принадлежит какая-то функциональная нагрузка. Есть основания предполагать, что эта нагрузка напрямую связана с влиянием околоустьичных клеток на устьичные движения. Дело в том, что сходные по своей морфологии с перистоматическими кольцами, так называемые устьичные кольца, расположенные на замыкающих клетках, имеют прямое отношение к устьичной механике. Они, совместно с наружными устьичными выступами, влияют на деформацию замыкающих клеток, ширину и положение относительно поверхности эпидермы открытой устьичной щели (Pautov et al, 2017, 2019, 2021).
Как было отмечено выше, при изучении устьичной механики основное внимание уделяется замыкающим клеткам. Чаще всего анализируется поведение изолированных устьиц. При проведении моделирования присутствие устьичных
околоустьичных клеток в лучшем случае имитируется приложением внешнего давления к деформирующимся стенкам замыкающих клеток (см, например, Woolfenden et al., 2017). Не удивительно, что за последние десятилетия достигнуто по мнению A. Gray с коллегами (2020) мало прогресса в отношении понимания роли околоустьичных клеток. Однако, как отмечают эти авторы, современные активные исследования, выполненные на модельных системах, будут способствовать решению данной проблемы. Подобные установки однозначно указывают на то, что в ближайшие годы будут активизированы исследования в данной области.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта: Для получения фактических данных по строению устьичных комплексов и геометрии входящих в их состав замыкающих и побочных клеток будут использованы традиционные гистологические и цитологические методы с применением микроскопов разного разрешения – светового, сканирующего (СЭМ), просвечивающего трансмиссионного (ТЭМ), конфокального, а также гистохимические методы, направленные на определение компонентов клеточных стенок. Для выполнения этой части работы будут привлечены многократно апробированные методики фиксации материала (Karnovsky, 1965), его проводки и заключения в смесь эпона с аралдитом (Mollenhauer, 1964; Kuo, 2007), изготовления срезов и их окрашивания (Reynolds, 1963) для ТЭМ; фиксации, проводки, сушки, монтировки на столики и напыления золотом для СЭМ (Sargent, 1983; Pathan et al., 2010) и т.д. Для изучения эпидермы на световом уровне, ее фрагменты будут отделены от остальных тканей методом мацерации с помощью смеси Шульца (Kerp, 1990) с последующей окраской.
В ходе изучения влияния геометрии околоустьичных клеток на устьичные движения будет использован метод конечных элементов (Lawrence, 2006; Madenci & Guven, 2006). Данное моделирование подходит как для изучения необратимого формообразования растущих клеток, так и для изучения их обратимых деформаций (Bidhendi & Geitmann, 2018). Моделирование будет проведено в программном комплексе ANSYS (ANSYS v. 13.0).
Шаги моделирования.
А. Построение 3D-моделей. Для их построения будут использованы материалы, полученные в ходе выполнения микроскопических исследований. Ключевой источник информации – серии полутонких срезов, сделанных по всей длине устьичных комплексов. Будут построены следующие модели: 1. Устьичные комплексы, побочные клетки которых имеют перистоматические кольца. 2. Те же самые устьичные комплексы, но без перистоматических колец. 3. Изолированные устьица, к замыкающим клеткам которых приложено внешнее давление. 4. Предварительные исследования показали, что околоустьичные клетки ряда растений способны к существенному изменению размера и формы. Будет измерен диапазон этих изменений и смоделировано их влияние на состояние устьиц (Устьичные комплексы с изменяющимися в размере и форме побочными клетками).
Б. Разбиение объектов, клеток устьичных комплексов, на подобласти, так называемые конечные элементы. Библиотека ANSYS содержит почти 200 типов таких элементов. Их выбор зависит от характера решаемых задач и свойств
моделируемого объекта, в частности, от его геометрии и физических свойств материала. Наш предыдущий опыт показывает целесообразность использования для изучения деформации клеток элементов PLANE42, SOLOD45 и SOLID95.
В. Назначение механических параметров объекта. Значения диапазона тургорного давления в замыкающих и околоустьичных клетках, коэффициента Пуассона и модуля Юнга для клеточных стенок будут взяты из литературных источников (Wiedemann & Neinhuis, 1998; Franks et al., 1998; Wei et al., 2001; Woolfenden et al., 2017).
Г. Оценка результатов моделирования. Будет охарактеризовано поведение замыкающих клеток и околоустьичных клеток в устьичных комплексах с перистоматическими кольцами и без них; в комплексах, побочные клетки которых
претерпевают изменение размера и формы; поведение замыкающих клеток, к стенкам которых приложено внешнее давление, в изолированных устьицах. Характеристика будет включать в себя ширину открытой устьичной поры, ее
положение относительно исходной позиции, когда пора закрыта, изолинии суммарных перемещений стенок замыкающих и околоустьичных клеток.

Общий план работы:
1. Структурная характеристика устьичных комплексов и их клеток у модельных видов.
2. Изготовление серий поперечных срезов устьичных комплексов по всей их длине.
3. Объемная реконструкция устьичных комплексов, учитывающая геометрию и взаимное расположение их клеток, а также морфометрию стенок.
4. Моделирование устьичных движений в реконструированных комплексах.
5. Анатомическая характеристика листьев, обладающих устьичными комплексами, околоустьичные клетки которых несут перистоматические кольца. Их сопоставление с листьями представителей различных климатических зон путем
компонентного анализа.
6. Формулировка выводов относительно влияния структурных особенностей побочных клеток, в том числе перистоматических колец, на устьичные движения.

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту: Работы по изучению устьичной механики путем моделирования с использованием метода конечных элементов задуманы совместно сотрудниками кафедры ботаники биологического факультета и кафедры гидроупругости математико-механического факультета С.-Петербургского университета. Они носят пошаговых характер: от отдельных устьиц к устьичным комплексам и, наконец, к группам клеток, включающим, помимо устьичных комплексов, основные клетки эпидермы и клетки мезофилла. На данном этапе мы переходим к изучению устьичной механики на уровни устьичного комплекса. В проекте будут принимать участие сотрудники и студентка названных выше кафедр. Планируемые к применению в данном проекте методы и программы уже использовались нами ранее и позволили получить искомые результаты о влиянии устьичных выступов и устьичных колец на деформацию замыкающих клеток при изменении в них тургорного давления (Pautov et al., 2017, 2019, 2021). Было установлено, что для замыкающих клеток, лежащих на побочных клетках, характерно гипертрофированное развитие наружных устьичных выступов, а также наличие устьичных колец. Последние могут располагаться как непосредственно на наружных тангентальных стенках замыкающих клеток вокруг наружных устьичных выступов (краевые устьичные кольца), так и на самих выступах, опоясывая их верхушку (кольца выступов). В первом случае кольца образованы складкой кутикулы. Их субкутикулярное пространство заполнено пектиновыми веществами. Во втором – они представляют собой чисто кутикулярные образования. Моделирование методом конечных элементов показало, что эти структуры препятствуют движениям наружных тангентальных стенок замыкающих клеток (их выпиранию над поверхностью листа) и, наоборот, стимулируют движения внутренних тангентальных стенок и погружение открывающейся устьичной поры в эпидерму. Устьичные кольца также препятствуют движениям наружных выступов и расширению отверстия меду ними (апертуры наружных выступов) при открывании устьица. Последний результат может иметь существенное значение. Величина апертуры наружных выступов способна влиять на потери воды через открытое устьице (Poth-Nebelsick et al., 2013). В ходе этих исследований мы отработали методические подходы и программу ANSYS, которые предполагается использовать в данном проекте.
На основе коллекций ботанических садов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН и С.-Петербургского госуниверситета проведено исследование поверхности листьев более 900 видов цветковых растений. Проведенная
работа позволила составить предварительный список объектов исследования. В настоящее время он насчитывает 15 видов, относящихся к 10 семействам.

Публикации:

1. A.A. Pautov, S.M. Bauer, O.V. Ivanova, Y.O. Sapach, E.G. Krylova. Stomatal movementsin laurophyllous plants // AIP Conference Proceedings. USA: American Instituteof Physics, 2018. Vol. 1959. P. 090007. DOI:https://doi.org/10.1063/1.5034746

2. Pautov A., Yakovleva O., Krylova E., Pautova I., Gussarova G.L. Structural changes of large lipid droplets in stomatal complex of Trochodendron aralioides and their possible functional significance // Flora: Morphology, Distribution, Functional Ecology of Plants. 2018. Vol. 242, P. 146-154.https://doi.org/10.1016/j.flora.2018.03.016

3. A.I. Arbicheva, A.A. Pautov. Leaf periderm supports longevity and functionality of crown leaves in Agathis species (Araucariaceae) // Brazilian Journal of Botany.2018. 41, 1, р. 155-165. https://link.springer.com/article/10.1007/s40415-017-0429-5

4. Pautov A.A., Yakovleva O.V., Krylova E.G., Trukhmanova G.R., Pautova I.A. Symplastic connectins of leaf epidermal cells in Trochodendron aralioides (Trochodendraceae) // Botanicheskii Zhurnal, 2019. V. 104(4). P. 617-625. https://elibrary.ru/item.asp?doi=10.1134/S0006813619040070

5. Pautov A., Bauer S., Ivanova O., Krylova E., Yakovleva O., Sapach Yu., Pautova I. Influence of stomatal rings on movements of guard cells // Trees: Structure and Function. 2019. Vol. 33(5). P. 1459 1474. DOI: https://doi.org/10.1007/s00468-019-01873-y

6. PautovA., Bauer S., Ivanova O., Krylova E., Yakovleva O., Sapach Y., Pautova I.Stomatal rings: structure, functions and origin // Botanical Journal of theLinnean Society. 2021. Vol. 195. P. 357–379. DOI: https://doi.org/10.1093/botlinnean/boaa096

Реализованные научно-исследовательские работы по теме НИОКТР:

РФФИ№17-04-01213 А, 2017-2019. Структурно-функциональная организация устьичных комплексов цветковых растений с побочными клетками, идентичными по строению клеткам мезофилла. Руководитель, ответственный исполнитель.

Доклады по тематике исследования на российских и международных научных(научно-практических) семинарах и конференциях:

Паутов А.А., Яковлева О.В., Крылова Е.Г. 2018 / Крупные липидные капли в устьичных комплексах цветковых растений // XIV Съезд Русского ботанического общества и конференция «Ботаника в современном мире», (г. Махачкала, 18-23 июня 2018 г.)  https://www.binran.ru/science/publikatsii/materialy-konferentsiy/sezdy-russkogo-botanicheskogo-obshchestva. Устный доклад

ПаутовА.А., Бауэр С.М., Иванова О.В., Сапач Ю.О., Крылова Е.Г. 2018. / Stomatal Movements in Laurophyllous Plants // Восьмые Поляховские чтения: Международная научная конференция по механике, Санкт-Петербург, 30.01-02.02.2018 г.. https://events.spbu.ru/eventsContent/events/2018/polyakhov/sbornik.pdf. Устный доклад

Pautov A.A., Bauer C.M., Ivanova O.V., Krylova E.G., Yakovleva O.V., Sapach Yu.O., Pautova I.A. 2019. / Influence of stomatal rings on movements of guard cells. //Plant anatomy: traditions and perspectives. Materials of the International Symposium dedicated to the 90th anniversary of Prof. Ludmila Ivanovna Lotova.September 16–22, 2019. Moscow. https://msu-botany.ru/conf-lotova2019. Устный доклад

Паутов А.А., Бауэр С.М., Иванова О.И., Крылова Е.Г., Яковлева О.В., Сапач Ю.О., Паутова И.А. 2020. / Структурные особенности замыкающих и побочных клеток, влияющие на механику устьичных движений // XIV Всероссийская (с международным участием) конференция "БИОМЕХАНИКА − 2020" 03.12.2020- 05.12.2020. Пермь, Россия. https://psma.ru/konferentsii/2220-xiv-vserossijskaya-s-mezhdunarodnym-uchastiem-konferentsiya-biomekhanika-2020.html. Устный доклад

Сапач Ю.О., Паутов А.А. 2020. Результаты использования крио-замещения при изучении устьичного аппарата листьев Osmanthus // Семинар «Крио-фиксация и крио-замещение – современные методы пробоподготовки для просвечивающей электронной микроскопии» 18.02.2020. Санкт-Петербург. http://chromas.spbu.ru/news/8/1193/, http://biomed.spbu.ru/?ELEMENT_ID=392. Устный доклад