Данный проект предполагает комплексное исследование стратегий паразитизма апикомплекс на примере разнообразных низших споровиков: агамококцидий, протококцидий, бластогрегарин, архигрегарин, эугрегарин, паразитирующих в морских беспозвоночных. Именно данные по паразитам морских беспозвоночных помогут установить истинные филогенетические отношения среди разных групп апикомплекс, определить примитивные и продвинутые способы паразитизма, их возникновение и развитие. Однако низшие споровики, паразитирующие в морских беспозвоночных и представляющие разнообразные филогенетические линии апикомплекс, мало или практически не изучены; в библиографических базах данных можно найти считанные статьи. В то время как развитым споровикам, которые вызывают опасные и экономически важные заболевания человека и сельскохозяйственных животных, посвящен огромный массив работ. Коллектив заявленного проекта обладает опытом и навыками по работе с одноклеточными паразитами морских беспозвоночных; выполнение заявленного в проекте позволит существенно расширить знания о низших споровиках и эволюции паразитизма у апикомплекс в целом.
Основной подход предлагаемого исследования - сравнение особенностей паразитирования в хозяине представителей ранних ветвей Apicomplexa (Gregarinea, Blastogregarinea, Protococcidia, Agamococcidia), которые на данный момент либо мало изучены, либо не изучены вовсе. Полученные данные будут сопоставлены с филогенетическим деревом Apicomplexa, реконструированным по молекулярным признакам, как полученным ранее, так и полученным в ходе данного проекта.
В ходе реализации проекта будут выполнены следующие работы:
1. Сбор беспозвоночных-хозяев с последующей изоляцией и фиксацией паразитов.
Морские беспозвоночные (а именно, полихеты), как потенциальные хозяева для низших апикомплекс, будут собраны на литорали и сублиторали в районе Учебно-научной базы «Беломорская» Санкт-Петербургского государственного университета (УНБ «Беломорская» СПбГУ), расположенной на острове Средний в губе Чупа Кандалакшского залива Белого моря, и Беломорской Биологической станции имени Н.А. Перцова биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова (ББС МГУ), расположенной на берегу пролива Великая Салма Кандалакшского залива Белого моря. Грунт, гравий или ризоиды ламинарий будут собраны традиционными методами бентосного сбора (драгирование, кошкование) с моторных или весельных лодок или с помощью легководолазных методов. Грунт будет промыт через серию сит (размер ячеи 5-0.5 мм), организмы будут выбраны руками или пинцетом из промытого грунта. Содержание собранных беспозвоночных будет осуществляться при температуре +10-15oC в контейнерах с проточной или периодически сменяемой морской водой. Вскрытие беспозвоночных и изоляция паразитов будут произведены под стереомикроскопами (MBS-10, ЛОМО, Россия, или их аналогов) с использованием тонких препаровальных игл и оттянутых стеклянных пипеток. Будет проведено специфическое фиксирование паразитов, как свободных от тканей хозяина, так и прикрепленных, для выполнения последующих работ (см. ниже). Сбор беспозвоночных будет проводиться в рамках регулярной научной работы на УНБ «Беломорская» СПбГУ и ББС МГУ, которая проходит в неохраняемой природной зоне или в буферной зоне Кандалакшского государственного природного заповедника согласно соглашению между перечисленными организациями. Отлов и содержание животных проходят в условиях, приближенных к естественным. Вскрытие будет проводиться после анестезии животных хлоридом магния или холодом.
2. Прижизненные наблюдения за подвижностью паразитов с использованием световой микроскопии.
Исследования будут проходить как на базах УНБ «Беломорская» СПбГУ и ББС МГУ в течение полевого (май-сентябрь) сезона, так и в лабораторных условиях в Ресурсных центрах СПбГУ «Экологическая обсерватория» и «Развитие молекулярных и клеточных технология», где есть условия для временного поддержания культуры морских беспозвоночных и наблюдений за их паразитами вне полевого сезона – сентябрь-декабрь. Мы будем наблюдать как за изолированными из тканей хозяина, так и за прикрепленными к кусочкам тканей хозяина паразитами в капле морской воды под световым микроскопом с фазовым контрастом и/или дифференциальным контрастом Номарского и оснащенным цифровой камерой. Результаты наблюдений за подвижностью паразитов (выявление типов подвижности, например, скольжение клетки без изменения формы, изгибание клетки в одной плоскости или в разных плоскостях, сокращение клетки и т.д.) будут связаны с особенностями строения кортекса паразитов, полученных в ходе выполнения морфологического анализа (ниже).
3. Выявление локализации паразита в хозяине в ходе гистологического анализа.
Для анализа локализации паразитов в хозяине будут использованы микроскопические препараты фиксированных органов или кусочков тканей зараженного хозяина. Для фиксации материала будут использованы растворы, приготовленные на основе глютаральдегида (2,5-4% GTA), и фиксатор спирт-формалин-уксусная кислота (AFA). Фиксированные образцы будут подвергаться дегидратации через серию спиртов и в ксилоле и заключаться в парафин-подобную синтетическую смесь для заливки (Histomix или аналоги). Серийные срезы образцов будут подготовлены на вращающемся микротоме и окрашены (например, гематоксилин-эозином). Для специфического окрашивания тканей будет использоваться альтернативная заливка материала в эпоновую смолу. Гистологические препараты позволят оценить локализацию и стадию развития паразита в тканях хозяина.
4. Электронная микроскопия фиксированных объектов.
Ультратонкое строение объектов будет исследовано под сканирующим и трансмиссионным электронными микроскопами с применением стандартных, хорошо показавших себя методик (фиксация глютаровым альдегидом и тетраоксидом осмия, обезвоживание в спиртовой проводке, далее сушка в критической точке с последующим золото-палладиевым напылением (СЭМ) или заливка в эпоксидную смолу с последующим изготовлением ультратонких срезов и их контрастированием уранил-ацетатом и цитратом свинца (ТЭМ)). Члены коллектива успешно применяют оригинальную методику изготовления срезов строго заданных мест (например, продольного среза прикрепительной органеллы) из заливки, содержащей небольшое количество или единичные объекты. Использование методов электронной микроскопии позволяет исследовать морфологию и тонкое строение паразитов, а также их связь с хозяином.
5. Молекулярно-филогенетический анализ.
В течение двух полевых сезонов (см. общий план работ по годам) будут специфически зафиксированы (спирт, RNAlater) отдельные клетки паразитов после их тщательной отмывки в отфильтрованной морской воде для их последующей обработки вне полевого сезона. Молекулярно-филогенетические деревья будут получены на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 18S (маркера, наиболее широко представленного для Apicomplexa в компьютерных базах данных), а также 5.8S и 28S рибосомных РНК (рРНК), которые повышают разрешение базальных ветвей филогенетических деревьев (Simdyanov et al., 2018a, b). Кроме того, в молекулярно-филогенетическом анализе также будут использованы нуклеотидные последовательности внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 для выявления возможных видов-двойников. Для анализа будет использован традиционный комплекс генно-инженерных процедур, включающий выделение ДНК из фиксированных объектов, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), клонирование полученных продуктов на векторах в клетках бактерий Escherichia coli, определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование). Последующая биоинформационная обработка полученных результатов включает в себя построение нуклеотидных выравниваний и компьютерный филогенетический анализ с помощью современных алгоритмов: построение максимально правдоподобных (Maximum Likelihood) и Байесовых (Bayesian Inference) деревьев. В анализе будут использованы вновь полученные последовательности и последовательности, взятые из базы данных NCBI GenBank. Члены коллектива разработали и успешно опробовали оригинальную методику отделения прикреплённых к эпителию хозяина клеток паразитов (обработка 30% этанолом) для последующего выделения ДНК с минимальной контаминацией ДНК хозяина.
6. Оценка полученных данных и сравнение их с данными по другим Apicomplexa, подготовка финального отчета по проекту и публикаций по полученным результатам.
Проект рассчитан на два года. Общий план работы по годам:
1-й год (2022): - январь-май 2022 года, все участники проекта. Обработка предварительно собранного материала для морфологического и ультраструктурного исследования, подготовка к полевым работам, закупка необходимых реактивов, материалов и оборудования.
- июнь-август 2022 года, все участники проекта. Полевые работы на ББС МГУ и УНБ «Беломорская» СПбГУ (Белое море), которые включают в себя сбор морских беспозвоночных, их вскрытие, изоляция паразитов из хозяев, идентификация паразитов, фиксация и подготовка материала к хранению, перевозке и дальнейшей обработке, оптимизация и стандартизация методов используемых для каждого модельного объекта.
- июнь 2022 года, все участники проекта. Участие в 16-м Международном Конгрессе по протистологии, Южная Корея, Сеул (16th International Congress of Protistology, Seoul, 19-24 June 2022) с докладом и/или постерами в зависимости от формы проведения мероприятия.
- август 2022 года, все участники проекта. Участие в 15-м Международном Конгрессе по паразитологии, Копенгаген, Дания (XV International Congress of Parasitology, Copenhagen, Denmark, 21-26 August 2022), с онлайн докладом или постерами в зависимости от формы проведения мероприятия.
- сентябрь-декабрь 2022 года, все участники проекта. Обработка собранного материала с последующим анализом подвижности, локализации в хозяине и способу прикрепления к тканям/клетке хозяина у следующих споровиков: бластогрегарины Siedleckia spp. из Naineris quadricuspida, протококцидия Eleutheroschizon sp. из Naineris quadricuspida, асептатные эугрегарины Difficilina spp. из немертин Lineus spp. Для выбранных объектов будет проведен филогенетический анализ (для бластогрегарин уже есть предварительно полученные результаты, требующие уточнения) на основе последовательностей 18 S и 28 S rDNA для определения их филогенетического положения среди апикомплекс.
- сентябрь-декабрь 2022 года, все участники проекта. Предварительная оценка полученных данных; подготовка отчета за первый год реализации проекта; подготовка и отправка двух рукописей для печати в рецензируемых журналах.
2-й год (2023):
- январь-апрель 2023 года, все участники проекта. Дальнейшая обработка материала с последующим анализом; исследование подвижности и способов прикрепления паразита к клетке/ткани хозяина; морфологический анализ паразито-хозяинных отношений, филогенетическое положение по следующим объектам: архигрегарина Selenidium sp. из полихеты Scalibregma inflatum, архигрегарина Selenidium sp. из полихеты Ophelia limacina, агамококцидия Rhytidocystis sp. из Travisia forbesii. Для выбранных объектов будет проведен филогенетический анализ на основе последовательностей 18 S и 28 S rDNA для определения их филогенетического положения среди апикомплекс. Для некоторых объектов уже есть предварительно полученные результаты, требующие уточнения. Будет подготовлена одна рукопись для печати в рецензируемом журнале, продолжено отслеживание ранее поданных в печать рукописей.
- май-сентябрь 2023 года, все участники проекта. Мы проведем дополнительный сбор и обработку материала для уточнения деталей строения и филогенетического положения выбранных объектов по мере необходимости. Начнется подготовка финального отчета и отслеживание поданных в печать рукописей.
- октябрь-декабрь 2023 года, все участники проекта. Подготовка финального отчета по проекту.
Следующие объекты исследования были выбраны как наиболее подходящие для реализации проекта:
- бластогрегарины Siedleckia spp. из Naineris quadricuspida. Исследование прикрепительного аппарата и подвижности двух бластогрегарин из одного хозяина позволят провести сравнение с уже ранее изученными S. nematoides и Chattonaria mesnili (Simdyanov et al., 2018) и выявить эволюционные тенденции в пределах этой группы в сравнении с архигрегаринами и кокцидиями.
- архигрегарины Selenidium spp. из Ophelia limacina и Scalibregma inflatum. Указанные архигрегарины обладают необычным прикрепительным аппаратом. Исследование этих паразитов позволит расширить представления о разнообразии стратегий инвазии и паразито-хозяинных взаимоотношений архигрегарин, а также поднять вопрос о классификации прикрепительных органелл у грегарин в целом. Дополнительно, сопоставление подвижности этих паразитов с организацией их кортекса дополнит знания о морфофункциональной организации архигрегарин.
- асептатные эугрегарины Difficilina spp. из немертин Lineus spp. Новые данные по этим эугрегаринам позволят разрешить классификацию прикрепительных органелл у эугрегарин и продолжить обсуждение об эволюции прикрепительных органелл у грегарин в целом. Кроме того, получив данные о филогенетическом родстве с другими асептатными эугрегаринами, авторы проекта смогут разрешить филогению крупной клады Lecudinoidea, что, в свою очередь, позволит поднять вопрос о происхождении целомического паразитизма в пределах этой клады. Эти вопросы уже были затронуты в наших публикациях (Diakin et al., 2016; Simdyanov et al., 2017).
- протококцидия Eleutheroschizon sp. из Naineris quadricuspida. Полученные данные по прикрепительному аппарату и паразито-хозяинным взаимоотношениям у выбранного объекта в сравнении с ранее изученным Eleutheroschizon duboscqi (Valigurová et al., 2015) позволят поднять вопрос о происхождении эпицеллярного паразитизма среди кокцидий.
- агамококцидия Rhytidocystis sp. из Travisia forbesii. Наши предварительные данные по биологии этого паразита подтверждают, что данный объект является хорошей моделью для исследования перехода от внутриклеточного
паразитирования к тканевому в ходе развития паразита в хозяине-полихете. Ранее полученные транскриптомные данные (Januškoveс et al., 2019) позволяют установить филогенетическое положение выбранного объекта и
агамококцидий в целом.
Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов.
В ходе выполнения проекта РНФ 18-14-00123 (2018-2020) по морфологической и геномной эволюции апикомплекс мы получили результаты, которые позволяют нам начать новое исследование по иной тематике, а именно эволюционно-морфологическое исследование трансформации инфекционных зоитов в трофозоиты у споровиков разных филогенетических линий:
- Результаты предварительного исследования протококцидии Eleutheroschizon sp. из полихеты Naineris quadricuspida выявили, что для этого паразита, как и для ранее нами исследованного E. duboscqi (Valigurova et al. 2015), характерен псевдоэпицеллюлярный паразитизм в паразитофорном мешке, образованном выростами клетки хозяина. У исследованного нами паразита Eleutheroschizon sp. есть видоспецифические отличия в строении прикрепительного аппарата от такового у E. duboscqi. Результаты исследования тонкого строения Eleutheroschizon sp. позволят нам установить морфофункциональную связь организации покровов с потерей подвижности паразита при трансформации зоита в трофозоита. Все в совокупности позволит нам охарактеризовать инновации протококцидий в становлении паразито-хозяинных отношений в сравнении с таковыми у других апикомплекс и, в частности, у криптоспоридиумов.
- Предварительное исследование паразитофауны полихеты Naineris quadricuspida показало, что в этом хозяине встречаются бластогрегарины двух видов, которые различаются не только морфологически, но и по типам подвижности клетки: бластогрегарины одного вида обладают изгибательной подвижностью, другого - неподвижные. Морфологически эти бластогрегарины отличаются от ранее нами изученных Siedleckia nematoides и Chattonaria mesnili из Scoloplos armiger (Simdyanov et al., 2018). Наши предварительные данные открывают перспективу исследования эволюционных модификаций мукрона и корреляции между типом подвижности и строением кортекса у бластогрегарин в сравнении с таковыми у архигрегарин.
- По нашим предварительным данным прикрепительная органелла архигрегарины Selenidium sp. из Scalibregma inflatum напоминает эпимерит эугрегарин. Это позволяет предполагать конвергентное развитие прикрепительных органелл у архи- и эугрегарин.
- Коллектив запланированного проекта предварительно получил новые нуклеотидные последовательности маркерных генов рибосомных РНК некоторых объектов: 18S рРНК для бластогрегарин из Naineris quadricuspida, протококцидии Eleutheroschizon sp., для эугрегарин Difficilina spp. из немертин Lineus ruber, L. viridis; 5.8S рРНК для бластогрегарин из Naineris quadricuspida, протококцидии Eleutheroschizon sp., и 28S рРНК для бластогрегарин из Naineris quadricuspida, протококцидии Eleutheroschizon sp., для эугрегарин Difficilina spp. из немертин Lineus ruber, L. viridis.
- Предварительный анализ нуклеотидных последовательностей внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 у бластогрегарин выявил наличие среди них видов-двойников. Это подталкивает нас использовать эти маркерные гены в молекулярно-биологическом исследовании всех выбранных объектов запланированного проекта с целью выявления возможного наличия видов-двойников в одном хозяине.
Коллектив обладает опытом совместной реализации проектов, который вылился в следующие исследования и публикации:
1. Изучена ультраструктура протококциди Eleutheroschizon duboscqui из кишечника полихеты Scoloplos armiger: локализация паразита на апикальной поверхности клетки хозяина, формирование паразитофорного мешка вокруг
паразита за счет слияния выростов клетки хозяина, развитие прикрепительной органеллы, - все эти особенности сопоставимы полностью или частично с таковыми у Cryptosporidium spp., архигрегарины Ditrypanocystis sp., некоторых кокцидий рода Eimeria. По материалам исследования опубликована статья - Valigurová et al., 2015, в которой участвовали Паскерова Г.Г. (руководитель проекта), Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта). Дополнительно к этому собран материал для морфологического описания и молекулярно-филогенетического исследования нового вида Eleutheroschizon из полихеты Naineris quadricuspida. Материал дает перспективу на сравнительное исследование паразитизма у протококцидий в рамках данного проекта.
2. Проведено исследование ультраструктуры и филогенетического положения Siedleckia nematoides из полихеты Scoloplos armiger и Chattonaria mesnili из полихеты Orbinia latreillii, которое установило, что бластогрегарины представляют собой независимую, рано ответвившуюся ветвь среди апикомплекс заслуживающую ранга класса в классической таксономической системе. Материал опубликован - Simdyanov et al., 2018, соавторы публикации: Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта), Паскерова Г.Г. (руководитель проекта). Кроме того, проведено и опубликовано исследование по механизму подвижности бластогрегарины S. nematoides - Valigurová et al., 2017, в которой участвовали Паскерова Г.Г. (руководитель проекта), Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта). В дополнение к этим материалам предварительно собран и обработан материал для молекулярно-филогенетических исследований двух бластогрегарин из полихеты Naineris quadricuspida, отличающиеся по биологии и морфологии. Эти данные позволяют перейти к новому исследованию - выяснение эволюционных модификаций прикрепительной органеллы у бластогрегарин в сравнительном аспекте.
3. На основе 13 single-cell транскриптомов, полученных из 10 представителей различных ветвей Alveolata, мы пришли к выводу, что апикомплексоподобные протисты полифелитичны и обладают конвергентно схожей морфологией. Таким образом, паразитизм среди них возникал неоднократно, при этом пластиды у апикомплексов и их родственников широко распространены и имеют общее фотосинтетическое происхождение. По результатам опубликована статья - Janouškovec et al., 2019, в которой соавторами являются: Паскерова Г.Г. (руководитель проекта), Миролюбова Т.С. (исполнитель проекта), Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта).
4. Мы провели исследование морфологии трех новых видов агамококцидий из рода Rhytidocystis и получили транскриптомные данные для двух из них. Полученные данные позволили нам установить, что ритидоцистиды являются базальной группой к остальным кокцидиоморфам и что начальные этапы их развития в кишечном эпителии хозяина идут внутриклеточно. Дополнительно транскриптомный анализ показал наличие генов, ответственных за мейоз и синтез белков ооцисты, что может свидетельствовать в пользу наличия полового процесса в их жизненном цикле, что ранее подвергалось сомнению. По результатам опубликована статья - Miroliubova et al., 2020, в которой соавторами являются: Миролюбова Т.С. (исполнитель проекта), Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта), Паскерова Г.Г. (руководитель проекта).
5. Собран материал для молекулярно-филогенетических исследований асептатной эугрегарины Polyrhabdina sp. из кишечника полихеты Pygospio elegans. Молекулярные данные показывают, что эта асептатная эугрегарина вошла в кладу Ancoroidea, а не в Lecudinoidea, как это предполагалось в литературе. Морфологический анализ выявил у этого паразита прикрепительную органеллу эпимеритной организации, что позволяет поддержать гипотезу об инновационном приобретении эпимерита у эугрегарин. Полученные результаты изложены в рукописи, отправленной в
журнал PeerJ на рецензирование, соавторами предполагаемой публикации являются Паскерова Г.Г. (руководитель проекта), Миролюбова Т.С. (исполнитель проекта), Симдянов Т.Г. (исполнитель проекта).