1.Научная проблема, на решение которой направлен проект
Неинвазивная дифференциальная диагностика ренальных амилоидозов
2.Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
Амилоидозы – это заболевания, которые характеризуются накоплением аномально сложенных белков (амилоидов) в различных органах, что приводит к нарушениям в работе этих органов (Merlini, Bellotti, 2003; Pepys2006). Механизмы, приводящие к развитию амилоидозов, изучены слабо и успешность терапии, сдерживающей развитие этих заболеваний, существенно зависит от стадии, на которой они были диагностированы (Oerlemans et al., 2019). Наиболее распространенные типы амилоидоза (AL-амилоидоз, АА-амилоидоз) являются системными патологическими процессами, затрагивающими многие органы и ткани, в том числе почки, что приводит к нарушению функции почек вплоть до полной утраты (Dember, 2006). Диагноз амилоидоза может быть однозначно поставлен только после изучения биопсийного материала, взятого в случае ренальных амилоидозов из почки. Классический анализ, который позволяет с большой степенью уверенности диагностировать амилоидоз, заключается в окрашивании образцов ткани красителем Конго красным и выявлением эффектов двойного лучепреломления и дихроизма в поляризованном свете от связывания данного красителя с амилоидами (Puchtler et al., 1962; Howie et al., 2008). К настоящему времени разработаны различные подходы на основе иммунодетекции, а также масс-спектрометрических и имиджинговых технологий, которые позволяют уточнить тип амилоидоза путем анализа биопсийного материала, связывающего Конго красный (обзор Wisniowski, Wechalekar, 2008). Однако инвазивный характер подобной диагностики, которая выявляет заболевание уже на терминальных стадиях развития, требует разработки новых подходов для подтверждения развития амилоидоза и определения его типа. Единственным условно неинвазивным методом, для которого показаны практически 100% чувствительность и специфичность, является диагностика с помощью введения в сосудистое русло визуализации накопления радиоактивных меток в амилоидных отложениях миокарда. Данный метод разработан исключительно для выявления транстиретинового амилоидоза сердца и при условии, что у пациента отсутствует дискразия плазматических клеток (Gillmore et al., 2016). Использование радиоактивно меченого амилоидного P компонента также позволяет эффективно диагностировать наличие амилоидных отложений, но без уточнения их типа (Hazenberg et al., 2006). Таким образом, неинвазивная диагностика амилоидозов и его типов на ранних стадиях развития является актуальной проблемой, а поиск новых диагностических маркеров, указывающих на развитие различных типов амилоидозов, имеет научную значимость для понимания механизмов развития данных заболеваний.
3.Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность
Цель исследования в разработке методов диагностики различных типов амилоидоза путем анализа образцов мочи с протеинурией. В рамках проекта предполагается решение следующих задач.
Первое, собрать коллекцию образцов мочи с высоким уровнем белка от пациентов с диагнозами AL-амилоидоза, AA-амилоидоза, IgA-нефропатии, мембранной нефропатии, миеломы и других заболеваний почек. Второе, оценить специфичность связывания амилоид-специфичного красителя Конго красного с белковыми компонентами в образцах мочи больных амилоидозом (CRD-тест и CRD бумажный тест) в сравнении другими образцами в коллекции. Третье, выполнить масс-спектрометрический анализ детергент-устойчивых агрегатов, выделенных из образцов мочи в коллекции, сопоставить полученные профили белков с клиническими данными и оценить специфичность и чувствительность данного подхода в диагностике различных амилоидозов. Четвертое, оценить возможность использования метода циклической амплификации неправильно сложенных белков (PMCA, Protein Misfolding Cyclic Amplification) для выявления амилоидных агрегатов легких цепей иммуноглобулинов в образах мочи больных AL-амилоидозами.
Планируется использование не менее 50 образцов мочи, которые будут предоставлены Научно-исследовательским институтом нефрологии при Санкт-Петербургском государственном медицинском университете им. И.П. Павлова. Анализ образцов будет проводиться согласно задачам по трем направлениям на базе научной лаборатории биологии амилоидов и ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий».
4.Научная новизна исследований, обоснование того, что проект направлен на развитие новой для научного коллектива тематики, обоснование достижимости решения поставленной задачи (задач) и возможности получения предполагаемых результатов
Попытки выявления амилоидных агрегатов в моче предпринимались уже в 70-х гг. прошлого века, когда в ряде исследований было показано, что как при амилоидозе, так и в контрольных группах обнаруживаются фибриллярные структуры различных типов (Shirahama et al., 1977; Winer et a., 1979). Однако определение белкового состава различных типов фибрилл не проводилось из-за ограниченности методических подходов того времени. В настоящее время, наиболее эффективным способом диагностики амилоидоза и его типов считается масс-спектрометрический анализ образцов тканей, полученных в результате биопсии (Casadonte et al., 2015; Winter et al., 2017). Данный подход позволяет проводить диагностику даже для случаев, при которых не обнаруживается окрашивание отложений Конго красным (Sethi et al., 2012). Неинвазивные методы диагностики с использованием биологических жидкостей к настоящему времени до сих пор не разработаны, что может быть связано с высоким уровнем в моче и плазме крови белков, не связанных с развитием амилоидоза. В то же время попытки анализа белков в составе детергент-устойчивых агрегатов, выделенных из мочи больных амилоидозом, ранее никем не производились. Использование агрегатов для диагностики позволяет отсечь фон из факторов, которые не вовлекаются в образование агрегатов, а обработка детергентами позволяет избегать белковых комплексов неамилоидной природы (Nizhnikov et al., 2014). По нашим предварительным данным количественный и качественный состав белков в детергент-устойчивой фракции агрегатов существенно варьирует в образцах с разной этиологией протеинурии, несмотря на единообразие состава белков в необработанных образцах мочи после разделения в акриламидном геле. Анализ состава детергент-устойчивых агрегатов в образцах при различных диагнозах может иметь научную и клиническую значимость, которая до сих пор никем не оценена. Подтверждением этому служат данные о выявлении в агрегатах, выделенных из мочи, основных факторов развития преэклампсии, заболевания у беременных, также связанного с протеинурией и амилоидогенными отложениями в тканях (Buhimschi et al., 2014). Для диагностики преэклампсии также показано спешное применение CRD (Congo Red Dot) теста и CRD бумажного теста на образцах мочи (Buhimschi et al., 2014; Rood et al., 2019). Разработка данного теста основана на предположении, что Конго красный связывает в составе мочи больных преэклампсией амилоидогенные белки (Buhimschi et al., 2014). Выполнение CRD тестов на протеинуретических образцах мочи в коллекции, полученных от больных при преэклампсии, различных амилоидозах и неамилоидных заболеваниях, позволит уточнить специфичность данного теста для диагностики заболеваний, при которых показано формирование амилоидов в тканях органов. Известно, что аномальная конформация белков в составе амилоидных агрегатов может провоцировать и ускорять образование мономерами этих белков новых агрегатов. Периодическое фрагментирование амилоидных агрегатов в растворе мономеров приводит к экспоненциальному росту агрегированных форм белка, что дает возможность детектировать амилоиды в биологических жидкостях, несмотря на их крайне низкую концентрацию (Atarashi et al., 2008; Saborio et al., 2001). Эти и подобные методы амплификации амилоидов сокращенно называются PMCA, от Protein Misfolding Cyclic Amplification, или QuIC, от Quaking-Induced Conversion. Ранее на образцах мочи была продемонстрирована высокая чувствительность PMCA для диагностики заболеваний у человека, связанных с амилоидными отложениями в мозге прионных белков (Moda et al., 2014). Известно, что, как и прионные белки, легкие цепи иммуноглобулинов, выделенные из мочи больных амилоидозом, способны к агрегации in vitro (Andrich et al., 2017). Однако до сих пор ни разу не предпринимались попытки детекции малых количеств агрегатов этих белков в моче путем амплификации агрегатов в растворе мономеров рекомбинантного полипептида легких цепей. Так как детекция на основе PMCA часто демонстрирует высокую чувствительность, то данный подход может позволить выявлять малопредставленные в образцах мочи больных амилоидозами специфичные олигомерные формы патологичных вариантов легких цепей иммуноглобулинов в общей массе белков данного типа. Основной проблемой в применении данного подхода является уникальность легких цепей иммуноглобулинов в каждом случае амилоидоза за счет вариабельного домена. В настоящем проекте в качестве мономеров для постановки PMCA планируется использовать рекомбинантные полипептиды, соответствующие константному домену легких цепей каппа типа. Ранее уже было показано успешное использование отдельных фрагментов белка для амплификации агрегатов в составе биологического образца (Orrú et al., 2015). Разработка безопасных и эффективных подходов для диагностики амилоидозов является новым направлением исследования для участников проекта, реализация которого стала возможна за счет взаимодействия сотрудников клинической и научной лабораторий при поддержке высокотехнологичных ресурсных центров университетов Санкт- Петербурга. Решение поставленных в проекте задач возможно благодаря уже начатому сбору и анализу образцов, освоению уникальных методик (CRD тесты, выделение детергент-устойчивых агрегатов белков, хромато-масс-спектрометрия, PMCA) и проведению успешных пилотных экспериментов по оценке применимости предлагаемых подходов. В распоряжении коллектива имеется все необходимое оборудование (ультрацентрифуги, масс-спектрометр, хроматограф, лиофилизатор, спектрофлюориметр и другое) и основная часть реактивов для реализации проекта. Участники проекта имеют опыт по работе с образцами, необходимую квалификацию для проведения экспериментов на высокотехнологичном оборудовании и обработки данных биоинформационными и статистическим методами. Использование нескольких подходов, для которых уже было показано другими исследователями их успешное применения в целях диагностики, дает высокие шансы получения положительного результата в решении задачи по определению новых диагностических критериев для разных типов амилоидозов.
5.Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
В настоящее время описано свыше 30 типов амилоидозов, большинство из которых являются крайне редкими заболеваниями (Benson et al., 2018). Различные амилоидозы характеризуются отложением в различных органах и тканях разных типов белков, что происходит в результате приобретения этими белками амилоидогенных свойств, то есть склонности к формированию агрегатов посредством кросс-бета сшивок между отдельными полипептидами (Glenner, 1980). Амилоидные агрегаты являются инертными образованиями, которые демонстрируют устойчивость к действиям протеаз и различных детергентов. Амилоидные свойства могут быть следствием вариаций в аминокислотной последовательности и проявляются при различных патологиях, связанных с повышенным уровнем амилоидогенного белка в тканях и жидкостях организма (Merlini, Bellotti, 2003; Bunker, Gorevic, 2012). Диагностика типа амилоидоза позволяет назначать терапию, направленную на снижение уровня конкретного белка в организме и подавление патологических процессов, связанных с этим белком (Lachmann et al., 2007; Nevone et al., 2020). Большинство случаев амилоидозов (>90%) относят к 4 типам (Linke, 2012), которые в большинстве случаев характеризуются отложением амилоидов в почках, появлением протеинурии, развитием нефротического синдрома и хронической болезни почек (Dember, 2006). Другими частыми проявлениями амилоидоза являются сердечная недостаточность и тяжелые, нередко фатальные, варианты нарушения ритма сердца в случае отложения белков в сердечной мышце, а также поражение периферических отделов автономной нервной системы, приводящие к нарушению функционирования внутренних органов (Juneja, Pati, 2020). Депозиция амилоида в миокарде ассоциирована с высокой летальностью, а при отложении амилоида в почечной ткани формируется терминальная почечная недостаточность, требующая заместительной почечной терапии гемодиализом. В случае системного амилоидоза отложения обнаруживается в различных тканях и органах, при локальном – лишь в определенных частях тела.
AL-амилоидоз – наиболее распространенный в развитых странах тип амилоидоза, связанный с отложением в сердце, почках, печени и других органах легких цепей иммуноглобулинов каппа и лямбда типов (LC-IgK и LC-IgL). Образование в организме избытка LC-IgK или LC-IgL связано с их продукцией клоном В-клеточной линии. В некоторых случаях аберрантный клон В-клеточной линии (плазмоцитарный, лимфоплазмоцитарный или лимфоцитарный) вырабатывает молекулы легких цепей измененной структуры за счет мутаций в клетке клона и, соответственно, измененных физико-химических свойств, что обусловливает амилоидогенность этих молекул (Смирнов и др., 2019; Merlini et al., 2013). АА-амилоидоз — другой распространенный тип амилоидоза, который известен как вторичный, так как его развитие связано с накоплением агрегатов сывороточного амилоидного А-белка (SАА), который продуцируется в ответ на хронический воспалительный процесс (ревматоидный артрит, болезнь Крона, хронический остеомиелит, бронхоэктатическая болезнь и др.), протекающий в организме (Bunker, Gorevic, 2012). Также часто встречающимися типами являются наследственная и сенильная формы амилоидозов (Benson, 2003; Sekijima, 2015), вызванных накоплением белка транстиретина (TTR), в первую очередь, в сердце, а также амилоидозы, которые развиваются у больных с гемодиализом в связи с отложением β2-микроглобулина (Zingraff et al., 1990).
Амилоидозы неизлечимы и при отсутствии лечения болезнь в течение нескольких лет приводит к смерти (Nienhuis et al., 2016). Терапия направлена на смягчение симптомов заболевания и ограничение продукции в организме амилоидного белка, в том числе путем подавления патологических процессов, провоцирующих увеличение количества этого белка, как, например, происходит с белком SAA при ревматоидном артрите и туберкулезе. В случае AL-амилоидозов используется химиотерапия для остановки роста аномальных клеток, производящих амилоидогенные белки (Gertz et al., 2018), а для наследственных TTR-амилоидозов – трансплантация печени (Stangou et al., 2004) и лечение стабилизаторами функциональных тетрамеров TTR (Berk et a., 2013).
Диагностика амилоидозов затруднена тем, что симптомы амилоидозов повторяют симптомы других гораздо более распространенных заболеваний. Предположение о развитии амилоидоза делается на основании системности поражения органов, включая нефротический синдром, необъяснимую сердечную дисфункцию, вегетативную или сенсорную нейропатии, синяки вокруг глаз (периорбитальная пурпура), потерю веса и другие (Juneja, Pati, 2020). В целях оценки состояния органов, которые возможно затронуты амилоидозом, и уточнения типа заболевания также проводят тестирование с помощью эхокардиографии, магнитно-резонансной томографии и визуализации радиоактивных меток, которые вводят в сосудистое русло (Falk, 2005; Banypersad et al., 2013). Например, сывороточный амилоидный Р компонент (SAP) с радиоактивной меткой, задерживается в амилоидных отложениях, локализация которых может быть детектирована по радиоактивному сигналу. Метод позволяет с высокой степенью чувствительности и специфичности (>90%) диагностировать развитие амилоидоза и определить локализацию отложений в организме (Hazenberg et al., 2006). Самым точным методом диагностики является анализ биологического материала, полученного с помощью биопсии, однако данная инвазивная процедура назначается уже при появлении выраженных нарушений в работе органов, когда лечение уже часто малоэффективно. В частности, масс-спектрометрическое исследование тканей, связывающих Конго красный, дает возможность безошибочно идентифицировать тип амилоидоза в большинстве случаев (92%). Иммуногистохимическая идентификация менее чувствительна и на тех же образцах позволяет идентифицировать тип амилоидоза только в 45% случаев (Mollee et al., 2016). Также предпринимаются попытки создания методов масс-спектрометрического анализа циркулирующих предшественников амилоидозов в биологических жидкостях (см обзор Lavatelli et al., 2016). Ввиду высокого содержания нецелевых белков в образцах плазмы и мочи (при протеинурии) в данных методах необходимо обогащение образцов, как правило, с помощью антител (Corlin et al., 2005; Mills et al., 2015; Tasaki et al., 2016). В клинических исследованиях данные подходы до сих пор практически не оценены вероятно ввиду сложности процедуры, а также необходимости изначального выбора типа амилоидоза, для которого будет проводиться анализ. Более перспективно выглядят исследования, в которых диагностика заболевания и его мониторинг обеспечивается масс-спектрометрическим выявлением специфичных пептидов. Например, детекция в сыворотке крови уникальных пептидов из вариабельных доменов легких цепей иммуноглобулинов, продуцируемых патогенным клоном плазматических клеток, позволяет диагностировать миелому и ее развитие (Bergen et al., 2016), а выявление пептидов со специфичными пост-трансляционными модификациями дополняет диагностику семейных форм TTR амилоидоза (Vilà-Rico et al., 2015). Разработка данных подходов усложняется необходимостью de novo анализа результатов масс-спектрометрии и пока не проводилась оценка их чувствительности и специфичности в диагностике разных типов амилоидозов. Таким образом, до сих в мире не созданы методы неинвазивной диагностики различный типов диагностики, а существующие разработки в данном направлении находятся на стадии предварительных оценок возможности их реализации. Предлагаемый нами подход с масс-спектрометрическим анализом агрегатов в моче является менее сложным в техническом исполнении и дает результат, который может быть интерпретирован с высокой степенью определенности при постановке диагноза.
6.Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта и ожидаемые результаты
Для разработки новых подходов в дифференциальной диагностике амилоидозов и оценки их специфичности планируется использование коллекции образцов мочи с высоким уровнем белка от пациентов, для которых поставлены диагнозы AL-амилоидоза, AA-амилоидоза, IgA-нефропатии, мембранной нефропатии, миеломы и других заболеваний специалистами Научно-исследовательского института нефрологии при ПСПбГМУ им. И.П. Павлова. Сбор и хранение образцов будет осуществляться в ПСПбГМУ им. И.П. Павлова по стандартной методике, принятой при проведении лабораторных тестов. Для каждого образца будет выполняться оценка концентрации белка в моче методом Бредфорд (Quick Start Bradford) и методом с пирогаллоловым красным (набор общий белок-03-витал). Также будут учитываться значения креатинина в сыворотке крови и скорости клубочковой фильтрации по данным медицинской базы пациентов.
В первую очередь, в рамках проекта, все образцы будут протестированы на конгофилию путем их окрашивания амилоид-специфичным красителем Конго красным, нанесением на мембрану (с последующей отмывкой в этаноле, CRD тест с модификациями) или на 3MM ватман (CRD бумажный тест с модификациями). Анализ изображений мембраны/ватмана будет проводиться при помощи программного обеспечения ImageJ для расчета показателей конгофилии. Сравнение показателей конгофилии будет осуществляться путем их усреднения по каждой группе заболеваний, определением достоверности отличий между группами непараметрическими методами (U-критерий Манна-Уитни или тест рандомизации) и расчетом доверительных интервалов средних значений методом бутстрэппинга с коррекцией смещения и акселерации (10000 итераций). При выявлении достоверных различий между группами контрольных образцов и образцов больных амилоидозом будет выполняться ROC (receiver operating characteristic) анализ для оценки эффективности метода (Area Under Curve, AUC) и расчета значения критерия (порога отсечения), дающего наиболее оптимальное соотношение чувствительности и специфичности метода.
В масс-спектрометрический анализ будут взяты образцы мочи и детергент-устойчивых агрегатов, полученные из этих образцов. Для получения агрегатов будет выполняться ультрацентифугирование образцов при 300 000 xg, обработка осадка 3% саркозилом и повторное осаждение детергент-устойчивых комплексов. Предварительный количественный и качественный состав выделенных агрегатов будет оцениваться путем проведения денатурирующего акриламидного электрофореза с окраской красителем кумасси бриллиантовый синий. Пробоподготовка образцов для масс-спектрометрии будет осуществляться посредством заключения образцов в 10% акриламидный гель для очистки, восстановления и алкилирования белков с последующим инкубированием в растворе с трипсином и экстракцией пептидов из геля с помощью ультразвуковой ванны. Полученные пептиды будут концентрироваться в лиофилизаторе и проходить дополнительную очистку с помощью ZipTip на смоле С18. Тандемная масс-спектрометрия, совмещенная с жидкостной хроматографией (LC-MS/MS), будет осуществляться на приборе Bruker timsTOF Pro совместно со специалистами ресурсного центра «Развитие молекулярных и клеточных технологий» на базе СПбГУ. Для биоинформатического анализа результатов и выявления биомаркеров в протеомных профилях каждой группы заболеваний будут использованы лицензионный пакет программ PEAKS и бесплатное программное обеспечение MSFragger.
Для оценки возможности детекции амилоидных агрегатов в составе мочи больных амилоидозами методом PMCA будет получен рекомбинантный полипептид константного домена LC-IgK, мономеры которого будут использованы для амплификации агрегатов, содержащих полноразмерные LC-IgK в амилоидной конформации. Детекция агрегатов будет производится в спектрофлюориметре (Spark, Tecan) с помощью тиофлавина Т, флуоресцирующего в диапазоне 480-490 нм при связывании с амилоидными агрегатами. Для получения константного домена LC-IgK (сLC-IgK) будет создан вектор на основе pET302/NT-His, который будет содержать кодирующую последовательность сLC-IgK под контролем индуцибельного промотора T7. Для создания вектора будут использованы методы выделения ДНК, полимеразной цепной реакции, ферментативного гидролиза, лигирования фрагментов ДНК, бактериальной трансформации плазмидными векторами, очистки плазмид из клеточных культур, разделения нуклеиновых кислот в агарозном электрофорезе, секвенирования и другие. сLC-IgK будет продуцироваться в культуре клеток BL21(DE3) Escherichia coli с последующей очисткой методом металл-аффинной хроматографии за счет присоединения гистидинового тега к сLC-IgK. Также при необходимости будет выполнена дополнительная очистка методом ионообменной хроматографии на приборе NGC Discover 10 с коллектором фракций. Целостность сLC-IgK и его концентрация будет оцениваться посредством электрофореза полипептида в полиакриламидном геле с последующей окраской красителем кумасси бриллиантовый синий.
В 2022 году планируется доведение размера коллекции аннотированных образцов мочи до 50 и более и выполнение на них тестов на конгофилию. Будут рассчитаны коэффициенты удержания Конго красного на мембране в составе всех образцов, определены средние значения для каждого типа заболевания. Также будет выполнена оценка эффективности тестов на конгофилию для диагностирования заболеваний, при которых выявляются амилоидные отложения в тканях.
Для 10-20 образцов мочи и для выделенных из них агрегатов планируется получить протеомные профили и провести предварительный анализ на наличие специфических маркеров при разных типах амилоидоза. Так как объемы образцов при протеинурии зачастую крайне малы, то также будет выполнены эксперименты по оценке минимального количества белка необходимого для выполнения протеомного анализа для агрегатов.
Для получения полипептида сLC-IgK будет выполнено выделение ДНК из лимфоцитов человека, амплификация гена IGKC (Gene ID: 3514), секвенирование его последовательности и вставка в бактериальный вектор для сверхпродукции. сLC-IgK будет выделен из бактериальных клеток и очищен на хроматографических колонках в количестве достаточном для проведения PMCA с образцами коллекции.
В 2023 году будет выполнен протеомный анализ всех образцов мочи в коллекции и выделенных из них агрегатов. На основании полученных результатов будет определены маркеры, характеризующие каждый тип заболевания, а также будут выполнены оценки чувствительности и специфичности использования данных маркеров для диагностики амилоидозов и его типов (выполнение ROC-анализа).
Для постановки PMCA будут определены условия (температура, концентрация, интенсивность перемешивания, буферный раствор), при которых рекомбинантный белок сLC-IgK не будет демонстрировать самоагрегацию. В реакции PMCA будут протестированы образцы, полученные от больных с диагнозом AL-амилоидоза, а также образцы, для которых масс-спектрометрический анализ выявил наличие LC-IgK. Ожидается оценить способность агрегатов LC-IgK в составе образцов мочи затравливать агрегацию мономеров сLC-IgK и в случае положительного результата определить диагностические возможности данного подхода, что будет зависеть от количества образцов, содержащих агрегаты LC-IgK.
7.Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов
Участниками коллектива освоены все методики, которые будут использованы для реализации проекта, а также проведены пилотные эксперименты, подтверждающие релевантность выбранных методов для решения поставленных задач. Сотрудничество между лабораториями ПСПбГМУ им. И.П. Павлова и СПбГУ в течение более двух лет обеспечивает возможность внедрения в клинические лаборатории новых высокотехнологических и эффективных методов диагностики. На настоящий момент уже собрано свыше 30 образцов мочи от больных с протеинурией, часть из которых была протестирована в тестах на конгофилию. Предварительно установлено, что амилоидозы дают в этих тестах положительный ответ, однако для подтверждения специфичности конгофилии при амилоидозах требуется сопоставление большего количества протеинуретических проб от пациентов с амилоидозом и с заболеваниями неамилоидной природы.
На нескольких образцах AL-амилоидоза, АА-амилоидоза, IgA-нефропатии и мембранной нефропатии показана возможность выделения детергент-устойчивых агрегатов из мочи больных и специфичность при разных типах заболевания количественного и качественного состава белков, разделенных и окрашенных в полиакриламидном геле. В то же время состав и количество белков в тех же образцах мочи до обработки крайне единообразен, что объясняет трудности выявления маркеров амилоидозов в тотальном белке. Также проведены пилотные эксперименты с применением масс-спектрометрического анализа, в которых подтверждена возможность получения протеомных профилей из протеинуретических образцов мочи и агрегатов в составе этих образцов.
У участников проекта имеется опыт получения рекомбинантных белков, постановки и оптимизации PMCA с различными амилоидогенными полипептидами, в том числе с амилоидом-бета.