Настоящий проект направлен на разработку бимодальных оптических меток, которые позволят проводить более точное определение раковых клеток даже при малых их количествах двумя инструментальными методами, а также позволят проводить локализованное гипертермальное воздействие во время диагностических процедур.
Научная значимость решения проблемы высокоэффективных оптических агентов для биовизуализации локальной гипертермии связана с соответствующими прикладными потребностями. Наиболее эффективное лечение онкологических заболеваний реализуется на ранних стадиях заболевания, что делает раннюю диагностику одной из приоритетных задач.
Разработка мультимодальных агентов биовизуализации необходима для повышения их диагностической эффективности и расширения функциональности. Конкретная задача проекта заключается в разработке бимодальных оптических меток на основе плазмонных наночастиц золота для биовизуализации раковых клеток методами флуоресцентной и КР микроскопии, позволяющих одновременно проводить локализованную гипертермальную терапию.
В проекте планируется разработка трех новых типов плазмонных меток, каждый из которых отличается оригинальной концепцией относительно сочетания оптических свойств флуорофора и плазмонного ядра, обеспечивающей работоспособность метки в бимодальном режиме. в заложенных концепциях меток трех типов соблюдаются главные условия, необходимые для усиления сигнала КР и минимизации тушения флуоресценции. Предлагаемый сигнал для ГКР визуализации, полоса колебания тройной связи, в принципе является привлекательной для картирования с помощью КР микроскопии, т.к. находится в «тихой» области колебательного спектра. Предполагаемые к использованию красители (производные цианина и/или бордипиррометена) имеют высокий квантовый выход флуоресценции, что также будет способствовать интенсивной эмиссии разрабатываемых оптических меток.
Флуоресцентные метки на основе плазмонных наночастиц занимают отдельное место в разработках агентов биовизуализации. Они рассматриваются как одни из наиболее эффективных вследствие их интенсивного оптического отклика, легкой «настройки» на диапазон прозрачности биологических тканей и возможности вариации векторов доставки, нацеленных на различные биологические мишени [1-2]. Кроме того, такие системы могут применяться в тонкослойных ex vivo лабораторных исследованиях для анализа ДНК [3], для определения биомаркеров рака [4].
ГКР биовизуализация с помощью плазмонных меток в свою очередь тоже рассматривается как перспективный метод диагностики, отличающийся высокой информативностью вследствие способности давать информацию о физиологических процессах, протекающих в исследуемой области [5-7]. Более того, в 2014 году появилась первая публикация о реализованной на мыши операции по удалению опухоли головного мозга, проведенной при оптическом контроле с использованием ГКР меток и ручного КР сканера [8]. Разработка ГКР-меток ведется высокими темпами, на сегодняшний день предложено достаточно много систем на основе различных по морфологии плазмонных наночастиц и различных КР репортеров [9]. Соединения, наиболее часто используемые в в качестве репортеров в ГКР-метках, информативно представлены в свежем обзоре N. Ly и др. [10]. Можно отметить, что отличительной особенностью многих ГКР-меток является их способность выступать одновременно в качестве сенсоров на изменение различных физиологических параметров, прежде всего рН среды. В частности, это достижимо, когда 4-меркаптобензиновая кислота входит в состав метки, т.к. она имеет выраженную рH-зависимость ГКР спектров [11-12]. Стоит обратить внимание, что среди применяемых на сегодняшний день КР репортеров практически нет тех, которые бы обладали эмиссией в области 620-900 нм. Среди подобных единичных работ нужно отметить ГКР-метки, предложенные научной группой Аластера В. Уорка, содержащие красители класса цианинов, которые активны в диапазоне от 514 до 1064 нм [13]. Мультимодальные метки для диагностики и терапии занимают отдельное направление исследований. В текущий момент исследования в этой области сосредоточены на разработке мультимодальных меток, где в качестве основного средства выступает магнитно-резонансная томография, а сопутствующими являются другие методы диагностики, в частности флуоресцентная томография или ГКР спектроскопия. Примеры подобных МРТ-флуоресцентных меток и МРТ-ГКР меток можно найти в работах [14-153] и в работах [16-17], соответственно. Сообщений о бимодальных флуоресцентных-ГКР метках, демонстрирующих эффективность одной наноразмерной системы в обоих режимах визуализации, довольно скудное количество. Заявители проекта нашли лишь несколько примеров, заслуживающих внимания, в частности, работы [18-20]. Необходимо отметить, что заложенная в описанных бимодальных метках концепция отличается о предложенной в отношении каждого из трех типов разрабатываемых нами меток.
1. Farcau C., Craciun A.-M., Vallee R.A.L., Surface-enhanced fluorescence imaging on linear arrays of plasmonic half-shells // Journal of Chemical Physics, 2020. Т. 153, Т. 16, 164701.
2. Huang S., Qi, J., deQuilettes D.W., et al, M13 Virus-Based Framework for High Fluorescence Enhancement // Small, 2019, Т. 15 №, 28, 1901233.
3. Banaei N., Foley A., Houghton J.M., Sun Y., Kim B. Multiplex detection of pancreatic cancer biomarkers using a SERS-based immunoassay // Nanotechnology. Institute of Physics Publishing, 2017. Т. 28, № 45.
4. Xi C., Facal P., Xia H., Wang D. Directed self-assembly of gold nanoparticles into plasmonic chains // Soft Matter. Royal Society of Chemistry, 2015. Т. 11, № 23. С. 4562–4571.
5. Zhang W., Jiang L., Piper J.A., Wang Y., SERS Nanotags and Their Applications in Biosensing and Bioimaging // Journal of Analysis and Testing, 2018, Т. 2, № 1, С. 26-44.
6. Panikar S.S., Cialla-May D., De la Rosa E., Salas P., Popp J., Towards translation of surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) to clinical practice: Progress and trends // TrAC - Trends in Analytical Chemistry, 2021. Т. 134. 116122.
7. Campbell J.L., SoRelle E.D., Ilovich, O. et al, Multimodal assessment of SERS nanoparticle biodistribution post ingestion reveals new potential for clinical translation of Raman imaging // Biomaterials 2017. Т. 135. С. 42-52.
8. Karabeber H., Huang R., Iacono P., et al, Guiding brain tumor resection using surface-enhanced Raman scattering nanoparticles and a hand-held Raman scanner // ACS Nano. 2014. Т. 8. № 10. С. 9755-9766.
9. Fabris L., Gold-based SERS tags for biomedical imaging // Journal of Optics. 2015. Т. 17. № 11. 114002.
10. Ly N.H., Joo S.-W., Recent advances in cancer bioimaging using a rationally designed Raman reporter in combination with plasmonic gold // Journal of Materials Chemistry B. Т. 8. № 2. C. 186-198.
11. Cong V. T., Ganbold E. O., Saha J. K., Jang J., Min J., Choo J., Kim S., Song N. W., Son S. J., Lee S. B., Joo S. W., Gold nanoparticle silica nanopeapods // J. Am. Chem. Soc. 2014/ Т. 136. С., 3833–3841.
12. Li M., Kang J. W., Dasari R. R., Barman I., Shedding light on the extinction-enhancement duality in gold nanostar-enhanced Raman spectroscopy // Angew. Chem., Int. Ed. 2014. Т. 53. С. 14115–14119.
13. Alison M., Cunha-Matos C.A., Zagnoni M., Millington O.R., Wark A.W. Universal Surface-Enhanced Raman Tags: Individual Nanorods for Measurements from the Visible to the Infrared (514–1064 Nm) // ACS Nano, 2014. Т. 8, № 8. С. 8600–8609.
14. Deng Y., Xu A., Yu, Y., Fu, C., Liang, G. Biomedical Applications of Fluorescent and Magnetic Resonance Imaging Dual-Modality Probes // ChemBioChem. 2019. Т. 20. № 4. С. 499-510.
15. Ancira-Cortez A., Morales-Avila E., Ocampo-Garcia B.E., et al, Preparation and Characterization of a Tumor-Targeting Dual-Image System Based on Iron Oxide Nanoparticles Functionalized with Folic Acid and Rhodamine // Journal of Nanomaterials. 2017. 2017:5184167.
16. Zhang C., Xu Z., Di H., et al, Gadolinium-doped Au@prussian blue nanoparticles as MR/SERS bimodal agents for dendritic cell activating and tracking // Theranostics. 2020. Т. 10. № 13. С. 6061-6071.
17. Shi B., Zhang B., Zhang, et al, Multifunctional gap-enhanced Raman tags for preoperative and intraoperative cancer imaging // Acta Biomaterialia. 2020. Т. 104. С. 210-220.
18. Lin J., Graziotto M.E., Lay P.A.,New E.J., A bimodal fluorescence‐raman probe for cellular imaging // Cells. 2021. Т. 10. № 7. 1699.
19. Niu X., Chen H., Wang Y., et al, Upconversion fluorescence-SERS dual-mode tags for cellular and in vivo imaging // ACS Applied Materials and Interfaces. 2014. Т. 6. № 7. С. 5152-5160.
20. Nagy-Simon T., Tatar A.-S., Craciun A.-M., et al, Antibody Conjugated, Raman Tagged Hollow Gold-Silver Nanospheres for Specific Targeting and Multimodal Dark-Field/SERS/Two Photon-FLIM Imaging of CD19(+) B Lymphoblasts // ACS Applied Materials and Interfaces. 2017. ACS Applied Materials and Interfaces. Т. 9. № 25. С. 21155-21168.
Описание общего плана работ с детализированными методами и подходами и ожидаемые результаты приведены ниже.
Первый год:
Первый год Проекта будет посвящен разработке бимодальных плазмонных меток по типу 1, работы будут разбиты на несколько этапов.
1.1. Неорганический синтез плазмонных наночастиц с заданными оптическими свойствами, их подготовка к дальнейшей модификации. Для бимодальных меток 1 типа необходимы плазмонные ядра, обладающие двумя разнесенными полосами поглощения, причем в области 633 нм поглощение должно быть минимальным, а в области около 785 нм – максимальным. Подходящими субстратами в данном случае выступают золотые наностержни с аспектным соотношением не менее 3,5.
1.2. Модификация наночастиц флуорофорами, покрытие биосовместимой оболочкой, сопутствующие оптические исследования. Модификация наночастиц флуорофорами необходима для придания оптической активности создаваемым меткам. Другими словами, именно молекулы флуорофоров будут служить источником оптического сигнала при накачке лазерным излучением. В бимодальных метках по типу 1 в качестве флуорофоров будут использованы амино, малеимидные или NHS (активированные эфиры) производные цианина 5 (Cy 5), цианина 5.5 (Cy 5.5), бордипиррометена 630/650 (BDP 630/650) и/или другие флуоресцентные молекулы, имеющие амино, малеимидную или NHS эфирную группу и максимум возбуждения в диапазоне 620-650 нм. Для данного типа меток размещение флуорофора запланировано в первом-втором слое у поверхности наночастицы. Для внедрения флуорофора в оболочку наночастицы будет апробировано три подхода, среди которых для дальнейших работ будет выбран оптимальный. Отдельное внимание будет уделено выбору подходящей концентрации флуорофора. Нацеленность будет на концентрацию флуорофора в адсорбционных слоях, при которой еще не будет наблюдаться эффектов самогашения, в том числе за счет процессов агрегации молекул флуорофоров (с опорой на сопутствующие флуорометрические измерения). Количество адсорбировавшегося флуорофора будет оцениваться спектрофотометрически по разнице сигнала от фугата после центрифугирования наночастиц и от исходного раствора.
1.3. Конъюгация систем «ядро-оболочка» векторами доставки. Вектора доставки необходимы для селективной доставки флуоресцентных меток в раковые клетки.
1.4. Проверка эффективности разработанных оптических меток на отдельных клеточных линиях.
Второй год Проекта будет посвящен разработке бимодальных плазмонных меток по типу 2, работы также будут разбиты на несколько этапов.
2.1. Неорганический синтез плазмонных наночастиц с заданными оптическими свойствами, их подготовка к дальнейшей модификации. Для бимодальных меток 2 типа необходимы плазмонные ядра, максимум поглощения которых приходится на красную область спектра, в диапазоне от 620 до 650 нм. Подходящие оптические свойства имеют наночастицы с малым аспектным соотношением или шипованные структуры (нанозвезды и т.п.) с малой длиной выступов.
2.2. Модификация наночастиц флуорофорами, покрытие биосовместимой оболочкой, сопутствующие оптические исследования. Оптические метки по типу 2 отличаются тем, что: i) используется флуорофор с реакционно способной алкильной группой; ii) предполагают расположение флуорофора в двух слоях оболочки наночастицы: непосредственно у поверхности и на расстоянии около 3-5 нм. Двойное введение флуорофора необходимо для наблюдения сигнала ГКР от молекул, расположенных у поверхности, и сигнала флуоресценции от молекул, расположенных на удалении.
2.3. Конъюгация систем «ядро-оболочка» векторами доставки
На втором году проекта планируется расширить круг используемых векторов доставки. 2.4. Проверка эффективности разработанных оптических меток на отдельных клеточных линиях.
Третий год Проекта будет посвящен разработке бимодальных плазмонных меток по типу 3, работы также будут разбиты на несколько этапов.
3.1. Неорганический синтез плазмонных наночастиц с заданными оптическими свойствами, их подготовка к дальнейшей модификации. Для бимодальных меток 3 типа необходимы плазмонные ядра, отличающегося «широкополосным» поглощением. Подходящие оптические свойства имеют разветвленные (branched) структуры типа нанозвезд, наноцветов и т.п. с удлиненными выступами.
3.2. Модификация наночастиц флуорофорами, покрытие биосовместимой оболочкой, сопутствующие оптические исследования. Оптические метки по типу 3 отличаются тем, что имеют в своем составе два флуорофора с эмиссией в разных диапазонах, при этом оба флуорофора располагаются в двух слоях оболочки наночастицы также, как и в системах по типу 2. 3.3. Конъюгация систем «ядро-оболочка» векторами доставки
На третьем году проекта планируется расширить круг биологических мишеней. 3.4. Проверка эффективности разработанных оптических меток на отдельных клеточных линиях.
Научный задел по проекту состоит в десятилетнем опыте работы с наночастицами серебра/золота, за это время Соловьева Е.В. и её подопечные овладели широким набором методик их получения, имеют навыки тонкой «настройки» морфологических и оптических свойств путем осознанной вариации параметров синтеза. На основании большого опыта имеется хорошее представление физико-химических процессов формирования металлических наночастиц в растворе и предпосылок для обеспечения их агрегативной устойчивости. Соловьевой Е.В. с коллегами разработан ряд собственных методик получения плазмонных агломератов и систем ядро-оболочка [1-2]. Среди них есть методики по получению модифицированных наночастиц серебра/золота с использованием красителей стильбенового ряда [3-4] и цианиновых производных [5-6]. В рамках этих работ авторами неоднократно продемонстрирована эффективность внедрения флуорофоров в оболочку наночастицы посредством электростатической иммобилизации.
Основными инструментальными методами исследования, развиваемыми авторским коллективом проекта, являются Гигантское комбинационное рассеяние (surface-enhanced Raman scattering) и усиленная поверхностью флуоресценция (surface-enhanced fluorescence). Соответственно, есть глубокое понимание фундаментальных процессов, отвечающих за возникновение усиленного оптического отклика и его возможной специфики в случае адсорбции хромофоров на плазмонной поверхности. В частности, для амино- производного стильбена при адсорбции на наночастицах серебра выявлен перенос заряда металл-лиганд, приводящий к резонансному комбинационному рассеянию [7]. Совсем недавно Соловьевой Е.В. в коллаборации с группой Н. Джамшуди из ТУ им. Шарифа проведено экспериментально-теоретическое описание резонансного вклада в химический механизм ГКР, показана важность учета поправки Герцберга-Теллера [8]. Процессы переноса заряда могут оказывать положительное влияние на ГКР сигнал разрабатываемых в проекте меток и отрицательное влияние на их флуоресцентный отклик, поэтому понимание природы этих процессов является необходимым пререквизитом для «нахождения золотой середины» и выполнения задач проекта. Стоит отметить, что недавние исследования процессов переноса заряда металл-лиганд выполнены с использованием алкильных соединений, также планируемых к использованию в заявляемом проекте.
[1] E.V. Solovyeva, E. V. Ubyivovk, A. S. Denisova, Effect of diaminostilbene as a molecular linker on Ag nanoparticles: SERS study of aggregation and interparticle hot spots in various environments, Coll. Surf. A 528 (2018) 542-548 DOI: 10.1016/j.colsurfa.2017.11.040
[2] E.V. Solovyeva, D.A. Khazieva, L.A. Myund, A.S. Denisova, Surface Enhanced Raman Scattering By a New Derivative of Acridine in Solutions of Colloidal Silver, Optics and Spectroscopy, 2017, 122 (3) 435-439. DOI:10.1134/S0030400X17030183
[3] O. V. Odintsova, A. N. Smirnov, E. V. Solovyeva, Plasmonic nanoparticles modified by dimercaptostilbene for metamaterials. Proc. SPIE, 2019, 11025, 1102512 doi:10.1117/12.2520783
[4] A.N. Smirnov, O.V. Odintsova, A.S. Strelnikov, A.I. Shevchuk, E.V. Solovyeva. SERS spectroscopy and quantum-chemical calculations of stilbene amino derivatives in conditions of adsorption on silver nanoparticles. Proc. SPIE 11345, Nanophotonics VIII (2020) 1134522 doi.org/10.1117/12.2553935
[5] A. N. Smirnov, V. O. Svinko, A. S. Strelnikov, A. I. Shevchuk, A. V. Volkova, E. V. Solovyeva, Silica coated plasmonic nanobone-based tags for safe bioimaging, PHOTOPTICS 2022 - Proceedings of the 10th International Conference on Photonics, Optics and Laser Technology, 2022, приняты к печати
[6] Smirnov, A.N., Odintsova, O.V., Lashkul, V.V., Sharoiko, V.V., Solovyeva, E.V., Noble metal nanoparticles modified by cyanines and stilbenes for enhanced signal optical tomography and hyperthermal therapy, Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE, 2021, 11919, 119192E. https://doi.org/10.1117/12.2615046
[7] E.V. Solovyeva, Surface enhanced Raman scattering of 4,4'-diaminostilbene: dependence of spectral features and resonant enhancement on surface coverage, Journal of Raman Spectroscopy 50 (5) (2019) 647-655. DOI: 10.1002/jrs.556
[8] Z. Jamshidi, S. Ashtari-Jafari, A. Smirnov and E. Solovyeva, Role of Herzberg–Teller Vibronic Coupling in Surface-Enhanced Resonance Raman Spectra of 4,4′-Diaminotolane with Nearly Close Molecular and Charge-Transfer Transitions, J. Physical Chemistry C 125 (2021) 17202 DOI: 10.1021/acs.jpcc.1c04524