В соответствии с поставленными задачами, на данном этапе работы был проведён анализ полиморфизма регулируемых нитратом пептидов CLE и CEP у люцерны слабоусеченной Medicago truncatula и у гороха посевного Pisum sativum. Для анализа были выбраны четыре гена люцерны (MtCLE12, MtCLE13, MtCLE34, MtCLE35). Экспрессия этих генов активируется в азотфиксирующих клубеньках и, в случае MtCLE34 и MtCLE35, при обработке корней растений нитратом). Был проведён анализ сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в последовательностях генов люцерны у 262 линий M. truncatula, последовательности которых доступных в базе данных HapMap http://www.medicagohapmap.org/. В последовательности гена MtCLE13 были обнаружены только синонимичные замены, тогда как в генах MtCLE12, MtCLE34 и MtCLE35 выявлены как синонимичные, так и несинонимичные замены, что может указывать на консервативную роль гена MtCLE13 и значимость его функции для жизнедеятельности растения. Кроме того, у четырех линий (линии HM101 (линия A17), HM256, HM038 и HM058 из базы HapMap) был обнаружен стоп-кодон в гене MtCLE34, наличие которого должно приводить к синтезу укороченного нефункционального продукта без функционального домена CLE. Таким образом, данные линии, которые включают в том числе и линию HM101 (A17), наиболее широко используемую в лабораторных условиях линию для изучения симбиотических реакций, являются природными мутантами по гену MtCLE34. У другой лабораторной линии M. truncatula, линии R108, согласно последовательностям, представленным в базе данных HapMap, стоп-кодон отсутствует, и таким образом, у линии R108 ген CLE34 может кодировать функциональный продукт.
В рамках данной работы мы также предприняли попытку оценить, существуют ли возможные ассоциации SNP в геномных участках, включающих гены MtCLE12, MtCLE13, MtCLE34 и MtCLE35, с количеством образующихся клубеньков. Предполагалось, что SNP, приводящие к изменению уровня активности данных генов, могут оказывать влияние на количество формируемых растением клубеньков. Анализ был проведён посредством полногеномного поиска ассоциаций (Genome-wide association study, GWAS). Этот подход позволяет выявить участки генома, полиморфизм в которых демонстрирует ассоциации с проявлением изучаемого признака. В нашей работе с помощью GWAS в программе Tassel мы провели поиск ассоциаций наличия SNP в участках генома, включающих кластеры генов CLE (для MtCLE12 и MtCLE13 - в хромосоме 4, MtCLE34 и MtCLE35 в хромосоме 2), с количеством образующихся клубеньков на корнях разных линий M. truncatula. В результате проведенного анализа были построены графики Manhattan plot, отражающие вероятностное распределение участков кластеров генов CLE с SNP на хромосомах 2 и 4, и их связь с фенотипическими характеристиками – количество клубеньков в верхней части корневой системы (nodule_above) и в нижней части корневой системы (nodule_below). Было установлено, что в позиции 39236000 и соседних точках на хромосоме 2 SNP имеют сильную связь с количеством образующихся клубеньков в верхней части корневой системы. Выявленная область генома расположена перед кодирующей последовательностью гена MtCLE34, и возможно, включает в себя регуляторные элементы, влияющие на его уровень экспрессии. В то же время, для областей генома люцерны, включающих гены MtCLE12 и MtCLE13, не было выявлено SNP, демонстрирующих высокие показатели степени ассоциации с количеством образующихся клубеньков.
Подобная работы была также проведена для гороха посевного. На предыдущем этапе работы в ходе анализа генома гороха были определены последовательности серии генов семейств CLE и CEP гороха посевного. На данном этапе работы была предпринята попытка проведения анализа ассоциаций аллельного состояния некоторых генов из этих семейств с проявлением хозяйственно значимых признаков (масса растений, масса семян, количество семян, содержание в семенах азота и фосфора). Эти признаки были оценены в проведенном ранее вегетационном эксперименте на 99 генотипах культурного гороха. Для анализа были выбраны три гена, гомологичные генам люцерны, для которых был проведен подобный анализ, - гены PsCLE12, PsCLE13 и PsCLE34. В результате секвенирования кодирующих последовательностей данных генов на выборке из 99 генотипов гороха различий между последовательностями этих генов у разных генотипов выявлено не было. Вероятно, это связано с сильным давлением отбора, действовавшего на гены PsCLE12, PsCLE13 и PsCLE34 в недавней эволюционной истории вида горох посевной, а также с относительно небольшим размером данных генов. Соответственно, проведение ассоциативного анализа оказалось невозможным ввиду отсутствия полиморфных сайтов в исследованных частях генов. Вероятно, анализ полиморфизма промоторных областей этих и других генов на указанной выборке из 99 генотипов гороха может оказаться полезным для выявления ассоциаций с хозяйственно ценными признаками.
В ходе работы был также проанализирован полиморфизм гена PsSym29, кодирующего рецепторную киназу, являющуюся рецептором CLE-пептидов у гороха посевного. В результате была выявлена серия полиморфных сайтов в пределах кодирующей части гена PsSym29. В шести сайтах нуклеотидные замены являются несинонимичными (т.е. влияющими на аминокислотную последовательность предполагаемого белка). Проведенный анализ ассоциаций не позволил выявить статистически достоверной связи аллельного состояния гена PsSym29 с проявлением изученных хозяйственно значимых признаков.
В рамках выполнения задачи по выявлению генов, работа которых изменяется в ответ на действие нитрата, были собраны образцы корней люцерны и гороха после обработки нитратом калия (10 mM KNO3) для транскриптомного анализа экспрессии генов в корнях растений. Обработку нитратом в случае люцерны проводили в гидропонной системе, в случае гороха – на чашках Петри с агаризованной средой с добавлением нитрата. В качестве контроля использовали корни растений, выращенных в аналогичных условиях, но без добавления нитрата. Для выделения РНК для транскриптомного анализа было взято по три контрольных образца и по три образца растений после нитратной обработки, каждый образец включал корни от трех растений.
На основе РНК, выделенной из корней люцерны, были приготовлены библиотеки для 3’MACE-секвенирования по протоколу производителя GenXPro GmbH (Франкфурт-на-Майне, Германия). Транскриптомный анализ с использованием РНК, выделенной из корней гороха после нитратной обработки, проводили в Ресурсном центре СПбГУ «Центр Биобанк», с помощью прибора HiSeq4000 по технологии Illumina в режиме парных прочтений. После обработки “сырых” прочтений (их обрезки и объединения парных прочтений) для каждого образца было получено от 14,8 до 29,73 млн прочтений, при этом их длина составила от 75 до 118 нуклеотидов. Выравнивание прочтений на референсный геном проводили с помощью программы HISAT2. В качестве референса использовали две разные сборки генома гороха: геном Pisum_sativum_v1a https://urgi.versailles.inra.fr/download/pea/, а также геном гороха линии Frisson, полученный в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ФГБНУ ВНИИСХМ.
В ходе оценки дифференциально экспрессирующихся генов с помощью программы DESeq2 с пороговыми значения p-value (adjusted p-value) и log2 fold change (кратность изменения уровней экспрессии), равным 0,01 и 1,0, соответственно, и при использовании в качестве референса генома Pisum_sativum_v1a французской сборки был выявлен 101 дифференциально экспрессирующийся ген, в том числе 45 генов с повышенной экспрессией, и 56 генов с пониженной экспрессией в образцах после нитратной обработки. На следующем этапе работы будет проведена более детальная функциональная классификация выявленных дифференциально экспрессирующихся генов с целью выявления среди них маркеров ответа на нитрат.
В ходе предыдущего этапа выполнения работы нами было показано, что продукт гена люцерны MtCLE35, регуляторный пептид семейства CLE, способен осуществлять опосредуемое нитратом ингибирование развития клубеньков. Для выяснения механизмов действия пептида MtCLE35 и поиска мишеней пути, им активированного, нами был проведен транскриптомный анализ трансгенных корней со сверхэкспрессией гена MtCLE35. В качестве материала для анализа мы использовали трансгенные корни со сверхэкспрессией гена MtCLE35 (MtCLE35_oe), в качестве контроля – корни растений со сверхэкспрессией гена GUS (GUS_oe), кодирующего репортерный ген бета-глюкуронидазы. РНК выделяли из трансгенных корней через 12 дней после инокуляции ризобиями, для каждого варианта эксперимент проводили в трех повторностях. Транскрптомный анализ проводили с помощью технологии MACE (Massive Analysis of cDNA Ends).
Полученные риды выравнивали на референсный геном люцерны M. truncatula версии 4.0 (сборка MedtrA17_4.0) c помощью программы HISAT2 2.0.5 (https://daehwankimlab.github.io/hisat2/), количественную оценку транскриптов проводили с помощью программы Stringtie 1.2.4 8 (http://www.ccb.jhu.edu/software/stringtie/). Дифференциально экспрессирующиеся гены (ДЭГ) выявляли с помощью пакета DESeq2 (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) как гены, демонстрирующие двухкратное изменение уровней экспрессией (log2 fold change >|1|) при уровне значимости откорректированного значения p-value <0.05. Анализ и визуализацию данных проводили в программе R-studio.
Всего при сравнении образов GUS-oe и MtCLE35-oe было выявлено 889 дифференциально экспрессирующихся генов, из них 714 генов со сниженной экспрессией и 175 генов – с повышенной экспрессией при в варианте со сверэкспрессией MtCLE35. В образцах MtCLE35-oe максимальное увеличение уровня экспрессии было выявлено прежде всего для самого гена MtCLE35 (Medtr2g091125), что подтверждает эффективность работы конструкции для сверхэкспрессии этого гена в трансгенных корнях. Был произведен анализ обогащенных групп Gene Ontology (Biological process, Molecular function, Cellular component) с помощью классификатора Medicago Classification Super Viewer (http://bar.utoronto.ca/ntools/cgi-bin/ntools_classification_superviewer_medicago.cgi). Среди биологических процессов (Biological process) значительное обогащение продуктами генов с повышенной экспрессией в образцах MtCLE35-ое было обнаружено для метаболических процессов и белкового метаболизма. Среди клеточных компонентов (Cellular component) обогащенными продуктами генов с повышенной экспрессией в значительной степени оказались компоненты клеточной стенки (Cell wall). Таким образом, конститутивная активация гена MtCLE35, продукт которого, помимо клубенькообразования, вероятно, опосредует и другие нитрат-зависимые реакции у растений, приводит к значительным метаболическим изменениям. В дальнейшем, мы планируем проанализировать экспрессию выявленных дифференциально экспрессирующихся генов с помощью количественной ПЦР, а также провести оценку метаболомный анализ и оценку содержания азота в тканях трансгенных растений со сверхэкспрессией гена MtCLE35.
Сверхэкспрессия гена MtCLE35 в корнях приводит к практически полному подавлению развития симбиотических клубеньков. Выявленное нами значительное число генов (714 генов, около 80% от всех ДЭГ), экспрессия которых подавляется в образцах в образцах MtCLE35-oе, согласуется с ролью продукта этого гена как ингибитора клубенькообразования. Среди дифференциально экспрессирующихся генов, экспрессия которых значительно снижена в образцах – ключевые гены-регуляторы симбиотических клубеньков, кодирующие транскрипционные факторы NIN (NODULE INCEPTION), NSP1 (NODULATION SIGNALING PATHWAY 1), NF-YA1/HAP2, а также ERN1 (ETHYLENE-RESPONSIVE TRANSCRIPTION FACTOR 1) (см. рисунок 5, рисунок А.5 Приложения, таблица А.5 Приложения). Гены, кодирующие данные транскрипционные факторы, активируются с участием компонентов сигнального каскада, индуцируемого ризобиями. При этом следует отметить, что статистически значимого снижения экспрессии генов, кодирующих рецепторы Nod-факторов (NPF и LYK3), а также генов, кодирующих компоненты сигнального каскада, кальций/кальмодулин-зависимую киназу DMI3 (DOESN'T MAKE INFECTIONS 3) не наблюдалось.
Таким образом, регуляторный путь, активируемый пептидом MtCLE35, блокирует развитие симбиотических клубеньков за счет подавления уровней экспрессии генов ключевых транскрипционных факторов, регулирующих программу симбиоза, но при этом не затрагивает самые ранние этапы, связанные с рецепцией Nod-факторов. В отличие от этого, согласно проведенному ранее транскриптомному анализу корней со сверхэкспрессикй MtCLE13 среди генов-мишеней пути, активируемого пептидом MtCLE13, выявлен ген NFP, кодирующий рецептор Nod-фактора. Таким образом, пептиды MtCLE13 и MtCLE35, действуя через общий компонент рецепторного комплекса, рецепторную киназу MtSUNN, опосредуют подавление развития симбиотических клубеньков, но при этом действуют на разные этапы реализации симбиотической программы: MtCLE13 действует на самых ранних этапах взаимодействия, подавляя рецепцию Nod-факторов, тогда как MtCLE35 осуществляет блок программы симбиоза на чуть более поздних ее этапах, подавляя активность генов ключевых транскрипционных факторов, регулирующих развитие симбиотического клубенька и бактериальной инфекции.
Также за отчётный период была проведена работа по оптимизации методики генетической трансформации гороха посевного. На предыдущем этапе работы нами были получены конструкции для сверхэкспрессии генов гороха PsCLE12, PsCLE13 и PsCEP10. На данном этапе работы полученные конструкции (PsCLE12-ое, PsCLE13-ое и PsCEP10-oe) были введены в штамм A. rhizogenes Arqua-1 и использованы для трансформации проростков гороха. В качестве контроля использовали конструкцию GUS-oe.
Для трансформации гороха проводили способом, позволяющим сохранить собственную корневую систему растения. Трёхдневные проростки гороха помещали на чашки Петри, содержащие среду Farhaeus, по четыре проростка на чашку. С помощью иглы от шприца с нанесенной суспензией агробактерий, осуществляли укол в верхней части корня, и дополнительно наносили суспензию агробактерий в область укола. Через примерно 7 дней в области укола наблюдали формирование каллуса, и на этом сроке растения переносили в горшки с вермикулитом. Из каллусов впоследствии формировались трансгенные корни, которые отбирали по флуоресценции репортерного белка GFP.
С помощью количественной ПЦР в реальном времени на матрице кДНК, полученной из трансгенных корней, было подтверждено наличие высоких уровней экспрессии генов PsCLE12, PsCLE13 и PsCEP10 в соответствующих вариантах.

Финансирование из внешних по отношению к СПбГУ источников:
РФФИ 20-016-00129 А «Изучение новых компонентов системы авторегуляции клубенькообразвания и ответа на нитрат у бобовых» (1150000.00 руб)
РФФИ 19-316-51014 «Симбиогеномика»: генетическая и метаболическая интеграция в надорганизменной симбиотической системе «горох посевной - клубеньковые бактерии» (5000000.00 руб)