В соответствии с поставленными задачами, на данном этапе работы было проведено секвенирование геномов четырех линий гороха посевного. Сырые данные секвенирования были получены путем прочтения библиотек на одной дорожке прибора Illumina NovaSeq6000 в режиме 2x150, paired end. С использованием полученных данных были идентифицированы гены, кодирующие пептиды CLE и CEP, и описано их разнообразие. В референсном геноме гороха сорта Frisson с использованием программы SPADA были идентифицированы 15 последовательностей гороха, кодирующих CEP-пептиды, и 48 последовательностей, кодирующих пептиды CLE. Для большинства последовательностей были идентифицированы их ближайшие гомологи в геноме люцерны слабоусеченной Medicago truncatula. С использованием информации, представленной в открытых базах данных (NCBI, EMBL) и экспрессионном атласе гороха был проведен анализ экспрессии выявленных генов в корнях, клубеньках, побегах, листьях и бобах гороха. Был выявлен кластер генов CLE у гороха, демонстрирующих специфичную экспрессию в клубеньках. Этот кластер включает гены PsCam040702 (PsCLE13), PsCam040984 (PsCLE12-like), PsCam041632 (PsNIC-like), которые являются ближайшими гомологами тех генов CLE, для которых ранее была продемонстрирована роль в регуляции клубенькообразования у других бобовых растений.
На следующем этапе был оценен уровень экспрессии генов PsCam040702 (PsCLE13), PsCam041632 (PsCLE12), PsCam040984 (PsCLE12-like) и PsCam041632 (PsNIC-like) в развивающихся примордиях клубеньков у гороха линии Frisson на 7 и 14 день после инокуляции ризобиями с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Для всех проанализированных генов были выявлены относительно высокие уровни экспрессии в формирующихся клубеньках, по сравнению с неинокулированными корнями. Далее, была проанализирована экспрессия генов CLE в ответ на обработку нитратом (10 mM KNO3) в течение 24 часов. Экспрессия генов PsCam041632 (PsCLE12) и PsCam041632 (PsNIC-like) усиливалась при обработке нитратом, тогда как значительных изменений в уровнях экспрессии гена PsCam040984 при нитратной обработке по сравнению с контролем обнаружено не было. Согласно полученным данным, экспрессия генов PsCam041632 (PsCLE12) и PsCam041632 (PsNIC-like) усиливается при добавлении нитрата в 5,5, 2,5 и 5 раз, соответственно.
Среди генов люцерны для более детального изучения характера экспрессии и функции были выбраны два гена, MtCLE34 и MtCLE35, которые, согласно полученным нами данным, экспрессируются в развивающихся клубеньках. При этом, при обработке нитратом (10 mM KNO3) в течение 24 часов наблюдалось значительное увеличение экспрессии генов MtCLE34 и MtCLE35 (в среднем в 57 и 25 раз, соответственно), по сравнению с контролем, хотя экспрессия генов MtCLE12 и MtCLE13, специфичных для клубеньков, не изменялась значительно при обработке нитратом.
Для исследования роли генов CLE и CEP в развитии симбиотических клубеньков у люцерны и гороха на данном этапе были созданы конструкции для их сверхэкспрессии. Кодирующие области генов люцерны MtCLE34, MtCLE35, MtCEP17 MtCEP16, а также генов гороха PsCam040702 (PsCLE13), PsCam041632 (PsCLE12), PsCam040984 (PsCLE12-like) и PsCam041632 (PsNIC-like) были клонированы в векторах ввода pDONR221 или pDONR207, секвенированы, и затем помещены с помощью клонирования Gateway в вектор назначения pB7WG2D под контроль конститутивного промотора 35S.