Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.

Заболевания нервной системы включают широкий спектр патологий, часть из которых вызывает повреждения нейронов или их дегенерацию. В результате это может приводить к нарушениям памяти, моторных функций, а также к развитию психических расстройств. Среди наиболее известных и распространённых примеров нейродегенерации – болезнь Альцгеймера, Паркинсона (далее БП), Хантингтона, боковой амиотрофический склероз и т. д. Развитие этих заболеваний ассоциировано с возрастом, а частота их возникновения неуклонно увеличивается во многих странах вместе с продолжительностью жизни населения. По оценкам ВОЗ к 2040 году в развитых странах эти заболевания могут выйти на первое место по количеству новых случаев, опередив даже рак.
В большинстве случаев при возникновении перечисленных заболеваний в организме происходит накопление белковых агрегатов, чаще всего обладающих амилоидными свойствами. Отсутствие точного понимания механизмов токсичности амилоидных агрегатов является важной причиной отсутствия эффективной терапии для этих болезней. Некоторые гипотезы связывают эффекты этих патологий с взаимодействием между амилоидами и другими белками. В этой связи крайне актуальной является концепция «амилоидных сетей» или «амилоидного каскада», обнаруженная в связи с болезнью Альцгеймера, при которой наблюдается амилоидная агрегация по крайней мере двух белков: Abeta и tau. Белок tau также обнаруживают в составе агрегатов, формирующихся при БП и Крейцфельдта-Якоба.
В последнее время стали накапливаться данные о влиянии бактериальной микрофлоры на развитие некоторых нейродегенеративных заболеваний, в частности БП. Работы нескольких последних лет показали, что одним из механизмов, лежащим в основе этого процесса является коагрегация бактериального амилоида CsgA и альфа-синуклеина (aSyn). Вероятно, этот пример не единственный, среди прокариот уже сейчас известно большое количество белков с амилоидными свойствами. Это показывает, что поиск аналогичных примеров коагрегации бактериальных амилоидов и белков человека является актуальной задачей. А полученные результаты позволят расширить спектр факторов риска развития амилоидозов человека. При этом появится очевидная возможность предотвращения этого процесса благодаря использованию специально подобранных антимикробных препаратов. Исследование молекулярных механизмов коагрегации белков является необходимым для создания специфических ингибиторов этого процесса.
На сегодняшний день известно большое количество различных амилоидозов человека. При этом существует точка зрения, что фактически любой белок может агрегировать при определённых условиях. Таким образом, нельзя исключить, что кроме уже известных амилоидозов, есть и другие примеры патологий, связанные с агрегацией белков. В нашей лаборатории впервые получены доказательства, что адаптерный белок синтазы оксида азота 1 может агрегировать при сверхпродукции в культуре клеток человека. Сверхэкспрессия гена NOS1AP продемонстрирована у больных шизофренией, а также происходит при повреждении спинного мозга. Эти факты демонстрируют актуальность анализ биологической роли агрегации белков человека.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб
Работа по проекту будет направлена на решение двух задач.
1. Поиск новых примеров коагрегации белков и изучение молекулярных механизмов этого процесса. В рамках проекта мы проведём масштабный анализ протеомов (не мене 500) бактерий с целью выявить белки, которые могут способствовать агрегации альфа-синулеина (aSyn). Для этого будет использована уникальная программа AmyloComp. В дополнение к биоинформатическому анализу будет проведена экспериментальная проверка полученных результатов. Для этого мы планируем отработать специальную методику, основанную на проверке возможности ускорения агрегации белка интереса в присутствии клеток, несущих амилоидные агрегаты на своей поверхности. Отдельной подзадачей будет описание механизмов коагрегации белков в составе амилоидов, а именно изучение роли ионных взаимодействий в этом процессе. Результаты этих экспериментов позволят предложить специфические ингибиторы для коагрегации aSyn с бактериальными белками.
2. Роль сверхпродукции и агрегации NOS1AP в гибели нервных клеток и развитии симптомов шизофрении у модельных объектов.
В нашей лаборатории были получены данные, что белок NOS1AP способен агрегировать в культуре клеток человека при сверхпродукции. Согласно различным исследованиям, ген этого белка, а также его повышенный уровень экспрессии ассоциированы с шизофренией. Это психологическое заболевание со сложной этиологией является одной из наиболее частных причин инвалидности в мире (входит в первые 15). Кроме этого, белок NOS1AP вовлечён в целый ряд клеточных процессов, которые могут приводить к гибели нейронов. Такими образом, комплексная проверка токсических эффектов агрегатов NOS1AP, а также их формирования при развитии симптомов шизофрении является актуальной задачей. Это может продемонстрировать новый молекулярный механизм, который лежит в основе этого заболевания. Стоит подчеркнуть, что сведения об уровне продукции этого белка в модельных животных и тем более у пациентов отсутствуют. Отдельной подзадачей будет описание полного интерактома NOS1AP в агрегированной и мономерной форме.
В заключение необходимо отметить, что решение сформулированных задач является комплексным и опирается на использование современных мультидисциплинарных подходов, а также разнообразных релевантных модельных систем от бактерий до млекопитающих.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов
Масштабные исследования феномена коагрегации белков бактерий и человека на сегодняшний день практически не проводятся. Это подчёркивает уникальность представленного проекта. Идентификация новых бактериальных амилоидов, вовлечённых в развитие амилоидозов человека, открывает перспективы для новых подходов к лечению и превентивных мер против соответствующих заболеваний.
В ходе проекта будут выявлены новые амилоидогенные белки бактерий. Судя по литературным данным, количество амилоидов бактерий гораздо выше, чем у эукариот, очевидно, что описана лишь небольшая часть этого разнообразия. Поэтому с учётом масштаба нашего анализа мы рассчитываем описать новые амилоиды бактерий.
Уникальным результатом также может стать получение искусственных гетероагрегатов на основе пептидов. Это откроет новые возможности для контроля роста амилоидных агрегатов и создания ингибиторов коагрегации белков.
В рамках проекта будут получены новые результаты о роли белка NOS1AP в гибели нервных клеток и развитии симптомов шизофрении у модельных объектов. В частности. мы впервые проанализируем токсические свойства агрегатов NOS1AP и уровень продукции этого белка при развитии шизофрении. Также впервые будет проведена детальная характеристика интерактома NOS1AP в масштабах всего протеома.
Имеющийся у руководителя и коллектива опыт работы как в сфере биоинформатики, так и молекулярной биологии, гарантирует успешное выполнение поставленных задач. Кроме этого, коллектив исполнителей имеет доступ ко всему необходимому оборудованию.

Современное состояние исследований по данной проблеме
Развитие многих нейродегенеративных заболеваний связано с образованием и накоплением белковых агрегатов, которые обладают амилоидными или амилоидоподобными свойствами. Важным свойством таких комплексов является их способность индуцировать переход такого же белка из растворимой формы в агрегированную. В системе in vitro такой “эффект затравки” показан практически для всех известных амилоидов. Для живых организмов это также справедливо, по меньшей мере, в случае инфекционных амилоидов, называемых прионами (Prusiner, 2013, PMID: 24274755)⁠. С другой стороны, известен феномен коагрегации, при котором амилоиды одного белка индуцируют конформационный переход другого. На сегодняшний день уже известен ряд подобных примеров, и становится очевидно, что это явление может оказывать существенное влияние на процесс амилоидогенеза, активируя или подавляя его, что подтверждается большим количеством публикаций. Например, белок CsgB ускоряет агрегацию белка CsgA. Оба этих белка формируют экстраклеточные выросты бактерий (curli), необходимые для образования биоплёнок. В то же время белок CsgC является ингибитором этого процесса (Van Gerven et al., 2015, PMID: 26439293)⁠. Ещё одним примером функциональной коагрегации белков в составе амилоидов является пара белков Rip1 и Rip3. Их агрегация является одним из сигналов для запуска процессов некролиза (J. Li et al., 2012, PMID: 22817896)⁠. Стоит отметить, что ключевую роль в этом процессе играют аминокислотные мотивы RHIM этих белков, которые также обнаружены у белка Het-s, способного формировать амилоидные агрегаты (Kajava et al., 2014, PMID: 25500536)⁠. Таким образом, нельзя исключить, что и другие белки, обладающие RHIM, способны коагрегировать. Помимо этого, известны также многочисленные примеры коагрегации белков, связанных с различными амилоидозами человека, в частности, показана коагрегация следующих белков: амилоида бета и tau (Spires-Jones et al., 2017, PMID: 28401333)⁠, амилоида бета и альфа-синуклеина (aSyn) (Ono et al., 2012, PMID: 22734715)⁠, амилоида-бета и амилина (Hu et al., 2015, PMID: 26255739)⁠, амилоида бета и PrP (Laurén et al., 2009, PMID: 19242475)⁠(Rubel et al., 2013, PMID: 24152606)⁠.
В ходе работы нашей лаборатории впервые было показано, что NOS1AP (или CAPON), адаптерный белок синтазы оксида азота 1 (NOS1), образует детергент-устойчивые агрегаты в культуре клеток человека HEK293T при сверхпродукции. Интерес к этому белку был связан с тем, что, согласно биоинформатическим предсказаниями, он является потенциальным амилоидом, а также физически взаимодействует с aSyn. Последнее было выявлено в ходе масштабного протеомного скрининга (Hein et al., 2015, PMID: 26496610)⁠ и подтверждено в нашей лаборатории (рис. 1C). NOS1AP участвует в развитии различных патологий нервной системы (J. Wang et al., 2016, PMID: 27237129)⁠. Увеличение экспрессии NOS1AP также происходит в ответ на повреждение спинного мозга у крыс. Предполагается, что этот факт может быть взаимосвязан с последующей гибелью нейронов. При этом на гистологических срезах нервных волокон в месте повреждения детектируют скопления этого белка (Cheng et al., 2008, PMID: 18074109)⁠. Этот результат может служить подтверждением формирования агрегатов NOS1AP in vivo, а также их нейротоксического эффекта. Кроме этого, есть свидетельства, позволяющие связать NOS1AP с нейродегенерацией при развитии болезней Хантингтона и Альцгеймера (J. Wang et al., 2016, PMID: 27237129)⁠. Наконец, недавно было показано, что увеличение количества NOS1AP индуцирует агрегацию белка tau, а также нейродегенерацию (Hashimoto et al., 2019, PMID: 31160584)⁠.
Белок NOS1AP физически взаимодействует с NOS1. Этот комплекс образуется за счёт C-терминального участка NOS1AP и PDZ домена NOS1 (Jaffrey et al., 1998, PMID: 9459447)⁠. Белок NOS1 отвечает за продукцию NO в нейронах. Он образует гомодимеры, а для его активации и синтеза NO также требуется взаимодействие с кальмодулином и ионами кальция. Кроме этого NOS1 взаимодействует с PSD95, что приводит к сближению синтазы и NMDA-рецептора на постсинаптическом уплотнении глутаматэргических нейронов. В ответ на связывание с лигандом этот рецептор приводит к притоку ионов кальция внутрь клетки. В результате, комплекс NOS1/PSD95/NMDA-рецептор обеспечивает синтез NO, в ответ на активацию рецептора (F. Freudenberg et al., 2015, PMID: 25612209)⁠. PDZ домен NOS1 также обуславливает взаимодействие NOS1 с другими белками с PDZ доменами, в частности PSD95. Таким образом, NOS1AP и PSD95 конкурируют друг с другом за связывание nNOS1 (Jaffrey et al., 1998, PMID: 9459447)⁠. Кроме этого, белок взаимодействует и с рядом других белков. Среди них Scribble и YAP, которые являются компонентами сигнального пути Hippo (контролирует пролиферацию клеток и их дифференцировку) (Clattenburg et al., 2015, PMID: 25918243)⁠. Взаимодействие NOS1AP с белком CPE предположительно играет важную роль в развитии дендритов (Candemir et al., 2016, PMID: 26861996; Carrel et al., 2009, PMID: 19553464)⁠. N-терминальный участок NOS1AP (PTB домен) может напрямую взаимодействовать с белком Dexras1 (Fang et al., 2000, PMID: 11086993)⁠, который в свою очередь вовлечён в контроль циркадных ритмов, гомеостаза железа в нейронах, а также NMDA/NO-опосредованную нейротоксичность (J. Wang et al., 2016, PMID: 27237129)⁠. PTB-домен также взаимодействует с белками синапсинами (Jaffrey et al., 2002, PMID: 11867766)⁠. С другой стороны, NOS1AP участвует в сигнальном пути nNOS-p38MAPK, вовлечённом в эксайтотоксичность (токсичность возбуждающих нейротрансмиттеров, например, глутамата) - явлении, описанном для многих нейродегенеративных процессов, и физически взаимодействует с киназой MKK3 (L. L. Li et al., 2013, PMID: 23658158)⁠. Таким образом, этот белок вовлечён в различные процессы, которые могут приводить к гибели нервных клеток. В свою очередь, возникает вопрос о роли его агрегации в этом процессе.
В литературе существуют данные об ассоциации мутаций в гене NOS1AP с развитием шизофрении (Brzustowicz et al., 2004, PMID: 15065015; Miranda et al., 2006, PMID: 16364597; Zheng et al., 2005, PMID: 15707951) и биполярного расстройства (F. Freudenberg et al., 2015, PMID: 25612209)⁠, а также показано, что его экспрессия повышена у больных (Hadzimichalis et al., 2010, PMID: 20605702; Xu et al., 2005, PMID: 16146415)⁠. Мы предполагаем, что последнее может приводить к агрегации NOS1AP. Этот процесс сам по себе, либо за счёт включения в состав агрегатов NOS1AP других белков, может нарушать внутриклеточный сигналинг и, как следствие, вносить вклад в патологическую картину при шизофрении. В недавних работах на трансгенных мышах было показано, что сверхпродукция NOS1AP приводит к усилению взаимодействия NOS1 и PSD95 (Florian Freudenberg et al., 2021, PMID: 34455393)⁠. Эти данные входят в противоречие с данными о конкуренции NOS1AP и PSD95 за взаимодействие с NOS1 (Jaffrey et al., 1998, PMID: 9459447)⁠. Однако наши данные о возможности агрегации NOS1AP позволяют объяснить это через инактивацию белка в составе агрегатов.
Для исследования шизофрении зачастую используют животные модели. Внутрибрюшинные инъекции дизоцилпина (MK-801) - блокатора NMDA-рецептора, вызывают развитие характерных симптомов (в частности, увеличение локомоторной активности) у крыс и мышей и являются одним из наиболее распространённых подходов к изучению шизофрении (Eyjolfsson et al., 2006, PMID: 16517016; Morales-Medina et al., 2021, PMID: 33865887)⁠. С помощью этого воздействия удаётся добиться изменения поведения животных, а также вызвать характерные изменения структур ЦНС (Wu et al., 2016, PMID: 26917273)⁠. Обработка культуры клеток нейробластомы дизоцилпином снижает их жизнеспособность (Zhu et al., 2016, PMID: 26055227)⁠. Информация об экспрессии и продукции NOS1AP в этих моделях отсутствует, и мы планируем исследовать этот вопрос в рамках проекта.
Кроме примеров коагрегации белков одного организма в последнее время появляются данные о возможности коагрегации белков разных видов. Более подробно этот вопрос мы хотели бы осветить на примере БП. Отложения aSyn обнаруживают не только в ЦНС, но и в энтеральной нервной системе у пациентов с БП (Shannon et al., 2012, PMID: 22550057; Stokholm et al., 2016, PMID: 27015771; Wakabayashi et al., 1988, PMID: 2850698)⁠. В ряде работ было высказано предположение, что неверная укладка aSyn может происходить в нервной системе, обеспечивающей иннервацию кишечника, за счёт экзогенных факторов (Lionnet et al., 2018, PMID: 29039141; Stokholm et al., 2016, PMID: 27015771)⁠. В дальнейшем переносе агрегатов aSyn в ЦНС и распространении патологии, ассоциированной с БП, предположительно участвует блуждающий нерв (vagus) (Braak et al., 2006, PMID: 16330147)⁠. Существует гипотеза, что амилоиды бактерий могут индуцировать агрегацию aSyn. В последнее время она находит экспериментальные подтверждения. Например, амилоид бактерий CsgA ускоряет агрегацию aSyn in vitro. Заражение мышей или крыс штаммами E.coli с curli ускоряет агрегацию aSyn в вегетативной НС в кишечнике и ЦНС животных, а также вызывает нарушения поведения. Контрольный штамм, лишённый таких фибрилл, не оказывает подобного влияния (Chen et al., 2016, PMID: 27708338; Sampson et al., 2020, PMID: 32043464)⁠. В ходе полногеномного скрининга E.coli было выявлено несколько десятков генов, которые способствуют нейроденегации мышей, часть из которых отвечает за формирование curli. Также авторы показали, что ингибирование продукции CsgA существенно снижает гибель нейронов. Согласно полученным данным, curli также способствуют нейродегенерации в C.elegans, используемых в качестве моделей болезни Альцгеймера, Хантингтона, а также бокового амиотрофического склероза (C. Wang et al., 2021, PMID: 34413194). С другой стороны, существуют данные об изменении в микрофлоре кишечника у пациентов с БП (Hill et al., 2021, PMID: 34512244)⁠, а CsgA является одним из наиболее известных, но не единственным бактериальным амилоидом. Пептиды белка PSMαs, который формирует амилоидоподобные агрегаты в Staphylococcus aureus, способны ускорять агрегацию aSyn (Haikal et al., 2021, PMID: 34769023)⁠. В свете текущей эпидемиологической обстановки нельзя не упомянуть, что N белок SARS-CoV-2 ускоряет агрегацию aSyn (Semerdzhiev et al., 2022, PMID: 34860005)⁠. Для других амилоидозов человека также можно найти данные об их склонности к агрегации в присутствии бактериальных амилоидов. В частности, агрегаты FapCS Pseudomonas aeruginosa ускоряют агрегацию амилоида бета (Javed et al., 2020, PMID: 32999841)⁠. Таким образом, важной задачей является поиск других амилоидогенных белков бактерий и вирусов, которые могут влиять на агрегацию амилоидов человека. Это позволит выявить новые факторы риска развития амилоидозов человека.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта
Методы и подходы
В рамках проекта запланирована работа с разнообразными объектами. Различные бактериальные штаммы Escherichia coli будут использованы для получения необходимых конструкций (TOP10, DH5alpha), продукции белков (BL21(DE3) или Rosetta (DE3)), а также экспресс проверки амилоидных свойств белков-интереса (VS39, система C-DAG, которая будет детально описана ниже). Многие эксперименты будут проведены на клеточной линии человека SH-SY5Y. Она продуцирует большое количество маркеров дофаминэргических нейронов (Kovalevich & Langford, 2013, PMID: 23975817), в которых в норме присутствует NOS1AP. Для изучения агрегации белков in vivo мы планируем использовать линию крыс Wistar.
Для конструирования новых плазмид будут использованы методы молекулярной биологии (выделение ДНК из клеток бактерий, электрофорез ДНК в агарозном геле, рестрикция, лигирование, ПЦР). Кроме этого мы планируем использовать современную методику рекомбинационного клонирования (Gateway), которая существенно быстрее и проще по сравнению с традиционными подходами. Для получения ряда конструкций может быть использована методика сборки по Гибсону с помощью фирменных наборов реактивов (Gibson Assembly Master Mix, NEB). Все конструкции будут проверены секвенированием в ресурсном центре СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» (РМиКТ). Плазмиды на основе pgLAP1 будет использованы для временной сверхэкспрессии конструкций, слитых с EGFP, в клетках млекопитающих. Векторы на основе pDEST-ORF-V1, pDEST-ORF-V2 (Croucher et al., 2016, PMID: 27405979) будут использованы для проверки взаимодействий белков в клетках млекопитающих (подробнее методика описана ниже). Конструкции, полученные на основе плазмиды pVSGW (Danilov et al., 2021, PMID: 34680573), будут использованы в системе C-DAG. Все перечисленные выше конструкции имеют сайты для рекомбинационного клонирования, что значительно облегчает работу с ними, также эти векторы подобраны с учётом объектов и несут необходимые элементы для продукции в низ белков интереса. Плазмиды pDest-527-nSNCA (получена в нашей лаборатории) и pET-20b-SUP35NM(S.cer)-His6 (Allen et al., 2005, PMID: 15545639) будут использованы для продукции нативного альфа-синуклеина (aSyn) и Sup35NM-His6 в клетках бактерий, соответственно. Белок Sup35 является одним из наиболее детально описанных амилоидов, в частности, его фрагменты используют в качестве контролей в системе C-DAG. Мы также будем использовать препараты этого белка для отработки новых методов.
Нашим коллективом в сотрудничестве с коллегами из Университета Монпелье был разработан уникальный метод для идентификации белков, способных к коагрегации, названный AmyloComp (Bondarev et al., in prep). Он основан на оценке возможности двух белковых последовательностей формировать единую структуру амилоидной фибриллы. Поскольку число доказанных примеров белков, способных к коагрегации в составе амилоидов, очень мало, алгоритм был протестирован на примерах бета-соленоидов. Эти мономерные белки содержат в своей структуре чередующиеся элементы: бета-тяж - поворот — бета-тяж. Сходные бета-арки можно обнаружить во многих амилоидных структурах (A. V. Kajava et al., 2010, PMID: 20032312). Последовательности этих элементов в соленоидах не идентичны, хотя они и формируют единую структуру. Поэтому бета-соленоиды могут выступать в качестве аналогов структуры амилоидных гетерофибрилл⁠, и именно благодаря набору разных бета-арок, формирующих бета-соленоиды, мы смогли предложить и протестировать наш алгоритм. AmyloComp позволяет с высокой точностью различить пептиды, соседствующие друг с другом в составе бета-соленоидов, от случайных пар пептидов. Параметр AUC (Area Under Curve) для ROC кривой, построенной на основании логистической модели, составляет 0,9433 (в случае идеально точной модели AUC должен быть равен 1). В рамках проекта мы планируем использовать AmyloComp для поиска бактериальных белков, способных коагрегировать с aSyn.
Последовательности белков бактерий мы планируем брать из базы данных UniProt (uniprot.org). На данный момент она включает более 270 тысяч бактериальных протеомов. Списки белков кандидатов будут профильтрованы с учётом их локализации на поверхности клеток, связанных с ней, согласно UniProt. Термины Gene Onthology (GO) мы планируем брать из этой же базы данных. Оценка значимости обогащения терминами GO будет проведена с помощью гипергеометрического теста с помощью среды для статистической обработки данных R. Программа AmyloComp написана на языке python3, скрипты на этом же языке будут использованы для обращения к базам данных. Идентификацию ортологов мы планируем проводить на основании реципрокного BLAST или по базе данных EggNOG (eggnog5.embl.de). Для анализа мы планируем использовать серверное оборудование ресурсный центр «Вычислительный центр» СПбГУ.
Для проверки амилоидных свойств белков будет использована специализированная бактериальная тест-система C-DAG (Curli-Dependent Amyloid Generator) (Sivanathan & Hochschild, 2013, PMID: 23787895). С её помощью возможно детектировать образование амилоидных агрегатов с характерной фибриллярной морфологией на поверхности клеток, а также оценить их способность связывать амилоид-специфический краситель конго красный. Локализацию на поверхности клеток обеспечивает специальный сигнальный пептид. Авторы подхода рекомендуют две контрольные конструкции. Белок Sup35NM выступает в роли положительного контроля, а его неамилоидный фрагмент (Sup35M) — отрицательного. Мы планируем использовать оригинальный бактериальный штамм VS39 (Sivanathan & Hochschild, 2013, PMID: 23787895) и специализированные конструкции на основе pVSGW (Danilov et al., 2021, PMID: 34680573) для проверки белков интереса в системе C-DAG.
Для очистки рекомбинантных белков из E. coli будет использована аффинная и ионообменная хроматография, а также гель-фильтрация на приборе NGC (BioRad). В нашей лаборатории отработана методы для очистки нативного альфа-синуклеина, основанная на опубликованном протоколе (Huang et al., 2005, PMID: 15939304), а также Sup35NM-His6 (Sulatskaya et al., 2016, PMID: 27228180), которые будут использованы в работе.
Кинетику агрегации белков in vitro мы планируем оценивать по флуоресценции амилоид-специфичного красителя тиофлавина Т с помощью спектрофлуориметра ClarioStar (BMG), имеющегося у нас в лаборатории. Эта методика будет использована для решения различных задач. Во-первых, мы будем проверять способность амилоидных агрегатов на поверхности клеток бактерий запускать агрегацию aSyn или Sup35NM in vitro. Во-вторых, эта методика понадобится для исследования механизмов коагрегации коротких пептидов в рамках проекта. В связи со второй задачей необходимо отметить, что наш прибор оснащён помпой, позволяющей добавлять в реакцию различные растворы. Эта особенность очень важна для реализации экспериментов по контролируемой сборке амилоидных агрегатов, поскольку мы можем автоматизировать процесс добавления новых порций пептидов в реакцию (подробнее эти эксперименты описаны ниже).
Для проверки способности амилоидных агрегатов из клеток бактерий запускать агрегацию других белков in vitro данные о кинетике агрегации будут проанализированы следующим образом. Для каждой реакции данные будут нормализованы, принимая за ноль минимальное значения, а за единицу — медиану флуоресценции на стадии «плато», когда процесс агрегации заканчивался. Затем для каждой реакции будут подобраны параметры модели: y=A2+((A1-A2)/(1+exp()(x-x0)/dx))
где A1 и A2 начальный и финальный уровень флуоресценции, x0 — время полуреакции, dx — величина обратная скорости агрегации. С учётом подобранных параметров мы также будем рассчитывать время lag фазы реакции: lag = x0 — 2dx. В последующем анализе и сравнении образцов мы планируем использовать величину lag фазы и параметр dx. О запуске агрегации белка бактериальными амилоидами мы в первую очередь будем судить по сокращению lag фазы по сравнению с реакцией спонтанной агрегации белка.
Для экспериментов по активации продукции нативного NOS1AP в среду для культур клеток будут добавлены NMDA или нитропруссид натрия в конечной концентрации от 0 до 100 мкМ. В этом диапазоне концентраций вещества оказывают влияние на продукцию NOS1AP (Jiang et al., 2010, PMID: 20064573). Для блокировки рецепторов NMDA будет использован дизоцилпин в конечной концентрации 100 мкМ (Jiang et al., 2010, PMID: 20064573). Для развития симптомов шизофрении у крыс это же вещество вводится внутрибрюшинно раз в день в течение 6 дней из расчёта 0,1 мг/кг веса животного (Eyjolfsson et al., 2006, PMID: 16517016)⁠. Развитие симптомов будет оценено по увеличению локомоторной активности животных в тесте «открытое поле». Важным этапом работы является оценка жизнеспособности клеток человека в культуре. Для решения этой задачи мы планируем использовать МТТ тест (Stockert et al., 2018, PMID: 29496266).
Для оценки экспрессии генов интереса будет использована ПЦР в режиме реального времени с использованием SYBR green или EVA green. Для сравнения количества белков интереса будет использован метод SDS-PAGE (денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле) с последующей вестерн-блот гибридизацией. В нашей лаборатории получены поликлональные антитела для белка NOS1AP, которые узнают полноразмерный белок человека и мыши (идентичность этих двух белков, а также белка крыс превышает 90%), а также его изоформы. Моноклональные антитела, узнающие GAPDH или актин (количество одного из этих белков мы планируем использовать в качестве контроля нанесения), будут закуплены в рамках проекта. Методика SDD-AGE (полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле) будет использована для выявления детергент-устойчивых агрегатов исследуемых белков.
В рамках проекта запланирована оценка интерактома агрегатов NOS1AP. Для выделения комплексов с этим белком мы планируем использовать методику ко-иммунопреципитации с антителами к NOS1AP. Набор реактивов SileksMag-Protein A (Силекс) с магнитными частицами, слитыми с белком А, будет использован для решения этой задачи. С помощью этой методики были успешно выделены агрегаты белков Sup35 и Rnq1 из клеток дрожжей (Sergeeva et al., 2021, PMID: 34463335). Идентификацию белков, ассоциированных с агрегатами, мы будем проводить методом масс-спектрометрии в ресурсном центре РМиКТ СПбГУ. Изолированные агрегаты NOS1AP будут окрашены конго красным, препараты затем будет протестированы на наличие двулучепреломления в поляризованном свете. Морфология этих агрегатов будет исследована с помощью электронной микроскопии. Необходимое для этих задач микроскопическое оборудование доступно для исполнителей в ресурсном центре РМиКТ СПбГУ (электронные микроскопы Jem JEOL, а также флуоресцентный инвертированный микроскоп Leica DMI6000).
Методика бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) (Kodama & Hu, 2012, PMID: 23148879) будет использована для доказательства колокализации и физического взаимодействия белков в клетке. Данная методика отлажена в нашей лаборатории и подразумевает использование двух плазмид (pDEST-ORF-V1, pDEST-ORF-V2), каждая из которых несёт фрагмент белка Venus (V1 и V2). В случае контакта между молекулами белков флуоресцентные свойства этого белка восстанавливаются. Эта методика с соответствующими положительными и отрицательными контролями уже успешно используется в нашей лаборатории. Анализ локализации белков с флуоресцентными метками будет проведен методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии (флуоресцентный микроскоп Zeiss Axioscope A1 и лазерный конфокальный микроскоп Leica TCS SP5 MP, расположенный в ресурсном центре РМиКТ).

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту
При непосредственном участии руководителя проекта (Станислава Бондарева) в сотрудничестве с группой Андрея Каява (университет Монпелье, Франция) создана и протестирована программа AmyloComp, которая позволяет проводить поиск амилоидов, способных к коагрегации (Bondarev et al., in prep). Ранее при участии руководителя проекта была разработана программа для автоматизированного анализа линейных характеристик амилоидынх фибрилл FibrilJ (Sokolov et al., 2017). Также был разработан подход, позволяющий предсказывать возможные структуры амилоидных агрегатов по последовательности белка, он получил название BetaSerpentine (S. A. Bondarev et al., 2018a, PMID: 29444233)⁠.
Руководитель проекта является также автором серии обзоров, посвященных проблеме амилоидов, а также коагрегации белков в их составе. При участии С.А. Бондарева описано три новых белка с амилоидными или амилоидоподобными свойствами (Belousov et al., 2018, PMID: 29381728; Danilov et al., 2021, PMID: 34680573; P. Drozdova et al., 2018, PMID: 29494682). В 2021 году он также был удостоен премии правительства Санкт-Петербурга за выдающиеся научные результаты в области науки и техники в номинации «естественные и технические науки» — премия имени Л. Эйлера за цикл работ с общим названием «методы изучения структуры амилоидных агрегатов in vivo».
При активном участии руководителя проекта в лаборатории физиологической генетики СПбГУ была отлажена система для продукции и очистки рекомбинантных белков из клеток E. coli и получение их амилоидных агрегатов. На данный одним из ключевым результатов этой работы является характеристика точных параметров связывания тиофлавина Т с амилоидными агрегатами Sup35, которая была проведена в сотрудничестве с коллегами из Института Цитологии (Sulatskaya et al., 2016, PMID: 27228180; 2020)⁠. Отработка этих методов также позволила внести вклад в создание новой теории диффузионных экспериментов ЯМР для изучения амилоидных фибрилл (Kharkov et al., 2021, PMID: 33891789)⁠.
Основной исполнитель проекта к.б.н. Татьяна Михайловна Рогоза имеет многолетний опыт в работе с амилоидами и прионами, в частности является одним из первооткрывателей фактора [ISP+] (Rogoza et al., 2010, PMID: 20498075)⁠, эти результаты были опубликованы в известном высокорейтинговом журнале PNAS. Руководитель гранта Президента РФ для молодых кандидатов наук в 2012-2013 гг, а также исполнитель целого ряда проектов, поддержанных российскими фондами. В рамках закончившегося в прошлом году проекта она проводила масштабную работу по конструированию плазмид, в том числе получению кДНК разных видов и амплификации генов интереса с неё, а также анализу амилоидных свойств белков в системе C-DAG. Эта методика за последние несколько лет стала рутинной в нашей лаборатории. В том числе мы усовершенствовали плазмидную конструкцию, используемую в этой системе, и получили вектор с сайтами для рекомбинационного клонирования (Danilov et al., 2021, PMID: 34680573)⁠. Эта модификация существенно упрощает процедуру получения новых плазмид для тестирования разнообразных белков в системе C-DAG.
Основной исполнитель проекта Антон Богданович Матиив в 2022 году заканчивает аспирантуру, защита диссертации запланирована на 2023 год. Его работа в аспирантуре была посвящена поиску новых амилоидов человека и, в частности, изучению коагрегации белка NOS1AP и aSyn. За время работы он получил поликлональные антитела к этому белку и освоил методы работы с культурами клеток человека, а также подходы для изучения агрегации белков. Его вклад также очень важен для реализации текущего проекта, поскольку он отработал методику очистки нативного aSyn из клеток бактерий, а также постановку реакции агрегации этого белка в присутствии фибрилл aSyn. Первый автор обзорной статьи, посвящённой многообразию амилоидных и амилоидоподобных агрегатов (Матиив et al., 2020)⁠. Антон Богданович, а также Нина Павловна Трубицина имеют сертификат повышения квалификации Института Биоинформатики (https://bioinf.me/) и обладают всеми необходимыми навыками для реализации части проекта, связанной с биоинформатическим анализом.
Нина Павловна Трубицина закончила аспирантуру в 2015 году, защита диссертации запланирована на 2022 год. В 2015 году Н.П. Трубицина получила диплом о профессиональной переподготовке по программе "Математическое обеспечение и администрирование информационных систем» на математико-механическом факультете СПбГУ. Исследовательская работа и научные интересы связаны в первую очередь с изучением терминации трансляции и приона [PSI+] у дрожжей S.cerevisiae, а также с поиском новых амилоидов у других организмов. За время своей работы, она освоила широкий спектр методов генетики и молекулярной биологии, а также отработала новые методики, такие как белковая трансформация и измерение ГТФазной активности белков in vitro. Автор 5 научных статей.
Ольга Михайловна Землянко обладает богатым опытом работы с микроорганизмами, а также в области молекулярной биологии. Владеет всеми необходимыми навыками для продукции белков интереса в клетках бактерий и их хроматографической очистки. Вместе с руководителем проекта отработала методику для индукции агрегации белка Sup35 в присутствии его фибрилл.
Для успешной реализации проекта в состав коллектива вошла Ирина Андреевна Разговорова, аспирант 4 года кафедры общей физиологии СПбГУ, она имеет богатый опыт работы с животными объектами и оценкой их поведения.
Лаборатория физиологической генетики СПбГУ, на базе которой будут проводиться основные эксперименты, за время продолжительных исследований амилоидов и прионов, собрала большой набор бактериальных штаммов, а также генетических конструкций, что значительно облегчает работу по тематике проекта. Лаборатория также располагает набором современного оборудования и имеет доступ к высокотехнологичному оборудованию ресурсного центра “Развитие молекулярных и клеточных технологий” СПбГУ. Всё вышеизложенные факты демонстрируют значительный научный задел коллектива по теме Проекта и во многом гарантируют его реализацию.

Список избранных публикаций коллектива по теме проекта.
1. Матиив А.Б., Трубицина Н.П., Матвеенко А.Г., Барбитов Ю.А., Журавлева Г.А., Бондарев С.А. 2020. Амилоидные и амилоидоподобные агрегаты: многообразие и кризис термина. Биохимия. 85. 9. 1213-1239. Q2. IF=1.978
2. Kharkov B.B, Podkorytov I.S., Bondarev S.A., Belousov M.V., Salikov V.A., Zhouravleva G.A., Skrynnikov N.R. 2021. Role of rotational motion in diffusion NMR experiments on supramolecular assemblies: application to Sup35NM fibrils. Angewandte Chemie - International Edition. 60. 28. 15441-15451. 10.1002/anie.202102408. Q1. IF=15.336
3. Sokolov P.A., Belousov M.V., Bondarev S.A., Zhouravleva G.A., Kasyanenko N.A. 2017. FibrilJ: ImageJ plugin for fibrils' diameter and persistence length determination. Computer Physics Communications. 214. 199-206. 10.1016/j.cpc.2017.01.011. Q1. IF=3.627
4. Bondarev S.A., Bondareva O.V., Zhouravleva G.A., Kajava A.V. 2018. BetaSerpentine: a bioinformatics tool for reconstruction of amyloid structures. Bioinformatics. 34. 4. 599-608. 10.1093/bioinformatics/btx629. Q1. IF=5.61
5. Drozdova P., Lipaeva P., Rogoza T., Zhouravleva G., Bondarev S. 2018. Overproduction of Sch9 leads to its aggregation and cell elongation in Saccharomyces cerevisiae. PLoS ONE. 13. 3. e0193726. 10.1371/journal.pone.0193726. Q1. IF=2.74
6. Drozdova P.B., Barbitoff Y.A., Belousov M.V., Skitchenko R.K., Rogoza T.M., Leclercq J.Y., Kajava A.V., Matveenko A.G., Zhouravleva G.A., Bondarev S.A. 2020. Estimation of amyloid aggregate sizes with semi-denaturing detergent agarose gel electrophoresis and its limitations. Prion. 14. 1. 118-128. 10.1080/19336896.2020.1751574. Q2. IF=1.952
7. Bondarev S.A., Antonets K.S., Kajava A.V., Nizhnikov A.A., and Zhouravleva G.A. 2018. Protein Co-Aggregation Related to Amyloids: Methods of Investigation, Diversity, and Classification. Int. J. Mol. Sci. 19. 2292. 10.3390/ijms19082292. Q1. IF=4.556
8. Trubitsina N.P., Zemlyanko O.M., Bondarev S.A., Zhouravleva G.A. 2020. Nonsense mutations in the yeast SUP35 gene affect the [PSI+] prion propagation. Int. J. Mol. Sci. 21. 5. 1648. 10.3390/ijms21051648. Q1. IF=4.556
9. Sulatskaya A.I., Bondarev S.A., Sulatsky M.I., Trubitsina N.P., Belousov M.V., Zhouravleva G.A., Llanos M., Kajava A.V., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. 2020. Point mutations affecting yeast prion propagation change the structure of its amyloid fibrils. Journal of Molecular Liquids. 314. ND. 113618. 10.1016/j.molliq.2020.113618. Q1. IF=5.065
10. Danilov L.G., Moskalenko S.E., Matveenko A.G., Sukhanova X.V., Belousov M.V., Zhouravleva G.A., Bondarev S.A. 2021. The human NUP58 nucleoporin can form amyloids in vitro and in vivo. Biomedicines. 9. 10. 1451. 10.3390/biomedicines9101451. Q1. IF=6.081

Совместные гранты с 2017 года. В списке указаны исполнители из числа участников представленного проекта.
1. Грант РФФИ 19-14-50590 «Амилоидные и амилоидоподобные агрегаты: многообразие, парадоксальные свойства и кризис термина». Руководитель С.А. Бондарев, исполнители: А.Б. Матиив, Н.П. Трубицина. Проект завершён.
2. Грант РФФИ 20-34-70073 «Эволюционный и функциональный консерватизм амилоидных свойств нуклеопоринов». Руководитель С.А. Бондарев, исполнители: Т.М. Рогоза, Н.П. Трубицина. Проект завершён.
3. Грант РФФИ 20-34-90117 «Поиск белков, способных коагрегировать с альфа-синуклеином». Руководитель С.А. Бондарев, исполнитель: А.Б. Матиив. Проект заканчивается в сентябре 2022 года. В рамках этого исследования была впервые показана агрегация белка NOS1AP, а также его физическое взаимодействие с aSyn.
4. Грант РНФ 18-14-00050 «Генетический и эпигенетический контроль терминации трансляции». Исполнители: С.А. Бондарев, Т.М. Рогоза, Н.П. Трубицина, О.М. Землянко, А.Б. Матиив (в период 2018-2020 гг.). Проект заканчивается в декабре 2022 года.