Засуха представляет собой один из основных экологических факторов, влияющих на продуктивность растений в современном сельском хозяйстве [1;2]. В связи с этим, одним из важнейших направлений исследований физиологов, биохимиков, генетиков и селекционеров растений во всем мире является поиск путей повышения засухоустойчивости растений. С сельскохозяйственной точки зрения в проблеме засухоустойчивости наиболее важны два аспекта: (a) устойчивая продуктивность растений и (б) сохранение качества растительного сырья, а следовательно, и качества растительных пищевых продуктов. Согласно прогнозируемым климатическим изменениям, можно ожидать, что в ближайшие десятилетия воздействие засухи на природные и сельскохозяйственные системы будет возрастать. В связи с этим важно развивать новые улучшенные аграрные стратегии нацеленные на увеличение засухоустойчивости растений при одновременном сохранении их урожайности и качества. Это требует глубокого понимания базовых молекулярных механизмов, обусловливающих ответ растений на засуху, то есть знание о ионах, метаболитах, белках, РНК и генах, вовлеченных в этот процесс.
Многочисленные исследования показывают, что даже кратковременная засуха приводит к значительным изменениям как внешнего вида растения, так и биохимического состава его тканей. Эти изменения, обусловленные физиологическими и биохимическими механизмами реакции растения на дефицит воды, были изучены в предыдущих работах руководителя [3;4]. На первых этапах, засуха проявляется как обезвоживание, приводящее к абсцизовой кислоте (АБК)-зависимому закрыванию устьиц и увяданию листьев, перегрузке электрон-транспортных цепей хлоропластов и митохондрий и развитию окислительного стресса, т.е. активации формирования активных форм кислорода (АФК) [1;5]. Одновременно запускаются метаболические ответные реакции, такие как накопление осмопротекторных белков и низкомолекулярных метаболитов (преимущественно, аминокислот и сахаров) [6].
Одновременный рост равновесных концентраций АФК и углеводов вызывает активацию реакций аутоокисления моносахаридов [7] и перекисного окисления липидов [8], что, в конечном итоге, приводит к т.н. карбонильному стрессу
-резкому увеличению производства реактивных карбонильных соединений (РКС) [9]. Эти высокореактивные вещества модифицируют клеточные биополимеры, что вызывает как физиологические нарушения, так и снижение качества растительной продукции.
Негативное влияние неблагоприятных природных факторов может быть снижено за счет использования химических средств защиты растений, в том числе эффекторов метаболизма растений (фитоэффекторов), что является неотъемлемой чертой современного сельского хозяйства. По этой причине актуальным является поиск новых более эффективных веществ с данным профилем биологической активности. Однако целенаправленный поиск таких веществ среди конкретных классов соединений требует понимания механизма действия фитоэффектора. Такого рода информация особенно важна в случае новых классов соединений, когда данные о механизме действия совершенно необходимы для разработки самой стратегии поиска соединений, обладающих необходимыми свойствами. Настоящий проект направлен на выявление фитоэффекторных свойств и получение экспериментальных данных о механизме их проявления у сиднониминов – мезоионных соединений, которые ранее никогда не исследовались под этим углом зрения. Эти вещества являются NO донорами и триггерами внутриклеточного синтеза супероксидрадикалл ионов, которые, в свою очередь, являются эффекторами АФК-зависимого сигналинга, запускающего процессы метаболической адаптации, обуславливающей индуцированную устойчивость растений к стрессу. То есть, по сути, они являются метаболотропными препаратами. Таким образом, мы предполагаем, что производные сиднониминов могут являться эффективными агентами так называемого «прайминга», то есть, при нанесении перед периодом кратковременной засухи на листья или в ризосферу растений, запускать процесс метаболической адаптации и обеспечивать возникновение устойчивости к моменту начала засушливого периода. Проверке этой гипотезы и посвящен этот проект.

[1]Cruz de Carvalho, M. H. Drought stress and reactive oxygen species: production, scavenging and signaling. Plant Signal Behav. 2008, 3, 156-165..
[2]Rodziewicz, P.; Swarcewicz, B.; Chmelewska, K.; Wojakowska, A.; Stobiecki, M. Influence of abiotic stress on plant proteome and metabolome. Acta Physiol. Plant 2014, 36, 1-19.
[3]Paudel, G.; Bilova, T.; Schmidt, R.; Greifenhagen, U.; Berger, R.; Tarakhovskaya, E.; Stockhardt, S.; Balcke, G. U.; Humbeck, K.; Brandt, W.; Sinz, A.; Vogt, T.; Birkemeyer, C.; Wessjohann, L.; Frolov, A. Osmotic stress is accompanied by protein glycation in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 2016, 67 (22), 6283-6295.
[4]Frolov A., Bilova T., Paudel G., Berger R., Balcke G.U., Birkemeyer C., Wessjohann L.A. (2017). Early responses of mature Arabidopsis thaliana plants to reduced water potential in the agar-based polyethylene glycol infusion drought model. J. Plant

Physiology, 208: 70-83. doi: 10.1016/j.jplph.2016.09.013
[5]Kar, R. K. Plant responses to water stress: role of reactive oxygen species. Plant Signal. Behav. 2011, 6 (11), 1741-1745.
[6]Dichio, B.; Xiloyannis, C.; Sofo, A.; Montanaro, G. Osmotic regulation in leaves and roots of olive trees during a water deficit and rewatering. Tree Physiol. 2006, 26 (2), 179-185.
[7]Wolff, S. P.; Dean, R. T. Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes. Biochemical. J. 1987, 245 (1), 243-250.
[8]Halliwell, B.; Chirico, S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am. J. Clin. Nutr. 1993, 57 (5 Suppl), 715S-724S.
[9]Mano, J. Reactive carbonyl species: their production from lipid peroxides, action in environmental stress, and the detoxification mechanism. Plant Physiol Biochem. 2012, 59, 90-97.
4.2.Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
В связи с происходящими в настоящее время климатическими изменениями, засуха становится одним из основных факторов, вызывающих значительные потери урожая во всем мире. Эта ситуация усугубляется тем, что ряд других стрессовых воздействий, таких как повышенная или пониженная температура и засоление, также вызывает нарушение водного режима клеток и сходные с засухой симптомы. Таким образом, разработка новых стратегий повышения устойчивости растений ко всем видам осмотического стресса (включая засуху), является одной из центральных и актуальнейших проблем современных исследований в области физиологии растений и агротехнологии. Поскольку воздействие на растительный геном создает богатое разнообразие возможностей регуляции физиологического ответа растения на условия выращивания, использование трангенных растений является эффективным подходом к решению этой проблемы [1;2]. Однако как в России, так и в Европейском союзе использование трангенных растений в сельском хозяйстве строго регламентировано и требует получения специальных разрешений. Таким образом, использование фитоэффекторов (или метаболических модуляторов роста растений), повышающих устойчивость к засухе, представляется многогообещающей альтернативой трансгенному подходу, что особенно важно в свете применимости фитоэффекторов к разным видам растений и в широком географическом диапазоне. Задача создания химических модуляторов устойчивости растений к стрессу представляется, таким образом актуальной.
Научная значимость данного проекта не вызывает сомнения. Действительно, в последние годы было показано, что оксид азота NO вовлечен в процессы редокс-сигналинга, контролирующие ответ растений на действие абиотических стрессоров. Сиднонимины являются NO донорами и привлекают, таким образом, к себе внимание как потенциальные индукторы устойчивости к стрессу. Действительно, хорошо известно, что многие соединения класса сиднониминов проявляют различные виды биологической активности, а ряд из них используется в качестве субстанций (действующего начала) лекарственных средств. Но в сельском хозяйстве производные сиднонимина до последнего времени применения не находили. Лишь только что появилось сообщение об инсектицидных свойствах представителей этого класса [3]. Таким образом, тот факт, что сиднонимины до сих пор не были рассмотрены как модуляторы стресс-ответа в растениеводстве, представляется неожиданным. Тем более, уже показано, что они способны влиять на физиологические процессы, протекающие в растениях. Однако до сих пор остаются неизвестными точные механизмы проявления соответствующих эффектов. Более того, можно с высокой степенью вероятности предполагать, что эти эффекты опосредованы регуляторными эффектами активных форм кислорода (супероксид анион-радикалов, гидроксильных радикалов) или молекулы NO – оксида азота(II). Таким образом, подтверждение применимости сиднониминов в качестве модуляторов стресс-ответа откроет целое новое направление в аграрной науке.

[1]Gosal, S. S.; Wani, S. H.; Kang, M. S. Biotechnology and drought tolerance. Journal of Crop Improvement 2009, 23, 19-54.
[2]Ashraf, M. Inducing drought tolerance in plants: recent advances. Biotechnol. Adv. 2010, 28 (1), 169-183. [3] Bioorg. Med. Chem. Lett., 46, 128120 (2021); https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2021.128120

4.3.Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность
К настоящему времени накапливаются данные, указывающие на то, что производные сиднониминов в очень малых дозах обладают выраженным рострегулирующим действием и проявляют свойства стимуляторов роста, гербицидов или антидотов гербицидов. С высокой степенью вероятности, эти эффекты опосредованы регуляторными эффектами супероксиданион-радикалов и/или гидроксильных радикалов. Известно, что эти активные формы кислорода (АФК) вовлечены в развитие ответа растений на стресс и адаптацию к изменению условий среды (засухе, холоду, засолению). Таким образом, логично предположить, что ростовые эффекты этих веществ могут сочетаться со способностью к так называемому праймингу – то есть выработке устойчивости к стрессору при воздействиями химическими агентами незадолго до наступления неблагоприятных условий. Такое сочетание свойств позволить решить одну из важнейших

задач современной агротехнологии – сохранение жизнеспособности и продуктивности культурных растений при засухе малой продолжительности (что является одним из распростаненнейших природных явлений на территории Российской Федерации). Таким образом, предполагается рассмотреть сиднонимины в качестве возможных эффекторов метаболизма растений (фитоэффекторов), позволяющих предотвратить (или, как минимум, уменьшить) потери урожая, связанные с засухой.
В этой связи, генеральной целью данного проекта будет являться оценка способности сиднониминов повышать устойчивость растений к засухе, а также охарактеризовать механизмы, лежащие в основе этих эффектов.
Для достижения поставленной цели необходимо выполнение следующих конкретных задач:
Задача 1 – Синтезировать ряд производных сиднониминов, различающихся по структуре и активности, для выявления структурных мотивов, определяющих их активность.
Синтезировать не менее 20 производных, для 15 из которых ранее была показана рост-модулирующая активность, а для пяти – не показана.
Эксперимент будет проводиться на базе исполнителей проекта Черепанова И. А. и Калгановой Н. В., имеющих широкий опыт в органическом синтезе и специализирующихся на синтезе производных сиднониминов.
Задача 2 – Моделирование условий засухи и скрининг синтезированных дериватов на in vitro тест-системе на основе ряски малой (Lemna minor)
1.Моделирование условий засухи для создания in vitro осмотической тест-системы будет заключаться в выращивании растений Lemna minor в питательной среде с добавлением растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. Эта осмотическая модель будет применяться в скриннинговом эксперименте группы на первом этапе выполнения проекта:
2.Характеристика ответа растений на стресс в присутствии и отсутствии синтезированных дериватов. Реакция Lemna minor на действие стрессового фактора будет охарактеризована по приросту биомассы растений.
3.Выполнение скрининга всех синтезированных дериватов на предмет их способности повышать устойчивость растений к осмотическому стрессу в описанной выше in vitro тест-системе на основе ряски малой (Lemna minor) и растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000. На основе этих скрининг-экспериментов будет составлен список наиболее эффективных фитоэффекторов для их дальнейшего изучения в модели засухи с A. thaliana.
Задача 3 – Охарактеризовать не менее трех дериват производных сиднониминов, из числа выявленных в результате скрининга в экспериментах c L. minor, в тест системе на основе арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), предполагающей перенос растений на агар после его насыщения раствором ПЭГ 8000. В данном разделе, фитоэффекторный потенциал отдельных соединений, охарактеризованный в рамках предыдущего раздела (тест-система на основе Lemna minor, задача 2) будет верифицирован в модели засухи с растениями A. thaliana, разработанной руководителем проекта ранее в сотрудничестве с немецкими партнерами.
В этих экспериментах будет использована разработанная руководителем проекта в сотрудничестве с проф. Вессйоханном и к.х.н. А.А. Фроловым модель осмотического стресса, подразумевающая выращивание растений на агаризованной среде, насыщенной полиэтиленгликолем (ПЭГ) 6000 [7]. Данный подход, оптимизированный для взрослых растений A. thaliana, является в настоящий момент уникальным, и позволяет получить стабильное и хорошо воспроизводимое контролируемое снижение водного потенциала Ψw:
1.Создание модели осмотического стресса. Модель осмотического стресса (экспериментальная засуха) будет создана путем высадки растений арабидопсиса на агаризированную среду, насыщенную раствором ПЭГ-8000 (трехдневная инфузия 172.3 г/л раствором). Предыдущие эксперименты руководителя показали эффективность этого подхода [7].
2.Характеристика ответа растений арабидопсиса на стресс в присутствии и отсутствии синтезированных дериватов. Реакция арабидопсиса на действие стрессового фактора с и без применения производных сиднониминов будет охарактеризована по ряду физиологических показателей (относительное содержание воды, флюоресценция хлорофилла, проводимость устьиц) и биохимических параметров (маркеры окислительного стресса такие как содержание соединений, реагирующих с тиобарбитуратом, пероксидных производных липидов и пероксида водорода, уровень окисленной и восстановленной форм аскорбата). Все эти методы применяются в лаборатории руководителя проекта на рутинной основе.
3.Сравнение эффекта не менее трех сиднониминов как протекторов при их нанесении на листья и корни растений арабидопсиса.
4.Оценка возможности повышения устойчивости растений арабидопсиса к засухе с помощью предобработки семян

сиднониминами. Предполагается теститование не менее трех сиднониминов.

Задача 4 - Оценить потенциал к снижению потери продуктивности при засухе для трех наиболее активных дериватов сиднониминов с активностью, подтвержденной в экспериментах с предобработкой в тест-системе А. thaliana. Оценить влияние на сохранение качества и питательной ценности семян в условиях предобработки производными сиднониминов.
В рамках поставленной задачи будут выявлены негативные последствия для урожая растений арабидопсиса, вызванные засухой. На этом этапе, внимание будет сосредоточено на анализе семян, как наиболее экономически ценной части растения. Продуктивность растений арабидопсиса будет оцениваться количеством семян. Оценка качества семян (с точки зрения физиологии растений) будет характеризоваться по их жизнеспособности, всхожести и морфологии развивающихся проростков по стандартам Международной Ассоциации тестирования семян (ISTA) [7]. Эта работа будет осуществляться в сотрудничестве с к.б.н. Г.Н. Смоликовой (кафедра физиологии и биохимии растений СПбГУ).

Задача 5 – Оценить изменения физиологических и биохимических параметров стресс-ответа растений в ответ на действие дериватов сиднониминов, показавших максимальный защитный эффект в отношении продуктивности гороха при засухе:
1.Применить не менее двух наиболее активных дериватов сиднониминов с активностью, подтвержденной в экспериментах с предобработкой в тест-системе А. thaliana, к растениям гороха, подвергнутым условиям слабой и умеренной естественной засухи (обусловленной недостатком воды в почве) и выявить дериваты сиднониминов, показавшие максимальный защитный эффект в отношении продуктивности гороха при засухе.
2.Охарактеризовать ответ растений гороха на засуху в присутствии и отсутствии сиднониминов по ряду физиологических показателей (относительное содержание воды, флюоресценция хлорофилла, проводимость устьиц) и биохимических параметров (маркеры окислительного стресса такие как содержание соединений, реагирующих с тиобарбитуратом, пероксидных производных липидов и пероксида водорода, уровень окисленной и восстановленной форм аскорбата).
3.Оценить влияние предобработки производными сиднониминов растений гороха на сохранение качества и питательной ценности семян гороха в условиях засухи. Продуктивность растений гороха будет оцениваться количеством семян. Оценка качества семян (с точки зрения физиологии растений) будет характеризоваться по их жизнеспособности, всхожести и морфологии развивающихся проростков по стандартам Международной Ассоциации тестирования семян (ISTA) [7]. Эта работа будет осуществляться в сотрудничестве с к.б.н. Г. Н. Смоликовой (кафедра физиологии и биохимии растений СПбГУ)
Задача 6 - Провести, с помощью ГХ-МС и ВЭЖХ-МС, анализ первичного метаболома растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами.
Задача 7 - Выполнить, с помощью ВЭЖХ-МС, анализ вторичных семиполярных метаболитов растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами.
В результате данного широкомасштабного метаболомного анализа будет получена информация об изменениях содержания метаболитов, накапливающихся под влиянием сиднониминов в условиях засухи. При этом основной акцент будет сделан на метаболиты, задействованные а) в модификации белков и б) защитном ответе растения на условия засухи. Эти результаты помогут понять молекулярный механизм фитоэффекторного действия сиднониминов.
Задача 8 – Проанализировать с помощью наноВЭЖХ-МС протеом образцов, полученных из растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами. Охарактеризовать изменения паттернов дифференциальной экспрессии, фосфопротеома и сульфинома.
Результаты этой серии экспериментов позволят выявить изменения в относительном содержании конкретных белков растений, так же как и изменения паттернов их пост-трансляционных модификаций и функциональной активности, связанные с действием сиднониминами в условиях засухи. Эти эксперименты будут выполнены с привлечением методов bottom-up протеомики, оптимизированными в наших предыдущих исследованиях [6]. Сравнительная оценка количества белков будет основана на относительном анализе (без использования изотопной метки) отдельных триптических гидролизатов методом нано-поточной высокоэффективной хроматографии-времяпролетной масс- спектрометрии с ионизацией в электроспрее (nanoLC-ESI-QqTOF-M) в ходе экспериментов результат-обусловленного получения данных (англ. data-dependent acquisition, DDA).
Задача 9 - Осуществить совместный биоинформатический анализ данных метаболомики и протеомики. Эта работа позволит (1) выявить метаболические сдвиги, связанные с засухой и подавлением ее симптомов после предобработки сиднониминами, (2) охарактеризовать вовлеченные сигнальные пути. По результатам данного анализа будет сделано предположение о внутриклеточных белковых мишенях и механизмах регуляции.

[1]Kar, R. K. Plant responses to water stress: role of reactive oxygen species. Plant Signal. Behav. 2011, 6 (11), 1741-1745.
[2]Ayala, A.; Munoz, M. F.; Arguelles, S. Lipid peroxidation: production, metabolism, and signaling mechanisms of malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal. Oxid. Med. Cell Longev. 2014, 2014, 360438.
[3]Wolff, S. P.; Dean, R. T. Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes. Biochemical. J. 1987, 245 (1), 243-250.
[4]Vistoli, G.; De, M. D.; Cipak, A.; Zarkovic, N.; Carini, M.; Aldini, G. Advanced glycoxidation and lipoxidation end products (AGEs and ALEs): an overview of their mechanisms of formation. Free Radic. Res. 2013, 47 Suppl 1, 3-27.
[5]Poulsen, M. W.; Hedegaard, R. V.; Andersen, J. M.; de Courten, B.; Bugel, S.; Nielsel, J.; Skibsted, L. H.; Dragsted, L. O. Advanced glycation endproducts in food and their effects on health. Food Chem Toxicol. 2013, 60, 10-37.
[6]Paudel, G.; Bilova, T.; Schmidt, R.; Greifenhagen, U.; Berger, R.; Tarakhovskaya, E.; Stockhardt, S.; Balcke, G. U.; Humbeck, K.; Brandt, W.; Sinz, A.; Vogt, T.; Birkemeyer, C.; Wessjohann, L.; Frolov, A. Osmotic stress is accompanied by protein glycation in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 2016, 67 (22), 6283-6295.
[7]Frolov, A.; Bilova, T.; Paudel, G.; Berger, R.; Balcke, G. U.; Birkemeyer, C.; Wessjohann, L. A. Early responses of mature Arabidopsis thaliana plants to reduced water potential in the agar-based polyethylene glycol infusion drought model. J. Plant Physiol 2016, 208, 70-83.
4.4.Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов
Поскольку засуха представляет собой одну из основных причин потери урожая в глобальном масштабе [1], исследования в области повышения засухоустойчивости являются одним из наиболее актуальных направлений
биологии растений. Засухоустойчивость обычно понимается как физиологическое состояние растения, позволяющее сохранять продуктивность в условиях осмотического стресса [2]. Наиболее простой путь к достижению высокой устойчивости растений к стрессу связан с получением генно-модифицированных организмов. Этот подход дает возможность оптимизировать фенотип культурного растения к требованиям сельского хозяйства гораздо быстрее, чем традиционные селекционные технологии [2]. Однако практическое использование трансгенных растений строго регламентируется как европейским, так и российским законодательством и требует получения специальных разрешений. В связи с этим, в настоящее время разрабатываются альтернативные методы, не основанные на использовании трансгенных растений. В недавних работах проф. Лудгера А. Вессйохана была предложена концепция т.н. фитоэффекторного подхода, основанная на применении специфических ингибиторов ферментов, вовлеченных в ответ растения на стресс. В частности, было показано, что снижение активности поли-АДФрибозил-полимеразы (PARP), предотвращающее снижение содержания NADН, обеспечивает поддержание продуктивности растений в условиях засухи [3]. В рамках данного проекта будут изучены производные сиднониминов в качестве регуляторов роста и средств защиты растений. Будет проведен поиск новых мишеней для фитоэффекторного воздействия на метаболизм растений и оценка их роли в формировании засухоустойчивости.
Изучение свойств сиднониминов в качестве регуляторов роста и средств защиты растений было впервые сформулировано как самостоятельное научное направление именно участниками данного проекта. Ими же были предприняты первые исследования в этом направлении и получены соответствующие положительные результаты.[4] Эти результаты показали целесообразность расширения направлений исследования сиднониминов в данной области, а самое главное, усиление фундаментальной составляющей исследований, и в первую очередь, необходимость изучения механизмов проявления физиологических эффектов этих соединений. В рамках данного проекта впервые предполагается совместными усилиями химиков и биологов начать изучение влияния сиднониминов на стрессоустойчивость растений, а также исследование фундаментальных основ механизмов действия сиднониминов.
Решение обеих задач крайне важно для ускорения фундаментальных исследований в области потенциального использования сиднониминов в сельскохозяйственных целях для повышения эффективности это производственной сферы. Достижимость поставленных в проекте целей базируется предшествующем опыте работы участников проекта, биологов и химиков, которые, создав соответствующие заделы в своих областях, впервые объединили свои возможности для решения указанных выше научных проблем. В частности, химики-участники проекта имеют обширный опыт синтетических исследований в области химии сиднониминов и представляют собой одну из ведущих в мире химических школ, работающих в области химии мезоионных соединений, в частности, сиднониминов. Это подтверждается опубликованным ими недавно фундаментальным обзором, написанным по запросу редакции одного из ведущих профильных международных журналов [5]. Исследователями этой группы разработан ряд фундаментальных методов функционализации различных положений молекул сиднониминов, позволяющих

осуществлять синтез различных типов производных соединений данного класса. Эти методы вошли в мировую синтетическую практику и в рамках данного проекта позволят обеспечить необходимое для полноценных биологических исследований разнообразие производных сиднониминов с заданными физико-химическими характеристиками.
На основе результатов, полученных в ходе выполнения данного проекта, могут быть разработаны новые фитомодуляторы, обеспечивающие одновременно как поддержание продуктивности растений, так и сохранение качества растительной продукции в условиях засухи.

[1]Cruz de Carvalho, M. H. Drought stress and reactive oxygen species: production, scavenging and signaling. Plant Signal Behav. 2008, 3, 156-165.
[2]Ashraf, M. Inducing drought tolerance in plants: recent advances. Biotechnol. Adv. 2010, 28 (1), 169-183.
[3]Geissler, T.; Wessjohann, L. A. A whole-plant microtiter plate assay for drought stress tolerance-inducing effects. J. Plant Growth Reg. 2011, 30, 504-514.
[4]И.А.Черепанов. Ю.Я.Спиридонов, О.А.Чичварина, А.С.Самарская, А.Б.Пономарев, С.К.Моисеев, Ростстимулирующая активность производных сиднонимина, Агрохимия, № 9, 50-55 (2018)
DOI: 10.1134/S0002188118090053
[5]I.A.Cherepanov, S.K.Moiseev. Recent developments in the chemistry of sydnones and sydnone imines. // Adv. Heterocycl. Chem., 131, 49-164 (2020); https://doi.org/10.1016/bs.aihch.2019.11.003

4.5.Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
Засуха представляет особую значительную экологическую угрозу для агроценозов, снижающую количество и качество урожая [1]. В целом, она понимается как уменьшенное (т.е. необычно низкое) количество выпадаемых осадков, что приводит к дефициту доступной для растений влаги [2]. Согласно прогнозируемым климатическим изменениям, можно ожидать, что в ближайшие десятилетия воздействие засухи на природные и сельскохозяйственные системы будет возрастать. В связи с этим необходимо создание новых аграрных технологий, нацеленных на увеличение засухоустойчивости растений при одновременном сохранении их урожайности и качества получаемой пищевой продукции. Это требует глубокого понимания базовых молекулярных механизмов, обусловливающих ответ растений на засуху, для чего необходима информация об изменении в балансе ионов, профилях метаболитов, белков, РНК и регуляции генов, вовлеченных в этот процесс. С другой стороны, важно оценить степень влияния генотипа, стадии развития, физиологических аспектов, а также интенсивности засухи, ее продолжительности и наличия сопутствующих неблагоприятных экологических факторов, потенциально способных влиять на устойчивость растений к засухе [3].В условиях засухи, основной стратегией выживания растений является поддержание водного гомеостаза. Эта стратегия в основном определяется реакциями, регулируемыми абсцизовой кислотой (АБК), а именно замедлением роста, накоплением осмопротекторов, и снижением испарения воды путем закрывания устьиц. Последнее действие, несмотря на эффективную защиту от потерь воды, негативно влияет на физиологию растения поскольку одновременно нарушает СО2/О2 газообмен в тканях листа. При освещении, если устьица закрыты, в листьях накапливается О2 и не поступает, необходимый в процессах фотосинтеза, СО2. Эти условия способствуют развитию окислительного стресса в тканях листа. Действительно, из-за дефицита СО2 подавляется работа цикла Кальвина, в ходе которого помимо синтеза моносахаров происходит регенерация окисленной формы NADP (NADP+) – ключевого акцептора электронов, поступающих из электрон транспортной цепи хлоропластов (ЭТС). Таким образом, торможение работы цикла Кальвина приведет к недостатку NADP+, что в свою очередь, будет способствовать перегрузке электрон-транспортной сети и переносу электронов от ЭТС к другому наиболее доступному акцептору электронов, которым является О2. Спонтанное одноэлектронное восстановление молекул кислорода приводит к генерации супероксиданиона радикала (О2•-) и затем другим активным формам кислорода (АФК). Так, пероксид водорода образуется при дисмутации О2•- , далее эти оба АФК в присутствии незначительного количества переходных металлов (Fe(II))/Fe(III)) и Cu(I)/Cu(II) могут вовлекаться в реакции Хабера-Вайса и Фентона ]4] с образованием гидроксильного радикала (ОН•), одного из самых сильных окислителей, способного повредить любые биологические полимерные молекулы (углеводы, липиды, белки, РНК и ДНК). В условиях, недостаточности потенциала антиоксидантных систем клеток для нейтрализации активно генерируемых АФК, в клетках развивается окислительный стресс [4]. При этом, высокие концентрации АФК стимулируют перекисное окисление липидов, аутоокисление сахаров, окислительное повреждение белков и нуклеиновых кислот [5]. Кроме того, из-за обезвоживания некоторые интра- и интермолекулярные взаимодействия в клетках растения могут измениться. В целом, реакции растения на засуху сопровождается значительными изменениями в базовых механизмах клеточного гомеостаза: транспорте, ферментативной активности и экспрессии

генов.
В природе, растения часто подвергаются засухе слабой или средней интенсивности в течение относительно продолжительного периода времени. Развивающаяся в ответ на засуху естественная адаптация растений всегда сопряжена со снижением урожая (т.е. с уменьшением биомассы продукции). В связи с этим, целью научного сообщества было разработать технологии одновременного эффективного повышения урожайности растений и их устойчивости к этой форме абиотического стресса. При этом, проблема сохранения качества сельскохозяйственной продукции при усилении стресс-толлерантности растений оставалась долгое время без должного внимания.
Действительно, одновременный рост внутриклеточного содержания АФК и углеводов во время развития ответа клетки на стресс в конечном итоге приводит к значительному усилению аутоокисления углеводов, сопровождаемому карбонильным стрессом, т.е. повышением содержания реактивных карбонильных соединений, таких как глиоксаль (ГО), метилглиоксаль (МГО) и 3-деоксиглюказон [6]. Эти вещества активно взаимодействуют с белками, приводя к образованию конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ) [7].
С другой стороны, благодаря усиленному образованию АФК, наблюдается усиление производства промежуточных реактивных продуктов перекисного окисления липидов (ГО, МГО, гидроксиальдегидов), и, в конечном итоге, продуктов глубокого липоокисления (КПГЛ) [7]. Благодаря ярко-выраженному их про-воспалительному действию в организме млекопитающих, как КПГГ, так и КПГЛ являются признанными пищевыми токсинами [8]. Образование КПГГ подробно описано в животных тканях и недавно было подтверждено в растениях на уровне аминокислот (в глубоких гидролизатах белков) и протеома [9,10].
В частности, были описаны паттерны белков, подвергающихся глубокому гликированию в условиях засухи [11]. Таким образом, окислительный и карбонильный стресс, вызванные недостатком влаги, могут оказать заметное влияние на пищевые свойства растительных белков. Этот аспект обычно недооценивается при разработке новых стратегий, направленных на увеличение устойчивости культурных растений к засухе [3].
В целом, растительный организм использует несколько стратегий для уменьшения вредного воздействия засухи: а) активация антиоксидантных ферментов, б) вовлечение белков, чувствительных к стресс-индуцируемому ROS– сигналингу (например, ферменты синтеза АБК и сигналинг), в) активация ферментов, ослабляющих вредное воздействие окислительного и карбонильного стресса и г) активация белков, вовлеченных в распознавание, репарацию и деградацию поврежденных белков. Следовательно, эти ключевые участники соответствующих метаболических путей могут быть потенциальными мишенями стратегий улучшения урожайности и качества культурных растений.
Методы традиционной селекции по улучшению устойчивости культурных растений к стрессу нацелены исключительно на повышение урожайности, без учета физиологических механизмов и метаболических изменений [12]. Однако, применение классических методов селекции связано с рядом естественных ограничений в области изменения генотипа организма, таких как: перенос неблагоприятных генов и наличие генетических барьеров, а также долговременностью и трудоемкостью технологических процессов [3]. Эти ограничения можно, по крайней мере, частично преодолеть при использовании маркер-вспомогательной селекции (MAS, marker-assisted selection) [13] и методов генной инженерии [14]. Принцип MAS позволяет идентифицировать тесное сцепление между маркером и геном, контролирующим признак, и использовать ассоциацию маркер-признак в практических целях для создания новых сортов и линий. В частности, к таким маркерам относятся: локус количественных признаков у зерновых QTL (quantitative trait loci); однонуклеотидный полиморфизм SNP (single nucleotide polimorphism) [15]; полиморфизм коротких тандемных повторов SSR (simple sequence repeats) [16]; а также метод RAPD (random amplified polimorphism length) случайно амплифицируемой полиморфной ДНК [17] и многие другие подходы. В частности, сочетание традиционной внутривидовой и отдалённой гибридизации и индивидуального отбора с отбором с помощью молекулярных маркеров можно применять для селекции засухоустойчивости растений с использованием их диких предков в качестве доноров или источников целевых генов, а также использовать для создания генетического картирования .
В отличие от традиционной селекции, в ходе которой генотип подвергается изменениям лишь косвенно, генная инженерия позволяет непосредственно вмешиваться в генетический аппарат, применяя технику молекулярного клонирования. Методы генетической инженерии делают возможным внедрение целевых генов в без сопутствующего переноса ненужных генов от донорского организма и получать новые, не встречающиеся в природе сочетания генов [14].
Традиционно, при изучении устойчивости растений к засухе, основное внимание сосредоточено на получении линий с увеличенным содержанием осмопротекторов, без одновременного анализа воздействия на пищевые качества зерновых. Так, были получены высокоустойчивые линии, характеризующиеся увеличенной экспрессией генов глицинбетаина [18], пролина [19] и биосинтезом трегалозы [20]. Плодотворным оказался также подход, предполагающий повышенную экспрессию генов, кодирующих антиоксидантные ферменты [21].

Так, трансгенные линии с повышенной устойчивостью к засухе, характеризующиеся увеличенной экспрессией супероксиддисмутазы, известны для риса, картофеля и люцерны, тогда как повышенный уровень экспрессии монодегидроаскорбатредуктазы (МДАР) был получен у растений тобака [21]. Также, мишенями трансгенного вмешательства могут быть другие важные участники формирования ответа растений на засуху (такие как белки Late Embriogenesis Abundant (LEA), ферменты биосинтеза аминокислот, абсцизовой кислоты и белки вовлеченные в АБК- сигналинг) [22]. Однако, на настоящий момент, предложение об использовании трансгенных растений в сельскохозяйственной практике не получило поддержки у большинства европейского населения и в Европейского Института Пищевой Безопасности. Одной из фундаментальных причин этого является плейотропная природа гена, определяющая его множественные фенотипические эффекты и проявляющаяся в воздействии на метаболизм растений сложным и часто непредсказуемым путем [23,24]. В этой связи, трансгенные растения могут рассматриваться в качестве потенциальных источников токсичности, аллергий и генетической опасности [25].
В силу этой причины, в настоящее время активно ведется работа над альтернативными подходами, не связанными с трансгенными технологиями, и использующими информационные ресурсы функциональной генетики (метаболомики, протеомики, транскриптомики) для поиска путей улучшения сельскохозяйственных свойств культурных растений и разработка средств защиты растений, в том числе, от стрессового воздействия, ведутся в мире достаточно широко в виду важного значения этого метода интенсификации и повышения эффективности сельскохозяйственного производства [33]. Особенно многообещающей представляется стратегия, получившая название «молекулярного усиления» или MOST [26], или «фитоэффекторный метод» [27]. Этот подход аналогичен фармацевтическим методам, используемым для доставки лекарств при заболевании человека, и основан на исчерпывающем понимании молекулярных механизмов устойчивости растений к стрессу. Поиск новых перспективных молекул ведется среди классов соединений, которые на протяжении десятилетий являются традиционными объектами поиска новых средств защиты растений. В данном же проекте поиск фитоэффекторов и изучение механизма их действия впервые предполагается вести среди производных сиднонимина. Как указывалось выше (см. п. 4.4) впервые этот класс соединений был вовлечен в сферу исследований в области регуляторов роста растений и антидотов гербицидов участниками данного проекта и до сих пор иные исследовательские группы в мире в данном направлении не работают. Ранее уже сообщалось о разработке на основе сиднониминов противомикробных композиций [28] и о проявлении сиднониминами противомикробной, фунгицидной и инсектицидной активности [29]. В последнее время появились работы китайских исследователей в направлении использования сиднониминов как средств защиты растений от патогенов и в качестве инсектицидов. В частности, фунгицидная и инсектицидная активность сиднониминов описаны в китайских патентах [30] и [31], соответственно. Совсем недавно также китайскими авторами был проведен анализ молекулярного докинга, симуляция молекулярной динамики и расчеты свободной энергии связывания целого ряда мезоионных инсектицидов различных типов с белками, связывающими никотин-ацетилхолин [32]. На основании этих данных был осуществлен дизайн и синтез 3-[4-(трифторметил)бензил]сиднонимина, испытания которого показали, что активность этого инсектицида была выше, чем активность инсектицидов на основе других типов мезоионных соединений, включая TFM (трифлюмезопирим) – мезоионный инсектицид недавно разработанный и выведенный на рынок компанией Дюпон. Эти данные говорят о том, что исследования в области использования мезоионных соединений в аграрном секторе ведутся, и что в этой связи интерес исследователей к сиднониминам возрастает.

Анализ информации, полученной методами метаболомики, протеомики и транскриптомики сделает возможным выбор производных сиднониминов, критически важных в развитии ответа на стресс, и перспективных в плане воздействия фитоэффекторов.
Таким образом, настоящий проект будет нацелен на поиск и скриннинг производных сиднониминов, перспективных в плане применения фитоэффекторного подхода. Предполагается, что его использование позволит стимулировать механизмы устойчивости растений к засухе с одновременным предотвращением образования глико- и липотоксинов и сохранением качества урожая.
1.Cruz de Carvalho, M. H. Drought stress and reactive oxygen species: production, scavenging and signaling. Plant Signal Behav. 2008, 3, 156-165.
2.Boyer, J. S. Plant productivity and environment. Science 1982, 218 (4571), 443-448.
3.Budak, H.; Hussain, B.; Khan, Z.; Ozturk, N. Z.; Ullah, N. From Genetics to Functional Genomics: Improvement in Drought Signaling and Tolerance in Wheat. Front Plant Sci. 2015, 6, 1012.
4.Kar, R. K. Plant responses to water stress: role of reactive oxygen species. Plant Signal. Behav. 2011, 6 (11), 1741-1745.
5.Halliwell, B. Reactive Species and Antioxidants. Redox Biology Is a Fundamental Theme of Aerobic Life. Plant Physiol. 2006,141, 312-322..
6.Wolff, S. P.; Dean, R. T. Glucose autoxidation and protein modification. The potential role of 'autoxidative glycosylation' in diabetes. Biochemical. J. 1987, 245 (1), 243-250.

7.Vistoli, G.; De, M. D.; Cipak, A.; Zarkovic, N.; Carini, M.; Aldini, G. Advanced glycoxidation and lipoxidation end products (AGEs and ALEs): an overview of their mechanisms of formation. Free Radic. Res. 2013, 47 Suppl 1, 3-27.
8.Poulsen, M. W.; Hedegaard, R. V.; Andersen, J. M.; de Courten, B.; Bugel, S.; Nielsel, J.; Skibsted, L. H.; Dragsted, L. O. Advanced glycation endproducts in food and their effects on health. Food Chem Toxicol. 2013, 60, 10-37.
9.Bechtold, U.; Rabbani, N.; Mullineaux, P. M.; Thornalley, P. J. Quantitative measurement of specific biomarkers for protein oxidation, nitration and glycation in Arabidopsis leaves. Plant J. 2009, 59 (4), 661-671.
10.Bilova, T.; Lukasheva, E.; Brauch, D.; Greifenhagen, U.; Paudel, G.; Tarakhovskaya, E.; Frolova, N.; Mittasch, J.; Balcke, G. U.; Tissier, A.; Osmolovskaya, N.; Vogt, T.; Wessjohann, L. A.; Birkemeyer, C.; Milkowski, C.; Frolov, A. A Snapshot of the Plant Glycated Proteome: Structural, Functional and Mechanistic Aspects. J. Biol. Chem. 2016, 291 (14), 7621-7631.
11.Paudel, G.; Bilova, T.; Schmidt, R.; Greifenhagen, U.; Berger, R.; Tarakhovskaya, E.; Stockhardt, S.; Balcke, G. U.; Humbeck, K.; Brandt, W.; Sinz, A.; Vogt, T.; Birkemeyer, C.; Wessjohann, L.; Frolov, A. Osmotic stress is accompanied by protein glycation in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 2016, 67 (22), 6283-6295.
12.Yang, S.; Vanderbeld, B.; Wan, J.; Huang, Y. Narrowing down the targets: towards successful genetic engineering of drought-tolerant crops. Mol. Plant 2010, 3 (3), 469-490.
13.Collar, B. C. Y.; Mackill, D. J. Marker-assisted selection: an approach for precision plant breeding in the twenty-first century. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2016, 363, 557-572.
14.Ashraf, M. Inducing drought tolerance in plants: recent advances. Biotechnol. Adv. 2010, 28 (1), 169-183.
15.Mondini, L.; Nachit, M. M.; Pagnotta, M. A. Allelic variants in durum wheat (Triticum turgidum L. var. durum) DREB genes conferring tolerance to abiotic stresses. Mol. Genet. Genomics 2015, 290 (2), 531-544.
16.Noli, E.; Teriaca, S.; Sanguinetus, C.; Conti, S. Utilization of SSR and AFLP markers for the assessment of distinctness in durum wheat. Molecular Breeding 2008, 22, 301-313..
17.Ilbi, H. RAPD markers assisted varietal identification and genetic purity test in pepper, Capsicum annuum. Scientia Horticulturae 2003, 97, 211-218..
18.Khan, S. M.; Yu, X.; Kikuch, A.; Asahina, M.; Watanabe, K. N. Genetic engineering of glycine betaine biosynthesis to enhanceabiotic stress tolerance in plants. Plant Biotechnology 2009, 26, 125-134..
19.Cvikrova, M.; Gemperlova, L.; Dobra, J.; Martincova, O.; Prasil, I. T.; Gubis, J.; Vankova, R. Effect of heat stress on polyamine metabolism in proline-over-producing tobacco plants. Plant Sci. 2012, 182, 49-58.
20.Jang, I. C.; Oh, S. J.; Seo, J. S.; Choi, W. B.; Song, S. I.; Kim, C. H.; Kim, Y. S.; Seo, H. S.; Choi, Y. D.; Nahm, B. H.; Kim, J. K. Expression of a bifunctional fusion of the Escherichia coli genes for trehalose-6-phosphate synthase and trehalose-6- phosphate phosphatase in transgenic rice plants increases trehalose accumulation and abiotic stress tolerance without stunting growth. Plant Physiol 2003, 131 (2), 516-524.
21.Eltayeb, A. E.; Kawano, N.; Badawi, G. H.; Kaminaka, H.; Sanekata, T.; Shibahara, T.; Inanaga, S.; Tanaka, K. Overexpression of monodehydroascorbate reductase in transgenic tobacco confers enhanced tolerance to ozone, salt and polyethylene glycol stresses. Planta 2007, 225 (5), 1255-1264.
22.Saad, A. S.; Li, X.; Li, H. P.; Huang, T.; Gao, C. S.; Guo, M. W.; Cheng, W.; Zhao, G. Y.; Liao, Y. C. A rice stress-responsive NAC gene enhances tolerance of transgenic wheat to drought and salt stresses. Plant Sci. 2013, 203-204, 33-40.
23.Zang, C.; Wohlhueter, R.; Zang, H. Genetically modified foods: A critical review of their promise and problems . Food Science and Human Wellness 2014, 5, 116-123..
24.Rabara, R. C.; Prateek, K. R.; Paul, J. The Potential of Transcription Factor-Based Genetic Engineering in Improving Crop Tolerance to Drought. OMICS: A Journal of Integrative Biology 2014,18, 601-614..
25.Bawa, A. S.; Anilakumar, K. R. Genetically modified foods: safety, risks and public concerns-a review. J. Food Sci. Technol. 2013, 50 (6), 1035-1046.
26.Hu, S.; Lubberstedt, T. Getting the 'MOST' out of crop improvement. Trends Plant Sci. 2015, 20 (6), 372-379.
27.Geissler, T.; Wessjohann, L. A. A whole-plant microtiter plate assay for drought stress tolerance-inducing effects. Journal of Plant Growth Reg. 2011, 30, 504-514..
28.J. L. Ellis, D. S. Garvey, and C.-E. Lin, Petent WO2007086884A2, (2007)
29.H.D. Navadiya, A.R. Jivani, N.K. Undavia, B.S. Patwa, // Indian J. Heterocycl. Chem., 19, 87 (2009) 30. CN111057024A (2020)
31. CN111269224A (2020)
32. Bioorg. Med. Chem. Lett., 46, 128120 (2021)
33. А. С. Лукаткин, А. С. Семенова, А. А. Лукаткин. Влияние регуляторов роста на проявления токсического действия гербицидов на растения // Агрохимия. – 2016. - №1. – С. 73-95

4.6.Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта

4.6.1Предлагаемые методы и подходы
4.6.1.1.Выращивание растений и создание модели осмотического стресса на основе Lemna minor 4.6.1.2.Выращивание растений арабидопсиса и создание модели осмотического стресса на основе Arabidopsis thaliana Для создания контролируемого осмотического стресса будет использована модель, разработанная участниками проекта [1] и уже опробованная в предыдущих исследованиях
руководителя проекта [2]. В рамках данного раздела, планируется постановка растительных экспериментов в Климатических камерах (фитотроны) и теплицы отдела биотехнологии ГНУ НИИСХМ (В сотрудничестве с академиком РАН, д.б.н., профессор И.А.Тихонович) и кафедры Физиологии и биохимии растений СПБГУ. Растения арабидопсиса будут выращиваться в течение 6 недель на жидкой питательной среде ½ Мурасиге-Скуга на 6 мМ MES буфере (2-(N- морфолино)этансульфоновая кислота, рН 5.7 на коротком дне (8 ч свет (120 мкмоль фотонов/ м-2 сек-1 )/16 ч темнота). В течение первых двух недель роста растений в среду будет добавлена сахароза. Для создания осмотического стресса (экспериментальной засухи) будет использована агаризированная среда, насыщенная 172,3 г/литр осмотика ПЭГ 8000 в течение трех дней. Такая концентрация ПЭГ обеспечивает значение водного потенциала раствора -0.4 MПа [3].
Растения в возрасте 6 недель будут пересажены в подготовленную агаризированную среду, содержащую или не содержащую ПЭГ. Обработка фитоэффекторами будет выполняться путем добавления сиднониминов в питательную среду до пересадки растений на агар содержащий ПЭГ. Сбор растений будет осуществлен до пересадки на агаровую среду, и через 3 дней (n = 10) после начала воздействия осмотического стресса. Листья будут мгновенно заморожены в жидком азоте и измельчены с помощью шаровой мельницы Mixer Mill MM 400 ball mill (Retsch, Haan, Germany).
Размолотый растительный материал будет хранится при -80 °С и использоваться для последующих биохимических тестов.

4.6.1.3.Выращивание растений гороха (Pisum sativum) и создание модели естественной засухи умеренной интенсивности на основе этих растений
Семена гороха будут пророщены и инокулированы ризобактериями Rizobium leguminosaruм на вермикулите по методике, описанной в работе [4]. Растения будут выращиваться в 3л сосудах заполненных смесью 1:1 почвы и вермикулита. Условия засухи будут достигаться путем увеличения временных интервалов между поливами растений. Обработка фитоэффекторами будет выполняться путем добавления сиднониминов в почву до воздействия условий засухи.

4.6.1.4.Сбор растений арабидопсиса и гороха.
Сбор растений будет осуществлен до и после (через 3 дня) начала воздействия осмотического стресса/засухи. Листья и корни арабидопсиса и гороха, а также семена гороха будут мгновенно заморожены в жидком азоте и измельчены с помощью шаровой мельницы Mixer Mill MM 400 ball mill (Retsch, Haan, Germany). Размолотый растительный материал будет хранится при -80 °С и использоваться для последующих биохимических тестов. Материал растений гороха также будет использоваться в метаболомных и протеомных экспериментах

4.6.1.5.Физиологическая характеристика ответа растений на засуху после предобработки растений сиднониминами Мониторинг физиологического состояния в ответ на действие сиднониминов будет осуществляться путем регистрации сырой массы растений растений Lemna minor до наложения стресса и периодически на протяжении всего эксперимента.
Мониторинг физиологического состояния растений арабидопсиса и гороха в ответ на действие сиднониминов в условиях осмотического стресса/засухи будет осуществляться путем регистрации физиологических и биохимических маркеров стресса. Так, устьичная проводимость будет определена с помощью портативного порометра Delta-T (Devices Ltd, Cottbus, Германия), эффективность работы фотосистемы II (Fv/Fm) будет оценена методом флуориметрии, основанной на импульсной амплитудной модуляции (ИАМ, англ. Pulse Amplitude Modulation, РАМ) с помощью импульсного флуориметра Junior-PAM (Heinz Walz Gmbh, Германия). Для определения относительного содержания воды в тканях будет определена сырая (А) и сухая масса (Б) растительного материала. Относительное содержание воды (%) будет рассчитано по формуле ((А-Б)*100%)/А, как это описано в предыдущей работе руководителя [2].
4.6.1.6.Биохимическая характеристика ответа растений на засуху после предобработки растений сиднониминами Для оценки биохимических параметров стресса будет использоваться замороженный
измельченный растительный материал, полученный в ходе работы над разделом 4.6.1.4. Методы, выбранные для оценки биохимических параметров, были оптимизированы и уже были использованы в предыдущих работах авторского коллектива [1;2]. Таким образом, интенсивность окислительного стресса будет охарактеризована по уровню содержания пероксида водорода и продуктов перекисного окисления липидов спектрофотометрическими методами.

Содержание пероксида водорода, будет определено при 575 нм по изменению окраски реакционной среды при окислении Fe(II) в комплексе с ксиленовым оранжевым. Перекисное окисление липидов будет оцениваться по содержанию веществ, реактивных в отношении тиобарбитуровой кислоты (ТБА, англ. thiobarbituric acid-reactive substances) и по уровню гидроперекисей липидов, которое будет определяется по реакции окисления Fe(II) в комплексе с ксиленовым оранжевым. Для
определения ТБА- реактивных веществ измерения будут проводиться при 532 и 600 нм и_ результаты будут выражены как эквиваленты малонового диальдегида (ε = 155 мM-1cм-1). Эффективность антиоксидантных систем растений будет оценена по соотношению восстановленных и окисленных форм аскорбата. Для этого, содержание аскорбата и дегидроаскорбата будет определено аскорбатоксидазным методом согласно Huang с соавторами [6].

4.6.1.7 Характеристика изменений в протеоме и метаболоме тканей листьев, корней и семян гороха, связанных с ответом растений на засуху после предобработки растений сиднониминами
В данных экспериментах скрининг протеома и метаболома будет направлен на идентификацию белков и метаболитов, содержание которых изменяется при воздействии засухи на растение предварительно обработанное сиднониминами. Полученный список соединений будет положен в основу выбора 1) возможных белков-мишеней перспективных в плане применения методологии фитоэффекторов, включая ферменты, активность которых негативно влияет на жизнеспособность растения и/или качество урожая, 2) метаболитов, увеличивающих свое содержание при стрессе и предположительно повышающих устойчивость растений к засухе.

Количественный анализ белка без использования меченных стандартов
Все протеомные эксперименты будут основаны на подходе «bottom up» («снизу вверх»), с
успехом применяемом в работе руководителя проекта с A. thaliana [1;7]. Препарат тотального белка будет получен посредством фенольной экстракции в соответствии с оптимизированным протоколом Isaacson и соавт. [2;11].
Выделение будет проводиться из 500 мг замороженного материала (n = 3) после добавления 1.3 мл буферного раствора для фенольной экстракции (0.5моль/л трис-HCl, 0.7 моль/л сахарозы, 0.1 моль/л KCl, 50 ммоль/л, 2% (v/v) меркаптоэтанола, 1ммоль/л смеси ингибитор протеаз, рН 7.5) и фенола, насыщенного 0.5 моль/л трис-HCl. Данная методика позволяет получить несколько мг белка. Выделенные белки будут высушены и перерастворены в буфере, содержащем 7 моль/л мочевины, 2 моль/л тиомочевины, 0.2% анионного кислотолабильного сурфактанта AALSII («Progenta») в 0.5 моль/л трис-HCl буфере, рН 7.5). Содержание белка будет оценено с помощью коммерческого кита 2- D Quant Kit (GE Healthcare) и кросс-валидировано методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим окрашиванием Кумасси. Для восстановления дисульфидных мостиков к аликвотам белка будет добавлен трис(2-
карбоксиэтил)фосфин гидрохлорид (TCEP), для алкилирования тиоловых групп цистеина будет использован йодацетамид. Далее белки будут подвергнуты ограниченному протеолизу трипсином в ходе последовательных инкубаций при температуре 37°С в соотношении фермент – белок 1:20 и 1:50 в течение 5 и 12 ч, соответственно.
После деградации AALS (10% трифторуксусная кислота, 37°С, 20 мин), полученные после гидролиза пептиды будут

обессолены с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ) и высушены. Образцы будут проанализированы с помощью нано-высокоэффективной жидкостной хроматографии, осуществляемой в режиме соединения он-лайн с времяпролетным масс-спектрометром с ионизацией в электроспрее (nanoRP-HPLC-ЕSI-QqTOFMS) на хроматографе Agilent 1200 HPLC system, под управлением программным обеспечением ChemStation, и масс-спектрометре 6538 Ultra High Definition Accurate-Mass Q-TOF (Agilent Technologies, Москва, Россия), оборудованном HPLC-Chip Cube MS Interface, предколонкой Zorbax 300SB-C18 (0.3 x 5 мм, 5 µм) и аналитической колонкой (0.3 x 150 мм, 5 µм). Анализ будет основан на экспериментах результат-обусловленного сбора данных (data-dependent acquisition (DDA)), то есть с выбором трёх наиболее интенсивных сигналов, детектированных в МС скане, и их коллизионной фрагментацией в последующих МС/МС сканах. Для идентификации белков, будет проведён поиск первичных данных против протеомной базы данных A. thaliana UniprotKB database (http://www.ebi.ac.uk/refe-rence_proteomes) при помощи поисковых программ Spectrum Mill (Agilent Technologies) и Andromeda (Институт биохимии им. Макса Планка, Мартинзрид, Германия http://www.coxdocs.org/doku.php?id=maxquant:andromeda#andromeda). Относительный количественный анализ без применения меченных стандартов будет основан на программном обеспечении MaxQuant (Институт биохимии им. Макса Планка, Мартинзрид, Германия, http://www.coxdocs.org/doku.php?id=maxquant:start), с использованием одного протеотипического пептида на белок. Функциональная аннотация дифференциально регулируемых белков будет осуществлена с помощью программного обеспечения MapMan (Институт молекулярной физиологии растений им. Макса Планка, Потсдам-Гольм, Германия, http://mapman.gabipd.org).

Анализ изменения сульфинома и фосфопротеома в ответ на засуху и предобработку сиднониминами.

Идентификация последовательностей пептидов, содержащих модифицированные аминокислотные остатки, будет проведена с теми же исходными файлами и базой данных последовательностей. При этом, поиск будет основан на множественных комбинациях различных сдвигов значений m/z, характерных для этих модификаций (методика подробно описана Фроловым и коллегами) (Bilova et al., 2016, JXB 67: 6283-6295). Количественное определение специфичных сайтов пост-трансляционного модифицирования будет произведено с помощью программного обеспечения LC Quan™, после конвертации в совместимый формат файлов (raw). Для увеличения охвата сульфинома и фосфопротеома тканей растений гороха и достижения высокого аналитического разрешения, будут использованы высокоспецифичные и чувствительные сканы ионов-предшественников (методы детально описаны в работах руководителя проекта) (Frolov et al., 2006, J Mass Spectrom 41: 1459-1469; Greifenhagen et al., 2014 J Proteome Res 14: 768-777; Schmidt et al., 2015, J Mass Spectrom 50: 613-624). При этом, индивидуальные сайты модифицированных аминокислот будут идентифицированы по характерным инкрементам массы и подтверждены с помощью интерпретации спектров вручную.

Анализ метаболома
В рамках данного раздела будут изучены эффекты предобработки сиднониминами на метаболом растений гороха подвергнутых воздействию умеренной засухи. В частности, будут рассмотрены следующие группы метаболитов: (i) первичные метаболиты, предположительно вовлечённые в осмотическую регуляцию (аминокислоты, моно- и дисахара, сахароспирты), первичные метаболиты, вовлеченные в энергетический метаболизм (сахарофосфаты, нуклеотиды, коферменты), а также вторичные метаболиты, вовлеченные в ответ растения на действие засухи. Данный интегрированный подход позволит создать целостную картину сиднонимино-зависимых метаболических сдвигов, потенциально способных изменятья функциональных свойств белков. Данные эксперименты будут выполняться параллельно с протеомными исследованиями, т.е. для анализа метеболома будет использоваться тот же растительный материал, анализ протеома которых был описан в предыдущем разделе.
Анализ термостабильных первичных метаболитов будет основываться на газовой хроматографии – масс- спектрометрии (GC-MS) с использованием 5%-фенил-95%-диметилсилоксановой колонки (DB-5 MS UI, J&W Fisher, Германия), установленной в газовый двумерный (2D) хроматограф Agilent 7890 (Agilent Technologies, Москва, Россия), соединенный онлайн с времяпролётным масс-спектрометром с ионизацией в потоке электронов (LECO Pegasus 4D, LECO Corporation, Сент-Джозеф, США). Для этого растительный материал будет экстрагирован водным раствором метанола и последовательно дериватизирован О-метилгидроксиламин гидрохлоридом и N-метил-N-(триметилсилил)- трифторацетамидом, как описано Фроловым и соавторами (Milkovska-Stamenova et al., 2015, J Agric Food Chem 63: 5911-5919). Экстракция пиков и аннотация будет проводиться с помощью программы AMDIS, в то время как идентификация будет основана на индексах времени удерживания и схожести спектров ионизации в потоке электронов (NIST14 и собственные спектральные библиотеки группы АА Фролова). Количественный анализ будет основан на интеграции соответствующих масс-хроматограмм (extracted ion chromatograms, XICs, ± 0.5 Da) при соответствующих временах удерживания (tR). Калибровка будет основана на методе добавленных стандартов с использованием калибровки на пяти уровнях концентрации.
Содержание ряда термолабильных интермедиатов энергетического обмена не может быть проанализировано методом GC-MS.
Анализ первичных термолабильных и вторичных семи-полярных метаболитов будет выполнен методом ультравысокоэффективной жидкостной хроматографией в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (УВЭЖХ- МС/МС, HPLC-MS/MS) по протоколу основанному на этанольно-водной экстракции полярных метаболитов и последующей экстракции семи-полярных метаболитов дихлорметан-этанольной смесью, описанному в работе H. Treutler с соавт. (Treutler et al., 2016) с изменениями. Метаболиты материала растений гороха будут экстрагироваться в ледяной кислой смеси дихлорметана/этанола. После центрифугирования, образуется верхняя этанольно-водная фаза, содержавшая полярные метаболиты. Для получения экстракта вторичных метаболитов, будет отобрана органическая нижняя фаза, содержавшая семи-полярные вещества. Полученные кислый этанольно-водный раствор и органическая фаза будут высушены в центрифужном вакуумном испарителе при 0°С. Для выполнения хромато-масс- спектрометрического анализа сухие остатки полярных и/или семи-полярных экстрактов, содержавшие первичные термолабильные и вторичные метаболиты, соответственно будут растворены в метанольно-водной смеси. Полученные растворы после фильтрации через поливинилиденфторидные (PVDF) фильтры (диаметр пор 0,2 мкм) будут использованы для выполнения УВЭЖХ-МС/МС. Экстракты, содержавшие первичные термолабильные метаболиты, будут проанализированы с помощью ион-парной обратнофазной ВЭЖХ на хроматографе Agilent 1200, оснащенном колонкой Nucleoshell C18 (Macherey Nagel, Düren, Germany), и совмещенным онлайн тандемным масс-спектрометром, использующим трехквадрупольный масс-анализатор (LC-MS/MS system 8030, Shimadzu, Япония). Образцы будут разделены с помощью ион-парной обратнофазной хромато-масс-спектрометрии в водно-ацетонитрильных градиентах

в присутствии 10 ммоль/л трибутиламина (TBA). Экстракты, содержавшие вторичные семи-полярные метаболиты, будут проанализированы с помощью высокоэффективной квадруполь-времяпролетной хромато-масс-спектрометрии (НРLC- QqTOF-MS, хроматограф Agilent 1200 и масс-спектрометр Q-TOF Agilent 6538 Ultra High Definition Accurate-Mass, AgilentTechnologies, Санта-Клара, США). Разделения будут проводиться на обратнофазной хроматографической колонке Poroshel C18 (Macherey Nagel, Düren, Germany) в системе элюентов вода-ацетонитрил в присутствии 0,3 ммоль/л ацетата аммония. Детекция аналитов будет проводиться в режимах регистрации положительных и отрицательных ионов. Аннотация, выравнивание, фильтрация пиков, а также первичный статистический анализ будут проводиться с помощью программного обеспечения MS-Dial. Кластерный анализ метаболитов по их принадлежности к отдельным классам веществ будет проводиться с помощью программного пакета MetFamily. Относительный количественный анализ метаболитов (то есть, интеграция соответствующих пиков на соответствующих индивидуальных ионных хроматограммах) будет выполнен с использованием программного обеспечения MS-Dial. Метаболиты, статистически достоверно изменяющие свое содержание в присутствии сиднониминов, будут идентифицированы в последующих тандем-масс-спектрометрических (LC-MS/MS) экспериментах. Идентификация будет основана на анализе спектрального сходства полученных MS/MS спектров с имеющимися в библиотеках NIST14, MassBank, библиотек Института Молекулярной физиологии растений им. Макса Планка и Лейбниц института биохимии растений (Германия) а также собственной библиотеки группы научного коллектива. Также будет использован алгоритм предсказания фрагментации MetFrag.

4.6.2Общий план работы на весь срок выполнения проекта 2022 год:
1.Синтезировать ряд производных сиднониминов, различающихся по структуре и активности, для выявления структурных мотивов, определяющих их активность. Синтезировать не менее 20 производных, для 15 из которых ранее была показана рост-модулирующая активность, а для пяти – не показана.
2.Провести скрининг всех синтезированных дериватов на предмет их способности повышать устойчивость растений к осмотическому стрессу в in vitro тест-системе на основе ряски малой (Lemna minor) и растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000.
3.Из числа выявленных в результате скрининга в экспериментах c L. minor производных сиднониминов, охарактеризовать не менее трех дериватов в тест системе на основе арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), предполагающей перенос растений на агар после его насыщения раствором ПЭГ 8000. Сравнить эффект сиднониминов как протекторов при их нанесении на листья и корни, а также оценить возможность повышения устойчивости растений арабидопсиса к засухе с помощью предобработки семян сиднониминами.
4.Оценить потенциал к снижению потери продуктивности при засухе для трех наиболее активных дериватов сиднониминов с активностью, подтвержденной в экспериментах с предобработкой в тест-системе А. thaliana. Оценить влияние на сохранение качества и питательной ценности семян в условиях предобработки производными сиднониминов.
5.Начать эксперимент по оценке изменений физиологических и биохимических параметров стресс-ответа растений в ответ на действие протекторов в экспериментах с предобработкой двумя производными сиднониминов, показавшими максимальный защитный эффект в отношении продуктивности гороха при засухе.
2023 год:
1.Завершить эксперимент по оценке изменений физиологических и биохимических параметров стресс-ответа растений в ответ на действие дериватов сиднониминов, показавших максимальный защитный эффект в отношении продуктивности гороха при засухе.
2.С помощью ГХ-МС и ВЭЖХ-МС провести анализ первичного метаболома растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами.
3.С помощью ВЭЖХ-МС провести анализ вторичных семиполярных метаболитов растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами.
4.С помощью наноВЭЖХ-МС провести протеомный анализ образцов, полученных из растений гороха (P. sativum), подвергнутых действию засухи в присутствии и отсутствии предобработки сиднониминами. Охарактеризовать изменения паттернов дифференциальной экспрессии, фосфопротеома и сульфинома.
5.Осуществить совместный биоинформатический анализ данных метаболомики и протеомики. Выявить метаболические сдвиги, связанные с засухой и подавлением ее симптомов после предобработки сиднониминами. Охарактеризовать вовлеченные сигнальные пути, будет сделано предположение о внутриклеточных белковых мишенях и механизмах регуляции.

[1]Frolov A, Bilova T, Paudel G, Berger R, Balcke GU, Birkemeyer C, and Wessjohann LA (2016) J. Plant Physiol 208:70-83.
[2]Paudel G, Bilova T, Schmidt R, Greifenhagen U, Berger R, Tarakhovskaya E, Stockhardt S, Balcke GU, Humbeck K, Brandt W, Sinz A, Vogt T, Birkemeyer C, Wessjohann L, and Frolov A (2016) J. Exp. Bot. 67:6283-6295.
[3]Money NP (1989) Plant Physiol 91:766-769.
[4]Bilova T, Lukasheva E, Brauch D, Greifenhagen U, Paudel G, Tarakhovskaya E, Frolova N, Mittasch J, Balcke GU, Tissier A, Osmolovskaya N, Vogt T, Wessjohann LA, Birkemeyer C, Milkowski C, and Frolov A (2016) J. Biol. Chem. 291:7621-7631.
4.7.Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту, наличие опыта совместной реализации проектов
В течение последних семи лет (с начала 2014 года по настоящее время) научная работа руководителя проекта была посвящена исследованию процесса гликирования растительных белков. Этот процесс хорошо изучен у человека и животных, для которых показан про-воспалительный эффект конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ). Стимулом к изучению гликирования белков растений явились наблюдения, позволяющие предположить, что сырая необработанная растительная пища может быть источником поступления КПГГ в организм человека. Руководитель проекта с немецкими партнеры (Проф. Вессйоханн и Др. Фогт) участвовали в работе, в ходе которой впервые удалось охарактеризовать конститутивные паттерны белков с модификациями раннего (соединения Амадори и Хайнса) и глубокого гликирования (конечные продукты глубокого гликирования, КПГГ, анг. advanced glycation end products, AGEs) у взрослых растений A. thaliana и B. napus [1]. Для выполнения этой работы, то есть для исследования части протеома модифицированной продуктами раннего и глубокого гликирования была оптимизирована протеомная стратегия bottom-up. Обычно относительное содержание модифицированных форм белков в тканях чрезвычайно мало, в силу

чего, обычно, они лишь в незначительной степени вовлекаются в протеомный анализ. В ходе работы участников научной группы было достигнуто значительное аналитическое разрешение этого метода, что обеспечило высокое покрытие гликированного протеома и надежную идентификацию модифицированных пептидов низкого содержания [2]. С помощью этого оптимизированного подхода было показано, что паттерны продуктов раннего гликирования были схожи у этих двух растений и содержали сходное число белков (не более 200). В тканях листьев обоих растений доминировали соединения Амадори и Хайнса, образованные в ходе реакций лизиновых и аргининовых остатков с триозами и тетрозами, что является существенным отличием от аналогичных паттернов животных тканей, которые представлены в основном модификациями, связанными с реакциями глюкозы и, в меньшей степени других гексоз - например, фруктозы [1].
Примечательно, что анализ КПГГ показал значительно большее количество белков и отдельных остатков в них, вовлеченных в процесс глубокого гликирования, нежели в процессы раннего гликирования. Действительно, КПГГ- содержащий протеом был представлен более чем 500 белками у A. thaliana и приблизительно 900 - у B. napus. При этом, в тканях листьев обоих растений были представлены 10 классов КПГГ, ранее охарактеризованных в животных белках. Характерно, что в белках растений аргинин-модифицированных сайтов было значительно больше, чем лизин- модифицированных сайтов. Тем не менее, доминирующим классом КПГГ для обоих растений был Nε- карбоксиметиллизин (англ. Nε-(carboxymethyl)lysine, СМL). Интересно, что при сравнении паттернов продуктов раннего и глубокого гликирования было выявлено лишь несколько совпадений в сайтах соответствующих модификаций. Этот факт показывает, что вклад окислительной деградации продуктов Амадори и Хайнса в образование КПГГ у растений, в отличие от животных, крайне низок. Функциональная аннотация конечных продуктов гликирования показала, что многие белки, несущие КПГГ, являлись транскрипционными факторами или были вовлечены в метаболизм белков [1].
Следующий этап был посвящен оценке стабильности выявленного паттерна гликированных белков с возрастом растений [3] и в стрессовых условиях. Для этого были разработаны экспериментальные модели засухи [4;5], светового стресса (A. thaliana) (Bilova et al., рукопись готовится к публикации), а также стресса, вызванного солями тяжелых металлов (кадмия) (B. napus) (Lukasheva et al., рукопись готовится к публикации). Также были проведены эксперименты по изучению условий микрогравитации, симулированной длительным 3D клиностатированием прорастающих семян B. napus, на качественные и количественные изменения в метаболоме и протеоме, и интенсивность процессов гликирования и гликоокисления в протеоме этих проростков. Все изученные стрессоры вызывали увеличение содержания АФК, углеводов и количество гликированных белков в тканях. Во всех моделях было показано увеличение доли белков, гликированных α-дикарбонильными соединениями (глиоксалем и метилглиоксалем) по остаткам аргинина. Углеводы, содержание которых возрастало в стрессированных растениях, были протестированы в in vitro инкубациях с синтетическими пептидами. Многие из этих сахаров показали высокую реактивность и гликирующий потециал [1].
Необходимо отметить, что в работе как руководителя, так и всего научного коллектива, центральным является изучение ответа растений на осмотический стресс и его модуляции, с целью повышения устойчивости растений к засухе. При этом руководителя Т.Е. Билову интересуют разные, но комплементарные аспекты этой фундаментальной задачи.
В свою очередь, руководитель проекта заинтересована в изучении неэнзиматических пост-трансляционных модификаций растительных белков, в первую очередь, гликирования. Основной мотивацией ее исследований является влияние KПГГ модификации белков на жизненные процессы растений, а также на физиологическое состояние их гетеротрофных потребителей (т.е., в конечном итоге, вопрос опасности потребления гликированных белков для здоровья человека). Она работает над этой проблемой с 2014 г.
В целом, в ходе работы руководителя особое внимание было уделено экспериментальным моделям засухи, которых, в ходе совместной работы с группой Проф. Вессйонанна, было создано несколько. В основу первой из них легла хорошо известная модель выращивания проростков на агаризированной среде, насыщенной полиэтиленгликолем 8000, ранее предложенная Verslues et al [6]. В ходе работы руководителя под руководством Проф. Вессйоханна и А.А. Фролова (2014 – 2015 гг) в рамках проекта DFG FR-3117-2/1, ей удалось успешно перенести эту модель на взрослые растения (6
– 7 недель), что позволило изучать ответы на осмотический стресс, характерные для взрослых растений, что более соответствует применению в исследованиях, связанными с аграрными аспектами [4]. На следующем этапе, эта модель была успешно перенесена на другие культурные растения, такие как горох (РНФ 17-16-01042, рук. А.А. Фролов, в котором руководитель проекта являлся ответственным исполнителем) и табак (оптимизируется в данный момент в рамках работ, выполняемых в лаборатории Проф. Вессйоханна). Помимо этого, при непосредственном участии руководителя была успешно поставлена модель осмотического стресса на водной полиэтиленгликоль-содержащей среде, которая была успешна оптимизирована к культурам гороха (РНФ 17-16-01042 см. соответствующий отчет за 2017 год, статья в публикации в 2018 году) и рапса. Таким образом, при выполнении данного проекта руководитель будет использовать научный задел, полученный в рамках работ, финансируемых как из средств фонда DFG, так и из средств фонда РНФ.
Коллектив исполнителей проекта владеет протеомным подходом bottom up и методами хромато-масс-спектрометрии,

которые были успешно применены как для выявления изменений в протеоме растений в ответ на осмотический стресс, так и для выявления пост-трансляционных модификаций белка [4;5]. В этих и серии других исследований, авторский коллектив оптимизировал схему постановки метаболомного GC-MS эксперимента, и в частности протокол дериватизации, идентификации аналитов, а также анализа полученных данных [1;5]. В кооперации с проф.
Стефановичем (Университет Вроцлава, Польша), руководитель учувствовала в разработке методики мультиплексного анализа с использованием дважды меченных пептидов методом разбавления изотопной метки [7].Также были освоены пакеты программ Xcalibur 2.7 и 3.0 версии, LCquan, AMDIS, OpenChrom, Proteome Discoverer 2.2, Progenesis QIP, MaxQuant, Metaboanalyst, MapMan, Perseus, MSDial на базе которых будут обрабатываться данные, полученные в ходе протеомных и метаболомных экспериментов.
Участники проекта со стороны химиков имеют обширный опыт синтетических исследований в области химии мезоионных соединений и представляют собой одну из ведущих в мире химических школ, работающих в области химии сиднониминов. Ими разработан ряд фундаментальных методов функционализации различных положений молекул сиднониминов, позволяющих вводить в мезоионный каркас сиднониминов широкий набор важнейших типов функциональных групп и осуществлять их дальнейшую модификацию. Это открывает доступ к широкому разнообразию производных сиднониминов с заданными физико-химическими характеристиками для проведения биологических исследований, исходя из относительно небольшого набора базовых сиднониминовых структур. Данный подход позволил начать исследование рострегулирующих и антидотных в отношении гербицидов свойств сиднониминов. В результате проведенных работ было обнаружено, что в экспериментах (включая вегетационные) на кукурузе, подсолнечнике, озимой пшенице значительная доля исследованных представителей данного класса соединений проявляет выраженные свойства стимуляторов роста растений, гербицидов и/или антидотов гербицидов. Это свидетельствует о том, что указанные свойства являются атрибутом не индивидуальных соединений, а характерной чертой, присущей сиднониминам, как классу химических соединений. Данный результат позволил предположить перспективность исследования сиднониминов на предмет выявления среди представителей этого класса соединений, способных проявлять иные типы биологической активности, представляющие интерес для сельского хозяйства, в частности, возможность стимуляции антистрессовой адаптации растений. Дополнительно, полученные результаты остро поставили на повестку дня вопрос о механизмах проявления сиднониминами их биологического действия.
Указанные причины привели к формированию данного проекта.
Таким образом, коллектив исследователей объединяет глубокое взаимопонимание, имеется в наличии необходимый опыт и оборудование для выполнения этой задачи, что позволяет рассчитывать на успешное выполнение проекта.

[1]Bilova T, Lukasheva E, Brauch D, Greifenhagen U, Paudel G, Tarakhovskaya E, Frolova N, Mittasch J, Balcke GU, Tissier A, Osmolovskaya N, Vogt T, Wessjohann LA, Birkemeyer C, Milkowski C, Frolov A (2016). A Snapshot of the Plant Glycated Proteome: Structural, Functional and Mechanistic Aspects. J. Biol. Chem., 291(14):7621-36. doi: 10.1074/jbc.M115.678581
[2]1. Bilova T., Greifenhagen U., Paudel G., Lukasheva E., Brauch D., Osmolovskaya N., Tarakhovskaya E., Balcke G.U., Tissier A., Vogt T., Milkowski C., Birkemeyer C., Wessjohann L., Frolov A. (2016). Glycation of Plant Proteins under Environmental Stress — Methodological Approaches, Potential Mechanisms and Biological Role/ Abiotic and Biotic Stress in Plants - Recent Advances and Future Perspectives, Dr. Arun Shanker (Ed.), ISBN: 978-953-51-2250-0, InTech, doi: 10.5772/61860.
[3]19. Bilova T., Paudel G., Shilyaev N., Schmidt R., Brauch D., Tarakhovskaya E., Milrud S., Smolikova G., Tissier A., Vogt T., Sinz A., Brandt W., Birkemeyer C., Wessjohann L. A., Frolov A. (2017). Global Proteomic Analysis of Advanced Glycation End Products in the Arabidopsis Proteome Provides Evidence for Age-related Glycation Hotspots. J. Biol. Chem. 292: 15758-15776. doi:10.1074/jbc.M117.794537
[4]Frolov A., Bilova T., Paudel G., Berger R., Balcke G. U., Birkemeyer C., Wessjohann L. A. (2017). Early responses of mature Arabidopsis thaliana plants to reduced water potential in the agar-based polyethylene glycol infusion drought model. J. Plant Physiology, 208: 70-83. doi: 10.1016/j.jplph.2016.09.013
[5]Paudel G., Bilova T., Schmidt R., Greifenhagen U., Berger R., Tarakhovskaya E., Stöckhardt S., Balcke G.U., Humbeck K., Brandt W., Sinz A., Vogt T., Birkemeyer C., Wessjohann L., Frolov A. (2016). Osmotic stress is accompanied by protein glycation in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot., 67 (22): 6283-6295, doi: 10.1093/jxb/erw395
[6]Verslues, P.E., Agarwal, M., Katiyar-Agarwal, S., Zhu, J., Zhu, J.K., 2006. Methods and concepts in quantifying resistance to drought, salt and freezing, abiotic stresses that affect plant water status. Plant J. 45, 523–539.
[7]Soboleva A, Vikhnina M, Grishina T, Frolov A. 2017. Probing protein glycation by chromatography and mass spectrometry: analysis of glycation adducts. Int. J. Mol. Sci. 017 Nov 28;18(12):2557.