1. В ходе выполнения проекта были синтезированы 32 производных сиднониминов: 3-Изопропил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин B1-01, выход: 71 %; 3-(п-Метоксифенил)-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин B1-02, выход: 88 %; 3-Морфолил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин B1-03, выход: 65 %; 3-Изопропил-4-формил-N6-трет-бутоксикарбонилсиднонимин B1-04, выход 80 %; 3-(п-Метоксифенил)-4-формил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин B1-05, выход 67%; 3-Морфолин-4-формил-N6-трет-бутоксикарбонилсиднонимин B1-06, выход 79 %; 3-Изопропил-[4-(2,2 дициано)этенил]-N6-трет-бутоксикарбонилсиднонимин B1-07, выход: 90 %; 3-(п-Метоксифенил)-[4-(2,2-дициано)этенил]-N6-трет-бутоксикарбонилсиднонимин B1-08, выход: 78 %; 3-Морфолин-[4-(2,2 дициано)-этенил]-N6-трет-бутоксикарбонилсиднонимин B1-09, выход: 97 %; Гидрохлорид 8,9-дегидро-7-имино-3-(п-метоксифенил)-8-циано-[4,6-пропано]-N6-сиднонимина B1-10, выход 64 %; Гидрохлорид 8,9-дегидро-7-имино-3-морфолин-8-циано-[4,6-пропано]-N6-сиднонимина B1-11, выход 77 %; Гидрохлорид 8,9-дегидро-7-имино-3- изопропил-8-циано-[4,6-пропано]-N6-сиднонимина B1-02, выход 78 %; 3-Морфолил-N6-α-(фенилсуфанил)ацетилсиднонимин SP-01, выход 90 %; 3-Изопропил-N6-α-(5-ацетил-4-метилтиазол-2-ил-суфанил)ацетилсиднонимин SP-02, выход 74%; 3-Диметиламино-N6-α-(3-метил-4-оксо-3,4-дигидрохиназолин-2-ил)тио)ацетилсиднонимин SP-03, выход 76%; Гидрохлорид 3-метил-сиднонимина SP-04, выход 55%; Гидрохлорид 3-изопропил-сиднонимина SP-05, выход 71%; Гидрохлорид 3-диметиламино-сиднонимина SP-06, выход 65%; 3-Изопропил-N6-тозилсиднонимин SP-13, выход 72%; 3-Изопропил-N6-трифторацетилсиднонимин SP-17, выход 88%; 3-Изопропил-4-(α-гидрокси(п-трифторметил-фенил)метил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин SP-18, выход 80%; 3-Изопропил-N6-дифенилфосфорилсиднонимин SP-20, выход 90%; 7-Оксо-7-фенокси-3-фенил-9-[4-(трифторметил)фенил]-8-окса-7-фосфа-6,4-пропано-сиднонимин SP-24, выход 70%; Гидрохлорид 3-диметиламино-4-(α-гидрокси(п-трифторметил-фенил)метил-сиднонимина SP-26, выход 83%; 3-Изопропил-4-(α-гидрокси(п-хлор-фенил)метил-N6-тозил-сиднонимин SP-27, выход 75%; 3-Изопропил-4-(α-гидрокси(п-диметиламино-фенил)метил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин SP-29, выход 97%; 3-Изопропил-4-(α-гидрокси(1,3-тиазол-2-ил)метил-N6-трет-бутоксикарбонил-сиднонимин SP-30, выход 80%; Гидрохлорид 3-изопропил-4-(α-гидрокси(п-диметиламино-фенил)метил-сиднонимина SP-31, выход 64%; Гидрохлорид 3-изопропил-4-(α-гидрокси(м-фтор-фенил)метил-сиднонимина SP-32, выход 70%; Гидрохлорид 3-изопропил-4-(α-гидрокси(1,3-тиазол-2-ил)метил-сиднонимина SP-33, выход 75%. Все эти вещества были получены по методикам, разработанным участниками проекта Черепановым ИА и Калгановой НВ [1-12]. Методы получения сиднониминов B1-10, B1-11, B1-02, SP-01, SP-02, SP-03, SP-31, SP-32, SP-33 были разработаны этими участниками в ходе выполнения проекта. Все соединения обладают хорошей растворимостью в воде и ДМСО, структуры представлены на Рис. 1.
2. На следующем этапе был выполнен первичный скриннинг синтезированных сиднониминов в in vitro тест-системе на основе ряски малой (Lemna minor). В этих экспериментах были протестированы не 20, как изначально планировалось, а все 32 сиднонимина в отношении проявления их способности оказывать влияние на устойчивость к засухе растений ряски. Растения были выращены в 24-луночных планшетах заполненных питательной средой Штейнберга стерилизованной в автоклаве. После 6 недель роста, контрольные растения помещали в свежую питательную среду без каких-либо добавок, тогда как экспериментальные растения переносили на среду с полиэтиленгликолем 6000 (ПЭГ6000) в концентрации 200 г/мл, создающую умеренный осмотический стресс (соответствующий засухе средней степени выраженности) [13]. В инкубационную среду с выращиваемыми растениями добавляли тестируемые сиднонимины, предварительно растворенные в ДМСО (0,1% v/v), в конечных концентрациях 1, 10, и 50 мкмоль/л. Растворитель ДМСО (0,1% v/v) служил негативным контролем. Планшеты с растениями были помещены в климатическою фитокамеру на 72 часа при 24 °C и постоянном освещении (100 µмоль м-2 с-1). Эффект сиднониминов на устойчивость растений к засухе оценивали по увеличению площади суммарной поверхности листьев ряски прибором Lemnatec scan analyzer через 24 и 72 часа после внесения сиднониминов в среду. Перед вторым измерением, среду Штайнберга, содержащую ПЭГ6000 (и характеризующуюся, поэтому, сниженным водным потенциалом) заменяли на свежую среду Штейнберга без добавления ПЭГ. Полученные данные оценивали в программе Image J, в которой поверхность листьев ряски измерялась в пикселях и эти данные обрабатывались в программе RStudio с целью определения скорости роста растений обработанных сиднониминами в сравнении с необработанными растениями.
Анализ изменения площади листьев ряски показал различный характер ответа этого растения на действие сиднониминов во время осмотического стресса (Табл. 1). Из всех 32 проанализированных веществ 21 не показали видимого фенотипического ответа, два соединения (B1-01 и SP-13) обладали выраженным протекторным действием (т.е. предотвращали уменьшение площади листа в присутствии осмотического стресса), а 11 соединений (В1-01, В1-02, В1-05, В1-07, В1-09, SP-02, SP-17, SP-24, SP-27, SP-32, SP-33) вызывали ингибирование роста, т.е. выступали, скорее, в роли гербицидов (Рис. 2 и 3). Вещество В1-01 проявило наиболее ярко выраженные протекторные свойства, т.е. способность предотвращать снижение жизнеспособности растения в присутствии осмотического стресса. Мерой такой способности служило увеличение площади листа в присутствии тестируемого соединения по сравнению с негативным контролем. Активность В1-01 была наибольшей при 1 мкмоль/л (23% увеличение площади листа по сравнению с контролем). Очевидно, снижение эффекта, наблюдаемое при больших концентрациях вещества, было связано с токсическим действием вещества. Второй потенциальный протектор (SP-13), обладал меньшей активностью, которая была наиболее выражена при внесении этого вещества в максимальной концентрации.
Сиднонимин B1-05 проявил ярко выраженные ингибиторные свойства на всех трех тестируемых концентрациях (1, 10 и 50 мкмоль/л), площадь листьев ряски была 25-27% меньше по сравнению с контролем. В отличие от B1-05, два других сиднониминов (SP-32, SP-02) проявляли ингибиторные свойства только при самой малой концентрации 1 мкмоль/л, при этом площадь листьев опытных растений была на 10% меньше, чем у контрольных растений. У других сиднониминов SP-33, SP-17 ингибиторный эффект проявлялся только при нанесении их в концентрации 10 мкмоль/л, при этом площадь листьев становилась на 15% и 9% меньше, соответственно, чем в контроле. Следующая группа сиднониминов проявляла ингибирующий эффект при внесении их в среду в самых больших концентрациях 50 мкмоль/л: B1-09 (эффект проявлялся на 23%), SP-24 (24%), SP-27 (14%), SP-33 (14%). Данные эксперименты показали, что первый этап эксперимента дал ожидаемые результаты, т.е. как минимум, два соединения показали протекторный эффект.
3. На третьем этапе выполнения проекта было принято решение изучить способность исследуемых веществ повышать устойчивость к засухе на более сложных модельных организмах. При этом, было принято решение отказаться от арабидопсиса в пользу ячменя, который является также хорошо охарактеризованным модельным организмом, но в то же время он более релевантен как сельскохозяйственно ценная культура. Также, поскольку особенности физиологического ответа на засуху ряски могут отличаться от реакции наземных организмов на стресс, было принято решение провести эксперименты со всеми исследуемыми веществами, а не только рядом выбранных – наиболее активных в тест-системе, основанной на ряске, что явилось значительным перевыполнением плана. Для растений ячменя модель экспериментальной засухи создавалась путем прерывания полива. Скрининг 32 сиднониминов (вместо трех, как рассчитывалось изначально) позволил составить более детальное представление о структуре ответа растений на нанесение этих соединений на поверхность листьев, а также выбрать надежных кандидатов для последующих экспериментов с горохом (раздел 4). Тот факт, что скрининг такого широкого круга соединений несколько сдвинул начало работ по выявлению засухопротекторного потенциала сиднониминов в отношении гороха, компенсируется значительно более надежным выбором кандидатов для этих работ. Последнее является немаловажным, так как, в силу больших размеров растений, фитоэффекторные работы с растениями гороха требуют высокого расхода синтезированных веществ.
В эксперименте использовались семена ячменя Golden promise (Схема 1). После прорастания семян во влажном вермикулите проростки поливали через день 1/5 раствором Хогланда (100 мл) [14]. На 19 день после прорастания, измеряли такие физиологические параметры растений как относительное содержание хлорофилла (с помощью прибора SPAD 502 Plus), эффективность фотосистемы II (MINI-PAM II флуорометром), устьичная проводимость (порометром AP4). После этого полив растений опытной группы был прекращен (создание экспериментальной засухи). Растения контрольной группы продолжали поливать питательным раствором через день. Для исследования влияния сиднониминов, оценки влияния распыления жидкости и влияния сопутствующих веществ, используемых вместе с сиднониминами (растворитель ДМСО и детергент Твин 20, используемый для облегчения проникновения сиднониминов в ткани листьев) на устойчивость растений к засухе, растения опытной и контрольной групп распределили на следующие подгруппы: 1) растения не опрыскивали во время эксперимента; 2) опрыскивали водой; 3) 0,1% ДМСО; 4) 0,1% Твин 20; 5) раствором с 0,1% ДМСО и 0,1% Твин 20; 6) раствором с 0,1% ДМСО и 0,1% Твин 20 и 10 мкмоль/л униконазола (это вещество использовалось как референсное, так как является высокоэффективным регулятором роста растений, который при применении в комбинации с ДМСО и Твин 20 приводил к улучшению развития растений [15]); 7) раствором с 0,1% ДМСО, 0,1% Твин 20 и тестируемый сиднонимин (10 мкмоль/л). В каждой подгруппе было 8 растений. У растений опытных (+засуха) и контрольных (-засуха) подгрупп опрыскивали все листья с двух сторон соответствующими растворами в день начала, на 5-й и 7-й дни экспериментальной засухи. Этапы эксперимента, а также схема экспериментальных и контрольных групп представлены на Рисунках 4 и 5. После окончания стрессового воздействия, т.е. на 12-й день после прекращения полива, был осуществлен второй этап регистрации физиологических параметров. Указанные физиологические параметры до и после окончания засухи регистрировались с 3-го листа четырех индивидуальных растений (Рис.6-8). По различию значений этих параметров между обработанными и необработанными сиднониминами растений подвергнутых условиям засухи оценивался суммарный эффект сиднонимина увеличить или уменьшить засухоустойчивость растений. Всего в ходе вышеописанного эксперимента было протестировано влияние на устойчивость растений к засухе 32 сиднониминов, структуры которых представлены на Рис 1. Сначала были проведены предварительные эксперименты по исследованию кинетики ответа растений на засуху. При этом было выбрано семь временных точек (3, 6, 7, 9, 12 и 16 дней), в которых измерялись физиологические и биохимические параметры (, производилось опрыскивание перечисленными растворами. На рисунках 9-11 представлены растения контрольные и обработанные тестируемыми растворами. Рисунки 12-16 представляют диаграммы изменения содержания хлорофилла, устьичной проводимости, активности фотосистемы II, продуктов перекисного окисления липидов и глюкозы в листья контрольных растений (±тестируемые растворы) и растений подвергнутых условиям засухи (±тестируемые растворы) в течение 3, 6, 7, 9, 12 и 16 дней. По результатам этих экспериментов была выбрана продолжительность экспериментальной засухи - 12 дней. Таким образом, при исследовании всех индивидуальных веществ была выбрана продолжительность засухи 12 дней.
Как видно из Таблицы 2, большинство исследованных соединений в той или иной степени проявили протекторные свойства непосредственно после нанесения (10 соединений) или на 12 день засухи (20 соединений). В целом, продолжительное нанесение сиднониминов на листовую пластинку ячменя показало значительную эффективность в плане сохранения физиологических показателей растений в условиях экспериментальной засухи. При этом 6 соединений предотвращали или снижали степень деградации хлорофилла, 10 соединений позволяли сохранить активность фотосистемы II, и 18 соединений снижали степень закрытия устьиц, вызванного засухой. Безусловно, наиболее эффективными фитоэффекторами оказались В1-01, SP-24 и SP-26, которые показали эффективность в отношении всех изученных физиологических параметров (Табл. 2). С другой стороны, SP-01 и SP-06 проявляли скорее эффект ингибитора роста, нежели протекторов. Соединения SP-03, SP-04, SP-10 и В1-03 не проявляли какого-либо эффекта в отношении устойчивости растений ячменя к засухе. Интересно, что для остальных 19 соединений эффект был неоднозначным, т.е., как минимум, прослеживался не по всем параметрам, или даже оказывался разнонаправленным для различных параметров. Интересно, что большинство из потенциально протекторных веществ не выявлялось как таковые в модели осмотического стресса ряски. Таким образом, предполагается целесообразным рассмотреть эффект сиднониминов, выявленных как однозначно протекторные на других культурах – пшенице и горохе. Эти эксперименты уже начаты, и соответствующие модели подготовлены для работ следующего этапа. Также было обнаружено, что сиднонимины, выявленные как потенциально протекторные, не показали каких либо ростовых эффектов после предобработки семян до прорастания (т.е. длина корешка предобработанных и непредобработанных семян не отличалась). На втором этапе выполнения проекта эти эксперименты будут повторены еще два раза, чтобы сделать окончательный вывод о наличии эффекта стимуляции роста.
На 4-м этапе выполнения проекта был поставлен отдельный эксперимент, в котором семена гороха линии SGE были предобработаны тремя протекторными фитоэффекторами (В1-01, SP-24, SP-26). Для проведения экспериментов с осмотическим стрессом семена гороха линии SGE стратифицировали (4°C, 48 ч), затем помещали в следующие растворы: воду (контроль); в водной раствор с предварительно растворенным в 0.1% (v/v) ДМСО гербицидом «Зингер» (60% метсульфурон-метил, CAS 74223-64-6) в концентрации 1.1·10-4 г/л (использовали как эталон вещества, проявляющего ингибирующее действие на прорастание семян); в водный раствор тестируемого сиднонимина в концентрациях 1, 10, 50 мкмоль/л. Предобработанные семена проращивали в темноте в течение двух суток. Проросшие семена пересаживали во влажный вермикулит и инокулировали культурой ризобиальных бактерий (Rizobium leguminosarum bv. viciae CIAM 1026), которые были получены из Всероссийского Института Сельскохозяйственной Микробиологии. Таким образом, из семян были получены растения, которые в настоящее время находятся в теплице (16/8 ч день/ночь, 21°C, относительная влажность 75%).
Согласно плану эксперимента на 42-й день после инокуляции растения были разделены на две группы: для контрольной группы полив проводится через день, для экспериментальной группы полив был прекращен (т.е. созданы условия экспериментальной засухи). Таким образом, как описано в наших предыдущих работах [16] засуха была приложена на стадии формирования последнего цветка. Десятидневный период стресса будет завершен в конце этой недели и все стресс-параметры будут охарактеризованы в этом году.
После окончания созревания семян и периода покоя около двух месяцев, будет оценено качество семян в экспериментах по прорастанию (в том числе с использованием метода ускоренного старения), а также содержание основных питательных веществ (т.е. питательная ценность).

Используемая литература

[1] Cherepanov I. A. et al. Tetrahedron Letters 2018 Т. 59 №. 8. С. 727
[2] Cherepanov, I. A. et al. Russian Chemical Bulletin, 58(12), 2474
[3] Самарская А. С. и др. ФГБУ "Российская академия наук", 2015 Т. 463. №. 4. С. 422
[4] S. K. Vohra et al. J. Org. Chem. - 1978 - Vol. 43 № 9 P. 1671
[5] В. Яшунский и др. Ж. Орг.Х. 1960 T. 32 C. 186
[6] M. Gotz et al. J. Het. Chem. - 1970 - Vol. 7 - P. 123
[7] S. K. Vohra et al. J. Org. Chem. 1978 Vol. 43 № 9 P. 1671
[8] M. Gotz et al, J. Het. Chem. 1970 Vol. 7 P. 123
[9] Cherepanov I. A. et al. Russ. Chem. Bull. 2009. Т. 58. №. 12. С. 2474
[10] Cherepanov I. A. et al. Tetrahedron Letters. 2018. Т. 59. №. 8. С. 727
[11] Samarskaya A. S. et al. Tetrahedron. 2018 Т. 74. №. 22. С. 2693
[12] Cherepanov I. A. et al. Journal of Organometallic Chemistry 2021 Т. 943 С. 121841
[13] Geissler, T. et al. J Plant Growth Regul 30, 504–511 (2011)
[14] P. Rajan et al. American Journal of Plant Sciences 10 (2019) 1397
[15] N. Acheampong, et al. Scientific African 12 (2021) e00835.
[16] Leonova T et al.,. (2020). International journal of molecular sciences, 21(2), 567.