Научная проблема, на решение которой направлен проект:
Изучение проблемы вида и генетической структуры популяций у агамных организмов

Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы:
Проблема вида у агамных организмов является одной из ключевых для понимания базовой структуры биологического разнообразия на организменном и популяционном уровне. В отсутствие возможности применять традиционные генетические критерия вида, разработанные для высших организмов, на первый план выходит понятие "морфологического" вида, основанное на поиске видимых отличий между организмами на любом уровне их организации. Однако генетическая основа подобных различий остается еще во многом неясной. В популяциях агамных организмов нет обмена генетической информацией между особями, отчего одиночные мутации накапливаются и приводят как к неминуемо нарастающей генетической дивергенции в целом, так и к деградации отдельных генов ("Храповик Мелера"). Несмотря на это, в большинстве своем морфологические виды оказываются хорошо очерчены генетически. Некоторые из них генетически гомогенны, другие представляют собой набор немногочисленных клональных линий, хорошо отличающихся между собой. Наконец, некоторые виды представлены богатым набором незначительно отличающихся генетических линий, не демонстрирующих выраженного паттерна распределения между локальными популяциями. Механизмы формирования и поддержания популяционной структуры у агамных видов во многих случаях остаются неясными. Боле того, неясным остается то, как агамные виды, лишенные таких стабилизирующих механизмов, как мейотическая рекомбинация, поддерживают свою индивидуальность и отграниченность с течением времени и не "расплываются" в континуум бесконечного генетического и морфологического разнообразия. Проблема особенно актуальна для организмов, в целом обладающих малым числом морфологических признаков с малым диапозоном достоверных различий, таких как голые амебы, отчего такие признаки зачатую перекрываются в разных таксонах. Однако немногочисленные имеющиеся исследования показывают, что это не так, и виды амеб, хорошо отграниченные на морфологическом уровне, обычно отчетливо отграничены и на уровне генетичеcком. Паттерны распространения видов амеб в природных местообитаниях очень слабо изучены на морфологическом уровне и практически не изучены на генетическом. Все это делает более чем актуальной проблему современных популяционно-генетических исследований амебоидных протистов, а сама проблема выходит далеко за рамки голых амеб и представляет собой одну из актуальных общебиологических проблем.

Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность:
Голые лобозные амебы распространены всесветно и являются значимыми компонентами микросообществ, выступая в роли микрохищников и деконструкторов бактериальных матов. Не смотря на значимую роль в микросообществах и частое упоминание в фаунистических работах, методы определения амеб в большинстве случаев ограничиваются лишь световой микроскопией. В связи с этим все схожие между собой изоляты учитываются как один морфологический "вид". Однако хорошо известны примеры скрытого разнообразия и видов-двойников, в том числе и среди голых лобозных амёб. При этом генетическое разнообразие в рамках разных морфологических видов крайне разнородно и генетические различия между морфологически идентичными штаммами может в несколько раз превышать генетическое различие между амёбами сильно отличающимися морфологически. Подобная ситуация требует тщательного изучения генетического разнообразия и построения подробной системы с выделением ОТЕ (операционных таксономических единиц) на молекулярном уровне. В перспективе, эти исследования должны привести к разработке методов и подходов для более адекватной оценки биоразнообразия природных местообитаний. Мы очень мало знаем о влиянии тонких генетических различий на биологию организмов, однако совсем свежий пример с эволюцией коронавирусов показывает, что даже отличия в несколько нуклеотидов в ключевых участках генома могут существенно изменять патогенез и характер заболевания вызываемого этими организмами.

Основная задача проекта — изучить генетическую структуру морфологических видов агамных организмов на примере амёб рода Thecamoeba. Мы ставим себе задачу провести первое масштабное и комплексное исследование этого рода амеб с применением всего необходимого спектра морфологических и молекулярных методов, чтобы получить данные о генетической структуре групп близких видов ("sibling species"), недавно обнаруженных в пределах широко распространенного рода Thecamoeba. Для решения поставленной задачи мы планируем получить и проанализировать полный и современный набор данных - светомикроскопические, ультраструктурные и молекулярные данные, которые позволят нам сделать выводы о популяционной структуре и получить данные о скрытом видовом разнообразии текамеб. Результаты секвенирования позволят значительно расширить базы данных последовательностей широко применяемых молекулярных маркеров, многие из которых будут получены впервые (18s рРНК, Сох 1, HSP90 и ITS 1,2), которые будут являться базой для последующих метагеномных исследований. Также в задачи исследования входит изучение внутривидовой изменчивости и описания нетипичных морфологических форм, периодически наблюдающихся у видов текамеб, которые в будущем позволят более точно идентифицировать виды с помощью светомикроскопических методов. На основе полученных молекулярных данных мы планируем проверить являются ли все филотипы "эндемичными" для локального местообитания или же имеются более широко и менее широко распространенные филотипы, а также оценить общее потенциальное число филотипов в местообитании. Тем самым мы получим преставление о том, соответствует ли популяционная структура текамеб модели умеренного эндемизма.

Решение поставленных задач существенно выходит за рамки конкретного научного направления, связанного с изучением разнообразия и генетической структуры популяций текамебид. Амебы рода Thecamoeba - это группа, достаточно богатая морфологическими признаками, и ее исследование позволит оценить влияние генетической изменчивости именно на морфологию организма. Та же, в свою очередь, определяется особенностями организации и функционирования цитоскелета клетки. Полученные результаты позволят нам в перспективе выйти на проблемы генетической регуляции цитоскелета и его взаимосвязь с морфологией эукариотических клеток. Эти проблемы, в свою очередь, являются фундаментальными для цитологии и биологии клетки в целом. так, нарушения организации клеточного скелета связаны с возникновением ряда аномалий, в том числе и приводящих к опасным заболеваниям человека.

Научная новизна исследований, обоснование того, что проект направлен на развитие новой для научного коллектива тематики
Голые лобозные амебы - представители классов Tubulinea и Discosea являются одним из классических примеров агамных организмов. У подавляющей части видов за всю весьма длительную историю наблюдений не было обнаружено ничего похожего на половой процесс, по крайней мере в его классической форме. Лишь у нескольких представителей этой группы известен (или предполагается) наличие мейоза в жизненном цикле. Тем не менее, многие морфологические виды амеб достаточно хорошо отграничены друг от друга. Более того, имеющиеся отрывочные данные о генетичеcкой структуре видов амеб показывают, что локальные популяции амеб представляют собой смесь нескольких филотипов, часть из которых эндемичны, но некоторые могут встречаться в удаленных местообитаниях. Однако имеющиеся данные получены на очень ограниченном материале и не могут быть использованы для глобальных обобщений и выводов.

Предлагаемый проект представляет собой первую попытку в широком масштабе и на большом объеме материала изучить популяционно-генетическую структуру видов лобозных амеб используя весь арсенал современных методов для морфологических и молекулярных исследований и методов филогеографического анализа. Возможность выполнения работы создана за счет большого объема предшествующих исследований руководителя предлагаемого проекта, в основном посвященных разнообразию, филогении и таксономии амеб отряда Thecamoebida, и представляет собой выход этих исследований на новый уровень методов и тематики на базе имеющейся коллекции штаммов амеб и наработанного набора методов и подходов к изучению этих организмов. В рамках предлагаемого проекта мы планируем создать на этой имеющейся у коллектива основе новую для нас тематику, связанную с изучением генетической структуры локальных популяций голых амеб. Вся основная методическая база, необходимая для выполнения проекта, хорошо известна и освоена и возможность выполнения проекта в этом отношении у нас никакого сомнения не вызывает. Проверяемые в проект идеи и гипотезы имеют ту особенность, что любой полученный результат будет ценным и новым для науки и таким образом полностью снимается проблема возможности "фундаментального" провала проекта. В результате выполнения проекта мы впервые на достаточном количестве материала сможем получить ответ на вопросы, связанные с генетической структурой вида и организацией природных популяций голых амеб. Полученные данные будут существенным вкладом в изучение проблемы вида и видообразования у агамных групп протистов в целом.

Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
Для вида, как для одной из основных биологических единиц, не всегда удается определить четкие границы. Отчасти, на существование этой проблемы указывает отсутствие универсального определения понятия «вид» и наличие нескольких концепций биологического вида (см. Agapow et al., 2004; De Queiroz, 2007; Sigwart, 2018), основанные на разных аспектах биологии живых организмов: генетике, морфологии или экологии. Картина несколько усложняется, когда в сложившейся системе появляются данные о наличии скрытого разнообразия, характеризующееся наличием морфологически схожих видов, имеющих достоверные генетические различия (см. Korshunova et al., 2019; Fiser et al., 2018; De Luca et al., 2021). Обнаружение скрытых видов (“cryptic species” или “sibling species”) наглядно показывает несовершенство систем построенных лишь на морфологических признаках и ставит вопрос об пересмотре методов оценки биоразнообразия, принимая во внимание постоянно увеличивающееся количество данных о скрытом видовом разнообразии организмов (Fišer et al., 2018; Marrone et al., 2022; Mesentsev et al., 2022). Изменение набора признаков, используемых для идентификации видов или переход на другой уровень идентификации (например, от морфологии к молекулярным данным) часто обесценивает большую часть предшествующих работ. В настоящее время молекулярные данные, вероятно, являются самым надежным и наиболее объективным источником признаков не зависящих от внутривидовой изменчивости, особенностей развития отдельных особей, стадий жизненного цикла или физиологического состояния организма (Škaloud and Rindi, 2013, Drachko et al., 2020; Mesentsev and Smirnov, 2021).

В современных исследованиях молекулярные данные видов являются одним из основных инструментов систематиков. Однако, при анализе фауны протистов даже из относительно небогатых видами местообитаний получение сиквенсов маркерных генов каждого обнаруженного организма технически является практически невыполнимой задачей (Melton et al., 2019; Surkova et al., 2022). Метагеномные исследования также не могут гарантировать обнаружение и правильную идентификацию всех видов, населяющих биотоп, из-за различных генетических особенностей отдельных таксонов или ощутимого количественного превосходства копий маркерных генов отдельных организмов в образцах (Berger et al., 2011; Corsaro and Venditti, 2013; Geisen et al., 2015; Matthey-Doret et al., 2021; Mesentsev et al., 2022, файл с доп. информацией). В связи с этим, разработка конгруэнтой системы, основанной на очевидных и удобных морфологических признаках, молекулярных данных и результатах филогенетического анализа, а также описание и анализ случаев, препятствующих правильной идентификации видов, является одним из приоритетных направлений, предшествующих точной оценке биоразнообразия (Škaloud et al., 2020). При изучении разнообразия, равно как и при исследованиях отдельных видов (в особенности патогенных и хозяйственно значимых видов) принципиально важно четко понимать, с какой именно "единицей разнообразия" исследователь имеет дело. В настоящее время для этого прежде всего необходимо понимать, что такое вид и как морфологические виды (единицы разнообразия, с которыми мы имеем дело в природе, на "физическом" уровне) связаны с генетическим разнообразием и какова генетическая структура морфологических видов изучаемых организмов.

Голые лобозные амебы распространены всесветно и населяют водные и наземные местообитания. Они часто фигурируют в фаунистических работах как обычных местообитаний, так и достаточно "экзотичных", таких как гиперсалинные и серные водоемы, зоны вечной мерзлоты, а так же зачастую могут быть выделены с поверхности или из других тканей растений и животных (Mulec et al., 2015; Borovičková et al., 2018; Malavin et al,. 2020; Berrilli et al., 2021; Kudryavtsev et al., 2021). Среди амебоидных протистов есть достаточно опасные патогены человека и животных, такие как акантамебы, баламутия, энтамебы. Некоторые другие группы лобозных амеб, включая и представителей отряда Thecamoebida, изолировались из тканей человека и животных и считаются условно патогенными организмами (например, Sappinia diploidea, Thecamoeba hoffmani). Помимо этого, в цитоплазме амеб обитает большое количество эндобиотических бактерий и вирусов (Paranjape et al., 2020). Среди них известны такие опасные патогены как легионеллы и микобактерии, более того, известно, что сосуществование с амебами приводит к повышению вирулентности бактерий. Амебы могут служить стабильным экологическим резервуаром для микобактерий, Legionella, Rickettsia (Horn and Wagner, 2004; Ogata et al., 2006; Lahiri and Krahenbuhl, 2008). Показано, что микобактерии могут размножаться в простейших в течение 6 лет без какого-либо очевидного вредного воздействия на оба микроорганизма (Yu et al., 2007). Таким образом, амебы могут служить векторами патогенных бактерий и вирусов, которые сохраняются в цитоплазме клеток амеб и, особенно, в цистах амеб в течении многих лет и в любой момент могут быть выделены клеткой во внешнюю среду. Существует более 500 видов бактерий, потенциально патогенных для человека, из них более 100 способны сохраняться и размножаться внутри клеток амеб (Thomas and McDonnell 2007; Thomas et al., 2010). Более того, внутри цист амебы бактерии могут оставаться скрытыми и защищенными от обычного антибактериального лечения, таким образом, распространяя их de-novo в предположительно стерильной среде (Zhenzhen et al., 2021). Последнее особенно актуально для бассейнов и больниц, так как здесь это явление оказывает прямое влияние на здоровье населения (e.g., Kilvington and Price, 1990; Molmert et al., 2005; Mella et al., 2016; Cateau et al., 2014). Из-за этого амеб часто называют «троянскими конями» микробного мира (Barker and Brown, 1994).

Амёбы являются значимыми компонентами микросообществ, выступая в роли микрохищников и деконструкторов бактериальных матов. Амебоидные протисты, будучи активными потребителями грибов, бактерий и (для некоторых групп) одноклеточных водорослей, активно регулируют их численность в экосистеме. Способность амеб активно разрушать бактериальный биофильм на поверхности различных субстратов и делать его доступным для утилизации другими группами организмов уникальна и во многом является определяющей при регуляции роста биофильм-образующих бактерий в природных местообитаниях. Даже обычные подсчеты на морфологическом уровне показывают, что в некоторых местообитаниях голые и раковинные амебы составляют до 70% общей численности протистов, что в количественном выражении составляет десятки миллионов экземпляров на квадратный метр экотопа (Ardnt 1993). Высокая скорость роста и размножения протистов, которые могут достигать очень высокой численности, позволяет им вносить весьма существенный вклад в потоки энергии и круговорот вещества в экосистемах. Например, протозойное сообщество может продуцировать до 1 kmol CO2/km2/h при 20 градусах Цельсия на квадратный сантиметр поверхности. В северных широтах их вклад в тотальную продукцию углекислого газа может составлять до 20%, делая их существенным компонентом глобального круговорота углерода и выделения углекислого газа (Rogerson 1991; Anderson 1997).

Несмотря на значимую роль в микросообществах и частое упоминание в фаунистических работах, методы идентификации видов амеб в подобных работах в большинстве случаев ограничиваются лишь световой микроскопией (например, Patsyuk and Uvayeva, 2019; Surkova et al., 2022) . При таком подходе ощутимо чувствуется нехватка морфологических признаков у этих протистов для построения подробной системы. Амёбы имеют изменчивые очертания при движении. Признак так называемой "локомоторной формы" - формы амёбы в движении в большинстве случаев позволяет определять амеб только до уровня рода. Дальнейшее определение амёб происходит по более тонким признакам, таким как например морфология ядра, которая, как мы недавно показали, может изменяться в течение клеточного цикла или под влиянием внешних факторов (Mesentsev and Smirnov, 2021), что может внести ошибку в подсчеты и оценку биоразнообразия различных местообитаний. В последнее десятилетие стало очевидным, что возможности описания, классификации и систематизации амеб опираясь исключительно на понятие «морфологического вида» практически исчерпаны. Морфологические признаки, как светомикроскопические так и ультраструктурные позволяют достаточно надежно очертить роды голых амеб, но во многих случаях не позволяют достоверно различать виды. Во многих родах амеб внутривидовая морфологическая изменчивость значительно перекрывает межвидовую (см. Smirnov and Goodkov 1999; Smirnov and Brown 2004; Smirnov et al. 2007). Фактически, единственным достоверно идентифицированным представителем вида у амеб является типовой изолят, но большинство их к настоящему времени утеряны. Подобная ситуация делает невозможными серьезные популяционные, биогеографические и экологические исследования амеб и приводит к тому, что амебы зачастую полностью выпадают из поля зрения исследователей.

Исследователи надеялись, что с развитием молекулярной систематики удастся решить проблему надежной дифференцировки видов амеб. Однако исследования (например, Dykova et al., 2005; Smirnov et al., 2007) показали, что для амеб характерен необычно высокий уровень полиморфизма гена 18s rRNA, который используется в качестве видового маркера при подобных исследованиях. Кроме того, выяснилось что этот ген у амеб чрезвычайно трудно амплифицировать из экстрактов тотальной ДНК (Fahrni et al. 2003). В некоторых случаях молекулярные исследования показали, что даже штаммы амеб сохраняемые в официальных коллекциях культур водорослей и протистов идентифицированы неверно. В некоторых случаях использование подобных штаммов для филогенетических и таксономических исследований приводит к серьезным ошибкам (см. Smirnov et al. 2007; 2008). В качестве потенциального ДНК - баркода был предложен и опробован ген Cox I – классический баркод у эукариот (Nassonova et al. 2010; Zlatogurski et al. 2016). Этот баркод позволяет достаточно надежно дифференцировать штаммы и морфологические виды амеб, однако его изучение привело нас к пониманию того, что каждый морфологический вид амеб имеет сложную генетическую структуру, представляющую собой систему филотипов. Немногочисленные имеющиеся данные позволяют предположить, что популяции амеб имеют клональную структуру, и что общее количество филотипов амеб в природе ограничено. В цитированных работах показано, что филотипы амеб, принадлежащих к одному хорошо дифференцированному морфологическому виду не пересекаются между собой и формируют отдельные клады на филогенетическом дереве. Однако отсутствие четкого понимания того, как именно дифференцировать морфологические виды у амеб приводит к тому, что практически ничего не известно о пространственной и генетической структуре популяций голых амеб, их ареалах, скорости и механизмах распространения; устойчивости локальных популяций.

Для подавляющей части голых лобозных амеб половой процесс неизвестен, исключений очень немного (Smirnov 2008; Lahr 2011; Tekle 2017). Таким образом, популяции амеб являются клональными по своей природе. Подобные популяции широко распространены в природе. Клональная колония — группа генетически идентичных особей, выросших в одном месте, размножившихся вегетативным, а не половым путём. У растений особь такой популяции называют рамет. У грибов особи развиваются из общего мицелия, скрытого в почве. Клональные колонии распространены у многих видов растений. Хотя часть из них размножается половым путём посредством семян, размножение может осуществляться в некоторых случаях за счёт подземных столонов и корневищ. Над землёй эти растения кажутся отдельными особями, поэтому клональные колонии у растений не всегда легко распознать. Существуют многочисленные примеры клональности у паразитических организмов (например, диплокариотические микроспоридии) и многих других групп (Гребельный 2005, 2006; De Meeûs and Prugnolle 2011). Генетическая структура клональных популяций может быть весьма сложной и зависит от биологии организмов, возможностей для их расселения, конкуренции внутри популяции и ряда других причин. В большинстве случаев процессы формирования генетической структуры подобных популяций требуют дальнейшего изучения, а для протистов они вообще практически неизвестны.

Генетическое разнообразие в рамках морфологических видов голых амеб крайне разнородно и генетические различия между морфологически идентичными штаммами амеб может в несколько раз превышать генетическое различие между амёбами сильно отличающимися морфологически (см. Smirnov et al. 2002). Подобные ситуации известны, например, для амеб отряда Leptomyxida и ряда других групп (Smirnov et al. 2017; Kulishkin et al. 2022). Обратным примером является существование "видов-двойников", когда морфолгически идентичные (или очень схожие) штаммы оказываются генетически различными. Одним из недавних примеров такой ситуации является описание руководителем предлагаемого проекта видов-двойников в роде Thecamoeba, который считался чуть ли не единственной группой голых лобозных амёб, в которой можно определить достоверно виды с помощью только светомикроскопических методов (Page 1977; 1988). Все эти данные делают проблему изучения генетической структуры видов амеб одной из приоритетных в этой области исследований, без ее решения практически любое дальнейшее развитие будет существенно ограничено (или даже заблокировано) непониманием того, с какими именно популяционными единицами мы имеем дело или, иными словами, что именно мы называем "видом амеб".

Амебы рода Thecamoeba являются очень удачными модельными объектами для такого рода исследований. Виды текамеб широко распространены в пресной воде, встречаются в морских местообитаниях и наземных местообитаниях, в которых они являются одними из самых крупных протистов в наземных местообитаниях. Род Thecamoeba включает в себя голых лобозных амеб относящихся к ругозному и стриатному морфотипам (Smirnov and Goodkov 1999; Smirnov and Brown 2004). Текамеб сравнительно просто опознать в культурах благодаря складкам и гребням на поверхности клетки и гладким очертаниям при локомоции. Согласно работам Пэйджа 1971 и 1977 годов, которые, по сути, являются монографией по представителям рода Thecamoeba, известно 18 видов, которые могут принадлежать к роду Thecamoeba. Также Пэйдж указывает, что в своих работах он не упоминает некоторые «виды», связывая это с тем, что их описание является сомнительным, и считает, что эти названия должны быть забыты (Page 1971, 1977). На данный момент род Thecamoeba содержит 11 валидных видов, для которых есть подробное описание и иллюстрации (Page 1991; Smirnov 1999; Kudryavtsev and Hausmann 2004, Mesentsev and Smirnov 2018; Mesentsev et al. 2020). На основании этих данных виды сравнительно легко можно определить как представителей рода Thecamoeba и различить между собой. В литературе можно встретить больше видов, которые формально названы Thecamoeba и потенциально могут принадлежать к этому роду. Однако, с точки зрения современной системы в описании этих видов сильно не хватает данных, чтобы достоверно отнести их к роду Thecamoeba, а некоторые виды почти невозможно распознать, даже если они окажутся найдены (Page 1977, 1991).

Количество последовательностей гена 18s рРНК, принадлежащих представителям рода Thecamoeba остается небольшим. GenBank содержит последовательности всего восьми видов из 11 подробно описанных - T. similis, T. foliovenanda, T. cosmophorea, T. astrologa, T. vumurta, T. striata, T. aesculea и T. quadrilineata, три из которых описаны нами совсем недавно как близкие виды "классических" видов. Кроме того, есть последовательности, обозначенные как Thecamoeba sp., но на самом деле представляющие другие группы Amoebozoa. «Thecamoeba sp. ATCC PRA-35» относится к Parvamoeba monoura (Cole et al. 2010), а «Thecamoeba sp. Штамм JRG-2011 ATCC 50185» является Sappinia (Corsaro et al. 2017). Имеются также транскриптомные данные о штамме Thecamoeba quadrilineata ATCC PRA-259, который по происхождению является штаммом CCAP 1583/10 (Tekle et al. 2016), и данные о неидентифицированном штамме «Thecamoeba sp. SK13-4B» (Kang et al. 2017). Основная причина такого ограниченного набора данных - отсутствие типовых штаммов, которые были утрачены в международных коллекциях культур до того, как из них были получены образцы ДНК.
Также для представителей рода Thecamoeba описано немало взаимоотношений с другими организмами. T. quadrilineata упоминается как хозяин паразитического гриба Cochlonema euryblastum и как жертва другого гриба - Acaulopage tetraceros (Michel and Wylezich 2005; Michel et al. 2014; Michel et al. 2015; Koehsler et al. 2007). Также известно, что этот вид является хозяином внутриядерного паразита Nucleophaga amoebae из группы Opisthosporidia (Michel et al. 2009; Corsaro et al. 2014). Другой вид внутриядерных паразитов Nucleophaga terricolae описан из вида T. terricola (Corsaro et al., 2016). Кроме того, было упомянуто, что амебы T. quadrilineata могут поглощать ооцисты Cryptosporidium parvum (Apicomplexa, Eucoccidiorida) и, таким образом, быть потенциальным переносчиком этого паразита (Scheid and Schwarzenberger 2011). Также вид T.quadrilineata был выделен из кишки дождевого червя, что показывает возможность перехода этих амёб к амфизойному образу жизни, который зачастую является предпосылкой к паразитизму (Borovičková et al., 2018).

Недавние исследования показывают, что в пределах рода Thecamoeba существуют пары видов, которые трудно или невозможно различить только методами световой микроскопии. Первым примером был вид T. aesculea, который имеет незначительные отличия от T. sphaeronucleolus (Kudryavtsev and Hausmann 2009). В результате наших исследований были обнаружены ещё четыре пары видов-двойников (“sibling species”) для одних из самых широко распространенных видов родов Thecamoeba и близкого рода Stenamoeba. Виды в этих парах практически не различимы на морфологическом уровне, и только молекулярные данные позволяют надежно их дифференцировать. Эти результаты показывают, что разнообразие амеб отряда Thecamoebida в природе в разы превышает известные 18 видов, а под маской одного морфологического вида могут скрываться несколько видов-двойников, обладающих весьма тонкими морфологическими отличиями. На данный момент все обнаруженные виды-двойники образуют монофилетические ветви на филогенетических деревьях, что позволяет выделять морфологические группы и, в случае сомнений, определять изученный изолят не как таксономический вид, а как амёбу относящуюся к видовой группе (файл с доп. информацией). Использование этого подхода помогло бы нам избежать путаницы с упоминанием видов в работах, где молекулярные методы не применялись для видовой идентификации (Mesentsev et al., 2022).

Предложение идентифицировать и разделять отдельные виды на основе молекулярных данных ставит вопрос о стабильности такого рода маркеров, поскольку для большинства голых лобозных амёб половой процесс не описан, а значит в популяциях практически нет обмена генетической информацией между особями, отчего одиночные мутации накапливаются и приводят к неминуемо нарастающей генетической дивергенции. Однако, работы по изучению генетической структуры видов у амеб показали, что локальные популяции голых амеб по всей видимости представлены ограниченным набором генетических линий, некоторые из которых эндемичны для конкретного местообитания, в то время как другие могут быть широко распространены (Nassonova et al., 2010; Zlatogurski et al., 2016). Схожие данные были получены неоднократно, например агамные виды зеленых водорослей и высшие растения, размножающихся исключительно вегетативно (Škaloud and Rindi, 2013; Huang et al., 2021). В наших работах виды T. quadrilineata, T. foliovenanda, T.striata и T.aesculea, штаммы которых выделены из сильно удаленных географически местообитаний, также показывают стабильность сиквенсов генов SSU и Cox I. Однако, отсутствие понимания того, как именно соотносятся разнообразие морфологических видов и разнообразие сиквенсов генов, обнаруженных в природных местообитаниях, до сих пор не позволяет даже ориентировочно оценить, насколько хорошо изучено биоразнообразие амеб и дать оценку потенциального общего числа видов амеб в природе. Таким образом, генетическая структура клональных организмов не представляет собой пример "бесконечного разнообразия" генов и нуждается в дальнейшем тщательном изучении с учетом особенностей биологии и, во многих случаях, экологии этих организмов.

Область исследований, в которой мы работаем, к счастью в основном свободна от конкуренции. С немногочисленными научными группами занимающимися схожими тематиками (Y. Tekle, D. Lahr, M. Brown, J. Pawlowski) мы поддерживаем хорошие рабочие отношения и развиваем кооперацию. Непосредственно проблемой генетической структуры популяций лобозных амеб не занимается сейчас никто, поэтому прямых конкурентов у проекта нет.

Основная цитируемая литература:
Гребельный, С. Д. (2006). Много Ли На Свете Клональных Видов. Часть 2. Клонирование В Природе, Его Роль В Формировании Разнообразия Фауны И Флоры. Зоология Беспозвоночных, 3(1), 77–109.
Гребельный, С. Д. (2005). Много ли на свете клональных видов. Часть 1. Отличие клональных форм от обычных двуполых видов. Зоология Беспозвоночных, 2(1), 79–102.
Старобогатов Я.И. (1985) Проблема видообразования. Всесоюзный институт научной и технической информации. Итоги Науки и техники. Серия "Общая геология". Т. 20. М.:ВИНИТИ, 94 с
Adl, S. M., Leander, B. S., Simpson, A. G. B., Archibald, J. M., Anderson, O. R., Bass, D., Bowser, S. S., Brugerolle, G., Farmer, M. A., Karpov, S., Kolisko, M., Lane, C. E., Lodge, D. J., Mann, D. G., Meisterfeld, R., Mendoza, L., Moestrup, Ø., Mozley-Standridge, S. E., Smirnov, A. V., & Spiegel, F. (2007). Diversity, nomenclature, and taxonomy of protists. Systematic Biology, 56(4), 684–689. https://doi.org/10.1080/10635150701494127
Agapow, P., Bininda‐Emonds, O. R. P., Crandall, K. A., Gittleman, J. L., Mace, G. M., Marshall, J. C., & Purvis, A. (2004). The Impact of Species Concept on Biodiversity Studies. The Quarterly Review of Biology, 79(2), 161–179. https://doi.org/10.1086/383542
Anderson, O. R. (1997). Annual abundances, diversity and growth potential of gymnamoebae in a shallow freshwater pond. Journal of Eukaryotic Microbiology, 44(5), 393–398. https://doi.org/10.1111/j.1550-7408.1997.tb05714.x
Arndt H. A critical review of the importance of rhizopods (naked and testate amoebae) and actinopods (heliozoa) in lake plankton // Mar. Microb. Food Webs. 1993. Vol. 7. P. 3-29.
Barker, J., & Brown, M. R. W. (1994). Trojan horses of the microbial world: protozoa and the survival of bacterial pathogens in the environment. Microbiology, 140(6), 1253-1259.
Berger, S. A., Krompass, D., & Stamatakis, A. (2011). Performance, accuracy, and web server for evolutionary placement of short sequence reads under maximum likelihood. Systematic Biology, 60(3), 291–302. https://doi.org/10.1093/sysbio/syr010
Berrilli, F., Di Cave, D., Novelletto, A., & Montalbano Di Filippo, M. (2021). PCR-based identification of thermotolerant free-living amoebae in Italian hot springs. European Journal of Protistology, 80, 125812. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2021.125812
Borovičková, T., Mrva, M., & Garajová, M. (2019). Thecamoeba quadrilineata (Amoebozoa, Lobosa) as a new member of amphizoic amoebae—first isolation from endozoic conditions. Parasitology Research, 118(3), 1019–1023. https://doi.org/10.1007/s00436-019-06207-y
Cateau, E., Delafont, V., Hechard, Y., & Rodier, M. H. (2014). Free-living amoebae: what part do they play in healthcare-associated infections?. Journal of Hospital Infection, 87(3), 131-140.
Corsaro, D., & Venditti, D. (2013). Molecular phylogenetics evidence for a novel lineage of amoebae within Discosea (Amoebozoa: Lobosa). Acta Protozoologica, 52(4), 309–316. https://doi.org/10.4467/16890027AP.13.028.1320
De Luca, D., Piredda, R., Sarno, D., & Kooistra, W. H. C. F. (2021). Resolving cryptic species complexes in marine protists: phylogenetic haplotype networks meet global DNA metabarcoding datasets. ISME Journal, 15(7), 1931–1942. https://doi.org/10.1038/s41396-021-00895-0
De Queiroz, K. (2007). Species concepts and species delimitation. Systematic Biology, 56(6), 879–886. https://doi.org/10.1080/10635150701701083ё
Drachko, D., Shɨshkin, Y., & Zlatogursky, V. V. (2020). Phenotypic masquerade: Polymorphism in the life cycle of the centrohelid heliozoan Raphidiophrys heterophryoidea (Haptista: Centroplasthelida). European Journal of Protistology, 73. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125686Fišer, C., Robinson, C. T., & Malard, F. (2018). Cryptic species as a window into the paradigm shift of the species concept. Molecular Ecology, 27(3), 613–635. https://doi.org/10.1111/mec.14486
Dyková, I., Nowak, B. F., Crosbie, P. B. B., Fiala, I., Pecková, H., Adams, M. B., Macháčková, B., & Dvořáková, H. (2005). Neoparamoeba branchiphila n. sp., and related species of the genus Neoparamoeba Page, 1987: Morphological and molecular characterization of selected strains. Journal of Fish Diseases, 28(1), 49–64. https://doi.org/10.1111/j.1365-2761.2004.00600.x
Fahrni, J. F., Bolivar, I., Berney, C., Nassonova, E., Smirnov, A., & Pawlowski, J. (2003). Phylogeny of lobose amoebae based on actin and small-subunit ribosomal RNA genes. Molecular Biology and Evolution, 20(11), 1881–1886. https://doi.org/10.1093/molbev/msg201
Fišer, C., Robinson, C. T., & Malard, F. (2018). Cryptic species as a window into the paradigm shift of the species concept. Molecular Ecology, 27(3), 613–635. https://doi.org/10.1111/mec.14486
Hörandl, E., Bast, J., Brandt, A., Scheu, S., Bleidorn, C., Cordellier, M., Nowrousian, M., Begerow, D., Sturm, A., Verhoeven, K., Boenigk, J., Friedl, T., & Dunthorn, M. (2020). Genome Evolution of Asexual Organisms and the Paradox of Sex in Eukaryotes. In Evolutionary Biology—A Transdisciplinary Approach (pp. 133–167). Springer International Publishing. https://doi.org/10.1007/978-3-030-57246-4_7
Huang, R., Wang, Y., Li, K., & Wang, Y. Q. (2021). Genetic variation and population structure of clonal Zingiber zerumbet at a fine geographic scale: a comparison with two closely related selfing and outcrossing Zingiber species. BMC Ecology and Evolution, 21(1), 1–13. https://doi.org/10.1186/s12862-021-01853-2
Horn, M., & Wagner, M. (2004). Bacterial endosymbionts of free‐living amoebae 1. Journal of Eukaryotic Microbiology, 51(5), 509-514.
Geisen, S., Tveit, A. T., Clark, I. M., Richter, A., Svenning, M. M., Bonkowski, M., & Urich, T. (2015). Metatranscriptomic census of active protists in soils. The ISME Journal, 9(10), 2178–2190. https://doi.org/10.1038/ismej.2015.30
Kang, S., Tice, A. K., Spiegel, F. W., Silberman, J. D., Pánek, T., Čepička, I., Kostka, M., Kosakyan, A., Alcântara, D. M. C., Roger, A. J., Shadwick, L. L., Smirnov, A., Kudryavtsev, A., Lahr, D. J. G., & Brown, M. W. (2017). Between a pod and a hard test: the deep evolution of amoebae. Molecular Biology and Evolution, 34(9), 2258–2270. https://doi.org/10.1093/molbev/msx162
Kilvington, S., & Price, J. (1990). Survival of Legionella pneumophila within cysts of Acanthamoeba polyphaga following chlorine exposure. Journal of applied bacteriology, 68(5), 519-525.
Korshunova, T., Picton, B., Furfaro, G., Mariottini, P., Pontes, M., Prkić, J., Fletcher, K., Malmberg, K., Lundin, K., & Martynov, A. (2019). Multilevel fine-scale diversity challenges the ‘cryptic species’ concept. Scientific Reports, 9(1), 1–23. https://doi.org/10.1038/s41598-019-42297-5
Kudryavtsev, A., Volkova, E., & Voytinsky, F. (2021). Protistology A checklist of Amoebozoa species from marine and brackish-water biotopes with notes on taxonomy , species concept and distribution patterns (Vol. 15, Issue 4). https://doi.org/10.21685/1680-0826-2021-15-4-3
Lahiri, R., & Krahenbuhl, J. L. (2008). The role of free-living pathogenic amoeba in the transmission of leprosy: a proof of principle. Leprosy review, 79(4), 401-409.
Lahr, D. J. G., Parfrey, L. W., Mitchell, E. A. D., Katz, L. A., & Lara, E. (2011). The chastity of amoebae: Re-evaluating evidence for sex in amoeboid organisms. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 278(1715), 2081–2090. https://doi.org/10.1098/rspb.2011.0289
Matthey-Doret, C., Colp, M. J., Escoll, P., Thierry, A., Curtis, B., Sarrasin, M., Gray, M. W., Lang, B. F., Archibald, J. M., Buchrieser, C., & Koszul, R. (2021). Chromosome-scale assemblies of Acanthamoeba castellanii genomes provide insights into Legionella pneumophila infection-related chromatin re-organization. BioRxiv, 2021.10.26.465878. https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.10.26.465878v1%0Ahttps://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.10.26.465878v1.abstract
Marrone, F., Fontaneto, D., & Flores, L. N. (2022). Cryptic diversity, niche displacement and our poor understanding of taxonomy and ecology of aquatic microorganisms. Hydrobiologia, 0123456789. https://doi.org/10.1007/s10750-022-04904-x
Malavin, S., Shmakova, L., Claverie, J.-M., & Rivkina, E. (2020). Frozen Zoo: a collection of permafrost samples containing viable protists and their viruses. Biodiversity Data Journal, 8(July). https://doi.org/10.3897/BDJ.8.e51586
Mella, C., Medina, G., Flores-Martin, S., Toledo, Z., Simaluiza, R. J., Pérez-Pérez, G., & Fernández, H. (2016). Interaction between zoonotic bacteria and free living amoebas. A new angle of an epidemiological polyhedron of public health importance?. Austral Journal of Veterinary Sciences, 48(1), 1-10.
Melton, J. T., Wood, F. C., Branch, J., Singla, M., & Tekle, Y. I. (2019). Phylogenomics of Thecamoebida (Discosea, Amoebozoa) with the Description of Stratorugosa tubuloviscum gen. nov. sp. nov., a Freshwater Amoeba with a Perinuclear MTOC. Protist, 170(1), 8–20. https://doi.org/10.1016/j.protis.2018.09.002
Mesentsev, Y. S., & Smirnov, A. V. (2019). Thecamoeba cosmophorea n. sp. (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) — An example of sibling species within the genus Thecamoeba. European Journal of Protistology, 67, 132–141. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2018.12.003
Mesentsev, Y., & Smirnov, A. (2021). Thecamoeba astrologa n. sp. – a new species of the genus Thecamoeba (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) with an unusually polymorphic nuclear structure. European Journal of Protistology, 81, 125837. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2021.125837
Mesentsev, Y., Bondarenko, N., Nassonova, E., & Smirnov, A. (2021). Vannella primoblina n. sp. – an unusual species of the genus Vannella (Amoebozoa, Discosea, Vannellida) with pronounced dorsal ridges and folds. European Journal of Protistology, 77, 125757. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125757
Mesentsev, Y., Kamyshatskaya, O., & Smirnov, A. (2020). Thecamoeba foliovenanda n. sp. (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) – One more case of sibling species among amoebae of the genus Thecamoeba. European Journal of Protistology, 76, 125716. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125716
Mesentsev, Y., Kamyshatskaya, O., Nassonova, E., & Smirnov, A. (2022). Thecamoeba vumurta n. sp. (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) from freshwater pond sediment – a sibling species of T. striata (Penard, 1890) Schaeffer, 1926. European Journal of Protistology, 83, 125866. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2022.125866
Mulec, J., Dietersdorfer, E., Üstüntürk-Onan, M., & Walochnik, J. (2015). Acanthamoeba and other free-living amoebae in bat guano, an extreme habitat. Parasitology Research, 115(4), 1375–1383. https://doi.org/10.1007/s00436-015-4871-7
Nassonova, E., Smirnov, A., Fahrni, J., & Pawlowski, J. (2010). Barcoding Amoebae: Comparison of SSU, ITS and COI Genes as Tools for Molecular Identification of Naked Lobose Amoebae. Protist, 161(1), 102–115. https://doi.org/10.1016/j.protis.2009.07.003
Nemjová, K., Neustupa, J., Št’astný, J., Škaloud, P., & Veselá, J. (2011). Species concept and morphological differentiation of strains traditionally assigned to Micrasterias truncata. Phycological Research, 59(3), 208–220. https://doi.org/10.1111/j.1440-1835.2011.00619.x
Ogata, H., La Scola, B., Audic, S., Renesto, P., Blanc, G., Robert, C., ... & Raoult, D. (2006). Genome sequence of Rickettsia bellii illuminates the role of amoebae in gene exchanges between intracellular pathogens. PLoS genetics, 2(5), e76.
Page, F. C. (1971). A Comparative Study of Five Fresh-Water and Marine Species of Thecamoebidae. Transactions of the American Microscopical Society, 90(2), 157–173.
Page, F. C. (1977). The genus Thecamoeba (Protozoa, Gymnamoebia) Species distinctions, locomotive morphology, and protozoan prey. In Journal of Natural History (Vol. 11, Issue 1, pp. 25–63). https://doi.org/10.1080/00222937700770031
Paranjape, K., Bédard, É., Shetty, D., Hu, M., Choon, F. C. P., Prévost, M., & Faucher, S. P. (2020). Unravelling the importance of the eukaryotic and bacterial communities and their relationship with Legionella spp. ecology in cooling towers: a complex network. Microbiome, 8(1), 1–19. https://doi.org/10.1186/s40168-020-00926-6
Patsyuk, M., & Uvayeva, O. (2019). Freshwater Naked Amoebae ( Tubulinea , Discosea , Heterolobosea ) of the Zakarpattia Region and the Surrounding Areas ( Ukraine ). Lesia Ukrainka Eastern European National University Scientific Bulletin Series: Biological Sciences, 3(387), 109–115.
Rogerson, A. (1991). On the abundance of marine naked amoebae on the surface of five species of macroalgae. FEMS Microbiology Letters, 85(4), 301–312. https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.1991.tb04756.x
Sigwart, J. D. (2018). What Species Mean. CRC Press. https://doi.org/10.1201/9780429458972
Škaloud, P., & Rindi, F. (2013). Ecological differentiation of cryptic species within an asexual protist morphospecies: A case study of filamentous green alga Klebsormidium (Streptophyta). Journal of Eukaryotic Microbiology, 60(4), 350–362. https://doi.org/10.1111/jeu.12040
Škaloud, P., Škaloudová, M., Jadrná, I., Bestová, H., Pusztai, M., Kapustin, D., & Siver, P. A. (2020). Comparing Morphological and Molecular Estimates of Species Diversity in the Freshwater Genus Synura (Stramenopiles): A Model for Understanding Diversity of Eukaryotic Microorganisms. Journal of Phycology, 56(3), 574–591. https://doi.org/10.1111/jpy.12978
Smirnov, A. V., & Brown, S. (2004). Guide to the methods of study and identification of soil gymnamoebae. Protistology, 3(3), 148–190.
Smirnov, A. V., & Goodkov, A. V. (1999). An Illustrated list of basic morphotypes of Gymnamoebia (Rhizopoda, Lobosea). Protistology, 1, 20–29.
Smirnov, A. V., Nassonova, E. S., Chao, E., & Cavalier-Smith, T. (2007). Phylogeny, evolution, and taxonomy of vannellid amoebae. Protist, 158(3), 295–324. https://doi.org/10.1016/j.protis.2007.04.004
Surkova A. A, Kulishkin N. S., Tsyganov A. N., Mesentsev Y. S., Kamyshatskaya O. G., Smirnov A. V., Yang J., & Mazei A. Yu. (2022) Diversity and abundance of naked lobose amoebae belonging to the classes Tubulinea and Discosea (Amoebozoa) in the bottom sediments of ponds, located in Moscow urban parks. Protistology, 16(2)
Thomas, V., & McDonnell, G. (2007). Relationship between mycobacteria and amoebae: ecological and epidemiological concerns. Letters in applied microbiology, 45(4), 349-357.
Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., & Maillard, J. Y. (2010). Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS microbiology reviews, 34(3), 231-259.
Tekle, Y. I., Anderson, O. R., Katz, L. A., Maurer-Alcala, X. X., Romero, M. A. C., & Molestina, R. (2016). Phylogenomics of “Discosea”: A new molecular phylogenetic perspective on Amoebozoa with flat body forms. Molecular Phylogenetics and Evolution, 99, 144–154. https://doi.org/10.1016/j.ympev.2016.03.029
Yu, H. S., Jeong, H. J., Hong, Y. C., Seol, S. Y., Chung, D. I., & Kong, H. H. (2007). Natural occurrence of Mycobacterium as an endosymbiont of Acanthamoeba isolated from a contact lens storage case. The Korean Journal of Parasitology, 45(1), 11.
Zlatogursky, V. V., Kudryavtsev, A., Udalov, I. A., Bondarenko, N., Pawlowski, J., & Smirnov, A. (2016). Genetic structure of a morphological species within the amoeba genus Korotnevella (Amoebozoa: Discosea), revealed by the analysis of two genes. European Journal of Protistology, 56, 102–111. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2016.08.001

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта и ожидаемые результаты

1. Источники материала, поддержание коллекции культур
Основным материалом для работы является наша коллекция штаммов амеб семейства Thecamoebidae. Эту коллекцию мы начали собирать в 2013 году, и на данный момент она включает в себя около ста клональных культур текамеб, по всей видимости представляющие не менее 30 морфологических видов. Среди этих видов находятся как штаммы амеб, достоверно (с использованием морфологических и, при необходимости, молекулярных методик) определенные как уже известные виды, так и штаммы, явно представляющие собой новые виды. Несколько видов из этой коллекции нами уже описано (Mesentsev and Smirnov 2019; Mesentsev et al. 2020; 2021). Штаммы коллекции поддерживаются на плотном питательном агаре WMY (Spiegel et al. 1995), что позволяет получить стабильные культуры текамеб, пересеваемые примерно раз в два месяца. Для обеспечения сохранности, коллекция содержится в двух копиях - одна - непосредственно в нашей лаборатории, вторая - в ресурсном центре СПбГУ "Культивирование микроорганизмов". Дополнительно, часть штаммов коллекции криоконсервирована в криобанке ИНЦ РАН.
В ходе выполнения работ, мы будем изучать как уже установленные в коллекции штаммы (с особым вниманием к группам штаммов разного географического происхождения, предварительно отнесенных к одному морфологическому виду), так и пополним банк культур в ходе сбора материала из различных наземных и водных местообитаний в ходе командировок и экспедиционных выездов. Дополнительно мы используем пробы, регулярно доставляемые коллегами из различных регионов РФ, ближнего и дальнего зарубежья. Для высева обогащающих культур, изоляции, клонирования и культивирования штаммов амеб будет использованы ранее описанные и апробированные нами методики (Mesentsev and Smirnov 2019). В рамках этой работы помимо технических возможностей лабораторий кафедры Зоологии беспозвоночных СПбГУ будут использованы технические возможности ресурсного центра «Культивирование микроорганизмов» научного парка СПбГУ.
Дополнительным (но очень важным) материалом, который послужит основой для нашей работы будет коллекция видеозаписей, фотоизображений и электронно-микроскопических заливок типовых штаммов текамебид, выполненных А.В Смирновым в ходе работы в ССАР в 1999 году, а также препараты ДНК многих из этих штаммов, полученные в ходе их изучения в 2005-2007 годах. Практически все эти штаммы в настоящий момент утеряны, и имеющийся у нас материал является уникальным.

2. Морфологические исследования.
Все изучаемые штаммы будут документированы современными методами световой (фазовый контраст, контраст Номарского) и электронной микроскопии, при необходимости - изоляты будут описаны как новые виды или опубликованы необходимые переописания уже известных видов. В ходе исследований мы получим высококачественные фазовые и DIC- фотографии исследованных штаммов, выполним видеозаписи локомоторных форм, которые помогают гораздо более уверенно сравнивать между собой виды амеб, нежели просто фотографии. Видеозаписи будут депонированы как дополнительные материалы к описаниям видов в журнальных публикациях. Будут использованы компьютерные методы оптической деконволюции и Z-stacking-а изображений для повышения глубины резкости фотографий, используя имеющееся у нас программное обеспечение Leica Application Suite с соответствующими модулями расширения, Helicon Focus и NIS-elements Advanced Research. В ходе подобной обработки несколько фотографий клетки сделанных с разной глубиной резкости складываются в стеки для получения резкого изображения клетки с большой глубиной резкости. Полученные изображения мы как правило дорабатываем вручную в программном пакете Adobe для того, чтобы убрать артефакты деконволюции (Mesentsev and Smirnov, 2019). Практически для всех исследованных видов амеб это будут первые высококачественные светомикроскопические изображения со времен работ Ф. Пэйджа 1977-1988 годов. Для более детального изучения морфологии клеточного ядра будут изготовлены постоянные препатаы окрашенные гематоксилином по Гейденгайну. Эта классическая методика (к сожалению, редко применяемая в настоящее время) очень хорошо зарекомендовала себя при изучении строения клеточного ядра амеб, а изготовление постоянных препаратов позволяет представить в коллекциях традиционный типовой материал, что делает описания видов полностью соответствующими ICZN. Для более детального изучения строения ядра клетки и природы внутриядерных структур мы применим конфокальную оптическую микроскопию и флюоресцирующие красители, избирательно окрашивающие ДНК-содержащие и РНК-содержащие структуры, что позволит нам не только составить современное представление о строении ядер, но и соотнести его к картиной, видимой на окрашенных гематоксилином препаратах. Это позволит нам лучше трактовать на современном уровне картины строения ядра, известные по постоянным препаратам старых авторов. Помимо этих исследований, особое внимание мы уделим морфометрическим данным, описанию флотирующих форм и тонким различиям между штаммами, которые могут помочь нам при различении криптических видов, выявленных молекулярными методами. Помимо светомикроскопических исследований, будут выполнены ультраструктурные исследования изолятов амеб для уточнения деталей строения клеточного покрова, ядра и органелл. Методики таких работ нами хорошо освоены и позволяют стабильно добиваться хороших результатов фиксации организмов (Kamyshatskaya et al. 2019)

3. Молекулярные исследования – изоляция ДНК и ПЦР методики
Методы изоляции геномной ДНК амеб нами разработаны и опробованы в ходе предшествующих исследований, все они уже показали хорошую результативность. Для видов, которые в состоянии расти в достаточно плотной культуре это – выращивание культуры с трехкратных контролем чистоты культуры, сбор амеб, трехкратная отмывка клеток от бактерий на центрифужных фильтрах Durapore Ultrafree CL с порой 5 мкм в центрифуге с охлаждением при +18 градусах. Микроскопический контроль чистоты препарата, ресуспендирование и доотмывка амеб (при необходимости). Для изолятов с которыми решено работать методом секвенирования тотальной ДНК – либо выделение ДНК с использование кита MACHEREY-NAGEL Nucleospin DNA isolation Kit и если концентрация ДНК выше 6 нг/мкл - хранение при +4 градусах, либо - mda амплификация ДНК с использованием REPLI-g Single Cell Kit (QIAGEN) и последующее хранение при -20 градусах до дальнейшей обработки. Для видов, которые невозможно нарастить в достаточно плотной культуре, или видов-полифагов, которые не в состоянии жить в чистой культуре и питаются другими эукариотами мы используем ручной сбор примерно 200 клеток амеб в чашку Петри со стерильной минеральной средой, три отмывки клеток в стерильной среде (фильтрация через фильтры Millipor 0,45 мкм), 24 часа каждая (ручной перенос клеток) и отбор 50 - 100 клеток в микропробирку с минимальным количеством среды. Далее- короткое центрифугирование (500 g) для осаждения клеток, максимально возможная уборка остатков среды, извлечение ДНК при помощи Arcturus PicoPure DNA isolation Kit и mda-амплификация с использованием REPLI-g Single Cell Kit - (QIAGEN).
Клетки амеб содержат большое количество эндоцитобионтов, пищевые вакуоли и иные включения, содержащие контаминирующую ДНК. Для уменьшения контаминации препаратов подобной ДНК мы планируем использовать метод изоляции одиночных ядер из клеток амеб с использованием микроманипуляторов и микроиньектора Eppendorf на базе инвертированного микроскопа Leica DMI3000. Полученные ядра будут обрабатываться так же как и с предыдущем варианте изоляции ДНК, описанном выше. Мы уже имеем положительный опыт применения подобной методики, которая радикально уменьшает уровень контаминации препаратов ДНК.
Амплификация гена 18S рРНК текамеб методом ПЦР по неизвестным до сих пор причинам обычно сопряжено с значительными сложностями, поэтому в случаях, когда методами обычной ПЦР амплифицировать этот ген не удается, мы используем препарат ДНК для полногеномного секвенирования методом NGS с использованием технических возможностей ресурсного центра "Развитие молекулярных и клеточных технологий" СПбГУ. После стандартной процедуры обработки и сборки результатов NGS - секвенирования (фильтрация, тримминг, очистка и сборка данных, большая часть этих операций будет выполнена специалистами ресурсного центра), мы используем имеющееся у нас выравнивание сиквенсов гена 18S рРНК видов текамебид в качестве запроса для поиска среди полученных контигов целевого гена 18S рРНК или его фрагментов. Секвенирование по Сэнгеру и возможности для NGS-секвенирования в объемах до 100 млн. прочтений будут предоставлены научным парком СПбГУ на его расходных материалах.
В ходе выполнения предшествующих проектов мы получили опыт работ с массивами NGS данных и создали весьма эффективные "пайплайны" для обработки данных - как на базе локальных компьютеров Apple, так и на базе кластеров РЦ "Вычислительный центр СПбГУ". Собрано, скомпилировано, закуплено при необходимости потребное программное обеспечение, созданы и отлажены виртуальные машины, специализированные для выполнения различных биоинформатических задач (в том числе с большими объемами оперативной памяти - до одного терабайта), написаны необходимые скрипты и программы. В предлагаемом проект данные будем обрабатывать следующим образом: - контроль качества полученных данных: FastQC - сборка полученных данных: Newbler, SPAdes assembler, Velvet assembler; доделка сборок - CodoneCode. Опыт работы показал, что качество сборки данных разными сборщиками сильно отличается и зависит от конкретной пробы, поэтому собираем несколькими программами и сравниваем результаты. - аннотирование интересующих нас сборок - MITOS, проверка выявленных генов - BLAST - добавочное выявление ORF-ов - Artemis 16.0 - ручное уточнение границ генов и ORFов с использованием BLAST, выравниваний генов и литературных данных - выравнивание генов - Codone Code, Mafft или Seaview (clustlao и muscule), обязательный ручной контроль выравниваний - филогенетический анализ - RaxMl, BrBayes, Phylobayes, iqTree - на базе локальных ресурсов для отдельных генов и на базе РЦ ВЦ СПбГУ для филогеномных данных. Для дальнейшего филогенетического анализа будут использованы установленные на кластере ВЦ СПбГУ ExeBayes, Phylobayes, IQTree и RaxML.

4. Изучение генетической структуры вида
Анализ генетического разнообразия в рамках морфологических видов и изучение генетической структуры вида будем проводить на основании данных о последовательности Фолмеровского фрагмента гена COX-I, который является быстро эволюционирующим геном и зарекомендовал себя как удобный ДНК- баркод для разделения близких видов и изучения структуры вида в других группах амеб (Nassonova et al. 2010; Zlatogursky et al. 2016 ). Эта работа будет выполнена в двух направлениях. Первое - это изучение границ внутригеномной изменчивости этого баркода в пределах одного организма (или одного свежего клона) текамеб. Для этого выделенная из одиночной клетки амебы ДНК будет амплифицирована с использованием Фолмеровских праймеров HCO-LCO и проведено молекулярное клонирование ампликона. Будут секвенированы 12-20 клонов в двух повторностях для того, чтобы установить уровень полиморфизма баркода и оценить уровень ошибок при ПЦР и секвенировании. В ходе этой работы будут использованы имеющиеся у нас высокоточные (high fidelity) ДНК-полимеразы для минимизации артефактов ПЦР. Литературные данные позволяют говорить о том, что этот уровень полиморфизма исчезающе мал, и ген COX-I является достаточно надежным ДНК-баркодом у амеб (Nassonova et al. 2010).
Второе направление исследований - это собственно изучение генетической структуры морфологических видов и идентификация скрытых видов (cryptic speciation). Материалом послужат клональные культуры одного достоверно идентифицированного морфологического вида, выделенные из нескольких удаленных друг от друга географических местообитаний. Предварительные данные нашего исследования основанные на анализе сиквенсов 14 штаммов, отнесенных к виду T. foliovenanda, показывают наличие небольших различий в последовательности гена COX-I у географически удаленных изолятов, что позволяет установить этот вид как модель для дальнейших исследований по разрешению вопроса «вида» у агамных организмов на примере текамебид. Полученные сиквенсы гена COX I будут сгруппированы в филотипы и паттерн их распространения и эволюции - прослежен с использованием программного обеспечения TCS. Мы также попытаемся провести Nested Clade Phylogeographic Analysis используя программное обеспечение ANeCA, если полученные массивы данных по отдельным видам окажутся достаточно большими. Помимо этого, мы проведем и обычный филогенетический анализ полученных данных. В результате проведенных анализов мы сможем оценить:
(1) Наличие скрытых видов в пределах изучаемого морфологического вида. Последние сформируют отдельные клады сиквенсов на филогенетическом древе, а при филогеографическом анализе будут выявлены как отдельные оторванные филогеографические сети. По нашему опыту, подобные отличия коррелируют с различиями в сиквенсе гена 18S рРНК. Будет также проведен тщательный морфологический анализ и анализ ультраструктурных данных для того, чтобы попытаться переоценить признаки и, в идеале, выявить тонкие различия между "скрытыми" видами. Эта работа также позволит нам приблизиться к пониманию генетических критериев различия между видами агамных организмов, выраженных в количественных значениях генетической дивергенции сиквенсов и (или) формирования молекулярных подписей в сиквенсах различающихся видов.
(2) Паттерн филогеографического распространения и эволюции вида. Анализ с использованием программного обеспечения TCS позволит нам установить предполагаемый предковый филотип и проследить паттерн географического распространения вида. Мы попытаемся выявить что-то типа "центров происхождения" разнообразия текамебид (наподобие того, как это сделано для культурных растений) и понять, какие особенности биологии этих видов явились определяющими для формирования подобного паттерна.
(3) Генетическую структуру вида в локальных популяциях. Для этого мы при отборе проб из природных местообитаний будем отбирать несколько десятков проб на расстоянии около одного метра друг от друга, выделать из них один и тот же морфологический вид текамеб и секвенирвоать ген COX как описано выше. Анализ паттерна рапространения филотипов позволит нам установить, являются ли все филотипы "эндемичными" для локального местообитания или же имеются более широко и менее широко распространенные филотипы, а также оценить общее потенциальное число филотипов в местообитании. Наша нулевая гипотеза в этом случает состоит в том, что количество филотипов в локальных местообитаниях ограничено, некоторые из них эндемичны, а некоторые - распространены всесветно, и популяции агамных видов протистов имеют клональную структуру.

Общий план работы:
2023
1.Получить последовательности гена Cox 1, сравнить последовательности и построить филогенетические деревья на основе данных полученных из имеющихся штаммов (январь-май 2023)
2.Для всех уникальных филогенетических ветвей по результатам филогенетического анализа но основе данных по гену Cox1 получить последовательности 18s rRNA (ноябрь-декабрь 2023)
3.Разработать праймеры для амплификации молекулярных меркеров HSP90 и ITS 1,2 (май-июнь 2023)
4.Экспедиции для сбора проб в Западной Сибири (ХМАО) и в районе Кереткого архипелага Белого моря (лето 2023). Короткие экспедиции по разным районам Ленинградской области (июнь-сентябрь 2023).
5.Высевы проб и установление клональных культур текамеб (сентябрь-декабрь 2023)
6.Изучить морфологическую изменчивость в пределах групп морфологических видов T.similis - T.foliovenanda и T.quadrilineata - T. cosmophorea по имеющимся штаммам (январь-апрель 2023)
7. Получение последовательностей молекулярных маркеров HSP90 и ITS 1,2 (октябрь-декабрь 2023)
8.Подготовка и публикация статей о новых случаях скрытого разнообразия (лето 2023)
9.Подготовка рабочего атласа имеющихся культур (февраль-май 2023)

2024
1.Получить и сравнить последовательности гена Cox1, построить филогенетические деревья на основе данных полученных из новых культур, выделенных в процессе выполнения проекта (ноябрь-февраль 2023-24)
2.Получение последовательностей молекулярных маркеров HSP90 и ITS 1,2 по новым штаммам (январь-апрель 2024)
3.Изучить морфологическую изменчивость в пределах групп морфологических видов T.similis - T.foliovenanda и T.quadrilineata - T. cosmophorea по новым штаммам (февраль-май 2024)
4.Для всех уникальных филогенетических ветвей по результатам филогенетического анализа но основе обновленных данных по гену Cox1 получить последовательности 18s rRNA (май-август 2024)
5.Дополнительные короткие экспедиции по разным районам Ленинградской области (май-июль 2024)
6.Анализ и получение данных о географическом распространении и структуре популляций морфологических видов текамеб (февраль-май 2024)
7.Дополнительные высевы проб и установление клональных культур текамеб (июнь-июль 2024)
8.Подготовка рабочего атласа новых культур (февраль-май 2024)
9.Подготовка обобщающих статей по филогеографии и структуре популяций морфологических видов текамеб (август-октябрь 2024)
10.Подготовка финального отчёта по гранту (декабрь 2024)

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту:
Mesentsev, Y., Smirnov, A., 2022. Stenamoeba aeronauta n. sp., a new case of sibling species in the order Thecamoebida (Amoebozoa, Discosea). Eur. J. Protistol. 86, 125941. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2022.125941
Mesentsev, Y., Kamyshatskaya, O., Nassonova, E., Smirnov, A., 2022. Thecamoeba vumurta n. sp. (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) from freshwater pond sediment – a sibling species of T. striata (Penard, 1890) Schaeffer, 1926. Eur. J. Protistol. 83, 125866. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2022.125866
Mesentsev, Y., Smirnov, A., 2021. Thecamoeba astrologa n. sp. – A new species of the genus Thecamoeba (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) with an unusually polymorphic nuclear structure. Eur. J. Protistol. 81, 125837. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2021.125837
Mesentsev, Y., Kamyshatskaya, O., Smirnov, A., 2020. Thecamoeba foliovenanda n. sp. (Amoebozoa, Discosea, Thecamoebida) – One more case of sibling species among amoebae of the genus Thecamoeba. Eur. J. Protistol. 76, 125716. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125716
Mesentsev, Y., Bondarenko, N., Kamyshatskaya, O., Nassonova, E., Glotova, A., Loiko, S., Istigechev, G., Kulemzina, A., Abakumov, E., Rayko, M., Lapidus, A., Smirnov, A., 2022. Thecochaos is not a myth: study of the genus Thecochaos (Amoebozoa, Discosea) – a rediscovered group of lobose amoeba, with short SSU gene. Org. Divers. Evol. https://doi.org/10.1007/s13127-022-00581-9
Mesentsev, Y., Bondarenko, N., Nassonova, E., Smirnov, A., 2021. Vannella primoblina n. sp. – an unusual species of the genus Vannella (Amoebozoa, Discosea, Vannellida) with pronounced dorsal ridges and folds. Eur. J. Protistol. 77, 125757. https://doi.org/10.1016/j.ejop.2020.125757
Smirnov, A. V., Kulishkin, N.S., Surkova, A.A., Mesentsev, Y.S., Bondarenko, N.I., Nassonova, E.S., Mazei, Y.A., 2020. Molecular phylogeny of Paradermamoeba valamo (Amoebozoa, Discosea, Dermamoebida). Protistology 14, 219–226. https://doi.org/10.21685/1680-0826-2020-14-4-1
Surkova, A.A., Kulishkin, N.S., Andrey, N., Mesentsev, Y.S., Okasana, G., Smirnov, A. V, Yang, J., Mazei, Y.A., 2022. Diversity and abundance of naked lobose amoebae belonging to the classes Tubulinea and Discosea in pond sediments in Moscow urban parks 16, 122–134. https://doi.org/10.21685/1680-0826-2022-16-2-6