Научная проблема, на решение которой направлен проект.

Одним из наиболее актуальных направлений фундаментальных исследований в области биологии является создание научной базы для освоения ценных биологических ресурсов. Такой ресурс представляют собой разнообразные биологически активные соединения, синтезируемые морскими организмами. Данные последних десятилетий свидетельствуют о том, что специфические фенольные метаболиты бурых водорослей – флоротаннины, имеют значительный прикладной потенциал, особенно в сферах аквакультуры и медицины, поскольку эти вещества обладают ярко выраженными антибиотическими эффектами в отношении широкого спектра про- и эукариотических одноклеточных организмов (Catarino et al., 2017). Известно, что флоротаннины отличаются значительным разнообразием молекулярной структуры, и состав этих соединений в клетках бурых водорослей видоспецифичен (Steevensz et al., 2012; Martinez, Castaneda, 2013; Birkemeyer et al., 2020). При этом различные физиологические эффекты (антимикробная, противогрибковая, противовирусная, альгицидная активность и др.) приурочены к конкретным препаратам флоротаннинов, источником которых являются определенные виды водорослей. В настоящее время в изучении структурного разнообразия и биологической активности флоротаннинов существует два серьезных пробела – исследования ограничены узким списком объектов – источников данных соединений (несколько видов из порядков Fucales и Laminariales) и имеют преимущественно феноменологический характер, не ставя целью изучение механизмов действия флоротаннинов на клетки про- и эукариотических организмов. На решение этих проблем направлен данный проект, в рамках которого планируется: 1) проведение широкомасштабного скрининга природных источников флоротаннинов (20 видов, представляющих 5 порядков бурых водорослей Арктического региона России) с целью выявления наиболее эффективных препаратов; 2) создание фундаментальной базы для исследования механизмов действия эффективных препаратов флоротаннинов на клеточном уровне.

Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы.

Значительное количество ценных биологически активных соединений, включая эффективные лекарственные препараты, получено из экстрактов растительных организмов (напр., Khazir et al., 2014; Agarwal et al., 2019). В настоящее время, высшие растения, как источники биологически активных соединений, исследованы значительно лучше, чем водоросли, особенно – морские макрофиты. В 21 веке интерес к биологически активным метаболитам морских водорослей существенно вырос, и многие соединения, включая флоротаннины бурых водорослей, рассматриваются как перспективные с точки зрения их применения как в медицине, так и в аквакультуре (Fitton, 2011; Catarino et al. 2017). В настоящее время, работы, посвященные биологической активности флоротаннинов, достаточно многочисленны (напр., Dutot et al., 2012; Quéguineur et al., 2013; Bahar et al., 2016). Однако они не приводят к существенному прогрессу в данной области знания, поскольку являются преимущественно описательными, не подкреплены знаниями физиологии и биохимии конкретных объектов – продуцентов флоротаннинов и имеют географические ограничения. Фактически, большинство работ по исследованию прикладного значения флоротаннинов выполняется на двух-трех дальневосточных (реже – атлантических) видах водорослей, а богатейший биологический ресурс Арктического региона оставлен без внимания. Для того чтобы перейти на качественно новый уровень в исследовании данного вопроса, необходим более систематический подход – нужно включить в анализ представителей разных таксономических групп бурых водорослей, поскольку известно, что они синтезируют разные типы флоротаннинов (Martinez, Castaneda, 2013), детально исследовать структуру молекул, входящих в состав экстрактов флоротаннинов различного происхождения, и выявить молекулярный механизм воздействия данных соединений на клетки про- и эукариотических организмов.
Актуальность данной работы заключается в создании фундаментальной базы для освоения ценного биологического ресурса, который имеет широкий спектр потенциального прикладного применения (медицина, аквакультура, пищевая промышленность, косметология). Мы ожидаем, что результаты нашего исследования дадут значительный объем новых данных, которые существенно расширят современные представления о механизмах биологической активности флоротаннинов. Реализация данного проекта не только внесет существенный вклад в фундаментальную биологию, но также будет способствовать развитию соответствующих отраслей прикладных наук.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность.

Целью данного проекта является структурный анализ субклеточных фракций флоротаннинов, выделенных из 20 видов бурых водорослей, и детальная характеристика их биологических эффектов на модельных тест-системах с использованием клеток бактерий, грибов, микроводорослей и расселительных стадий морских макрофитов.
Конкретные задачи проекта:
1)Выделить внутриклеточные и ассоциированные с клеточными стенками флоротаннины из 20 видов бурых водорослей, обитающих в Российской Арктике и относящихся к порядкам Fucales, Laminariales, Ectocarpales, Desmarestiales и Sphacelariales.
2)Охарактеризовать полученные препараты флоротаннинов по их специфическому молекулярному профилю. Этот этап предоставит структурную информацию, которую далее можно будет интерпретировать с точки зрения наблюдаемых биологических активностей.
3)Провести общий анализ метаболома 20 видов бурых водорослей для получения информации о биохимическом окружении конкретных типов флоротаннинов. Эти данные будут использованы для интерпретации результатов исследования биологической активности флоротаннинов в контексте особенностей биохимического состава и метаболического статуса разных видов водорослей-продуцентов.
4)Провести скрининг препаратов флоротаннинов для оценки антибиотической активности в клетках модельных одноклеточных организмов: бактерий, грибов, микроводорослей и расселительных стадий развития макрофитных водорослей.
5)Оценить генотоксическую/генопротекторную активности препаратов флоротаннинов в тесте Эймса для Salmonella typhimurium и при селекции прямых и обратных мутаций у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
6)Охарактеризовать изменения метаболома клеток модельных объектов, обработанных препаратами флоротаннинов. В рамках этой задачи будут анализироваться гидрофильные и семиполярные первичные и, частично, вторичные метаболиты. Полученные данные позволят сделать первичные выводы о механизмах биологической активности флоротаннинов на клеточном уровне.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.

Анализ современного состояния научных исследований показывает, что для перехода на качественно новый уровень знания в области биологической активности флоротаннинов необходимо проведение систематического изучения воздействия флоротаннинов различной молекулярной структуры на широкий спектр про- и эукариотических объектов. Научная новизна данного проекта заключается в том, что впервые параллельно будут исследоваться как молекулярная структура и биохимическое окружение самих флоротаннинов в клетках разнообразных водорослей-продуцентов, так и метаболические изменения, происходящие под влиянием флоротаннинов в клетках модельных про- и эукариотических организмов. Оценка биологической активности всех препаратов флоротаннинов будет проводиться одновременно по целой серии параметров: будут рассмотрены антибактериальная, противогрибковая и альгицидная активность, а также генотоксичность. Будут использованы модельные объекты, удовлетворяющие двум требованиям: 1) хорошо исследованные с точки зрения физиологии, токсикологии, генетики и молекулярной биологии (это позволит в дальнейшем использовать полученный массив данных для выявления механизма действия флоротаннинов на молекулярном уровне) и 2) имеющие аналоги в естественном окружении водорослей-продуцентов флоротаннинов (это даст возможность адекватно экстраполировать полученные данные на реальные водные экосистемы и в перспективе использовать их как фундаментальную основу для практического применения в области аквакультуры).
Для реализации проекта будет применен интегральный подход, сочетающий современные методы физиологии растений, биохимии, генетики, микробиологии и аналитической химии. Впервые будут отдельно рассматриваться различные субклеточные фракции флоротаннинов. Особое внимание будет уделено фракции флоротаннинов клеточных стенок – данная группа соединений в настоящее время практически не изучена. Новизна проекта определяется также широтой охвата природных источников флоротаннинов – будет проведен скрининг 20 видов, представляющих 5 порядков бурых водорослей, растущих в Арктическом регионе России. В настоящее время большинство работ в данном направлении проводится на атлантических и дальневосточных видах водорослей, таким образом, впервые внимание будет сосредоточено на биологическом ресурсе Арктики.
Данная тематика не является совершенно незнакомой для нашей научной группы: у коллектива уже имеется опыт работы и задел в области количественного определения и структурной характеристики флоротаннинов бурых водорослей (Lemesheva et al. 2020; Birkemeyer et al., 2020). Однако исследование биологической активности этих соединений является для нас новым направлением работы, которое мы планируем развить в ходе выполнения данного проекта. Мы убеждены, что наш коллектив располагает всей необходимой профессиональной базой для успешной реализации проекта по данному новому направлению. У членов коллектива есть опыт работы в области альгологии (сбор и определение бурых водорослей), физиологии и биохимии водорослей (в т.ч., метаболомики), культивирования про- и эукариотических одноклеточных организмов и токсикологии. Все это является залогом достижимости поставленных в проекте задач.

Современное состояние исследований по данной проблеме.

Флоротаннины являются специфическими вторичными метаболитами бурых водорослей. Это фенольные соединения, которые рассматривают как структурные аналоги конденсированных таннинов высших растений. Флоротаннины обнаруживаются у представителей всех порядков Phaeophyceae, и, как правило, накапливаются в клетках водорослей в значительных количествах (Ragan, Glombitza, 1986). Препараты флоротаннинов, выделенные из талломов бурых водорослей, представляют собой сложную смесь водорастворимых олигомеров и полимеров флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола). Продукты полимеризации флороглюцина имеют различную структуру, а их молекулярная масса варьирует в пределах от 126 Да (мономер) до 650 кДа (Ragan, Glombitza, 1986; Heffernan et al., 2015). В зависимости от вида химической связи между мономерами, выделяют четыре класса флоротаннинов. Первый класс включает фугалолы и флоретолы, для которых характерны эфирные связи (арил-О-арил). Второй класс включает фуколы с фенильными связями (арил-арил). Молекулы флоротаннинов третьего класса - фукофлоретолы содержат и эфирные и фенильные связи, и могут быть разветвленными. В четвертый класс объединяют молекулы с дибензодиоксиновыми связями – эколы и кармалолы (Singh, Sidana, 2013; Birkemeyer et al., 2020). Молекулы флоротаннинов, имеющие высокую степень полимеризации, формируют множество изомеров и характеризуются большим разнообразием структур (Heffernan et al., 2015). Существуют данные, что экстракты бурых водорослей существенно различаются по соотношению представленных в них фракций флоротаннинов с различной молекулярной массой (<1, 1–10, 10–100, и >100 кДа), в зависимости от видовой принадлежности, ареала или зоны таллома водоросли (Iken et al., 2007; Birkemeyer et al., 2020). Низкомолекулярные флоротаннины могут быть галогенированы или сульфатированы (Barre et al., 2010).
Содержание флоротаннинов в талломах бурых водорослей варьирует от 0.5 до 25% сухой массы (Targett et al., 1995; Iken et al., 2007; Kamiya et al., 2010). Этот показатель видоспецифичен и зависит также от солености воды, доступности питательных веществ, специфики местообитания водоросли, размера и стадии развития растения, сезона, интенсивности повреждения фитофагами и других факторов (Ragan, Jensen, 1978; Steinberg, 1995; Pavia, Brock, 2000; Jormalainen et al., 2008). В клетках водорослей содержится две фракции флоротаннинов: внутриклеточные растворимые флоротаннины и флоротаннины, ассоциированные с клеточными стенками. Растворимые полифенолы сосредоточены в специализированных мембранных органеллах (физодах), которые предположительно формируются в эндоплазматическом ретикулуме и комплексе Гольджи. Предшественники флоротаннинов могут быть синтезированы в эндоплазматическом ретикулуме и затем транспортированы в комплекс Гольджи для дальнейших модификаций (Schoenwaelder, Clayton, 2000). Использование гистохимических методов позволило выделить в клетках фукусовых водорослей физоды двух типов. Органеллы первого типа, как правило, сосредоточены вокруг ядра, в то время как другие перемещаются в периферическую область цитоплазмы и секретируют своё содержимое в апопласт, где флоротаннины формируют комплексы с альгинатами. По-видимому, полимеризация флоротаннинов в матриксе клеточных стенок и образование поперечных сшивок между фенольными остатками и молекулами альгиновой кислоты происходят за счет оксидазных реакций, катализируемых ванадий-зависимыми галопероксидазами (Berglin et al., 2004; Potin & Leblanc, 2006; Tarakhovskaya, 2014; Lemesheva et al., 2020). Согласно опубликованным данным (Koivikko et al., 2005; Birkemeyer et al., 2020), в клеточных стенках содержится на порядок меньше флоротаннинов, чем в физодах. На сегодняшний день ассоциированная с клеточной стенкой фракция флоротаннинов очень мало исследована.
Флоротаннины у бурых водорослей выполняют широкий спектр физиологических функций: они являются интегральными компонентами клеточной стенки, хелатируют ионы металлов и защищают водоросли от биообрастания и поедания фитофагами (Lemesheva, Tarakhovskaya, 2018). Также флоротаннины задействованы в системе нейтрализации оксидативного и цитотоксического эффектов ультрафиолетового излучения (Creis et al., 2015).
Анализ препаратов флоротаннинов, выделенных из бурых водорослей, является сложной задачей, поскольку они представляют собой многокомпонентную смесь молекул со сходной структурой, для которых отсутствуют коммерчески доступные стандарты (Martinez, Castaneda, 2013). Поэтому детальный структурный анализ флоротаннинов обычно требует совместного использования высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией и ядерного магнитного резонанса (Steevensz et al., 2012; Ferreres et al., 2012). Немногочисленные пока подобные исследования дают основания полагать, что представители разных таксономических групп водорослей преимущественно синтезируют флоротаннины определенных классов. В частности, в талломах Фукусовых доминируют фуколы (по этой причине получившие свое название), в талломах ряда Ламинариевых (напр., р. Ecklonia) – эколы. Однако в настоящее время на молекулярном уровне исследованы лишь флоротаннины нескольких родов бурых водорослей (р. Fucus, Sargassum, Ecklonia, Eisenia, Carpophyllum), представляющих порядки Fucales и Laminariales (Glombitza, Gerstberger, 1985; Glombitza, Schmidt, 1999; Steevensz et al., 2012; Martinez, Castaneda, 2013; Li et al., 2017; Birkemeyer et al., 2020). Данные по представителям других таксономических групп бурых водорослей пока очень фрагментарны и не позволяют прийти к однозначным и достаточно обоснованным выводам о распространении среди них флоротаннинов различных классов. Анализ данных по фукусовым водорослям показывает, что даже в пределах одного рода возможны существенные различия по молекулярной массе доминирующих флоротаннинов. Например, в клетках Fucus vesiculosus резко преобладают молекулы со степенью полимеризации от 4 до 9 (Mr = 498–1118), в то время как в клетках F. spiralis и F. serratus наблюдается значительно более равномерное распределение флоротаннинов с разными молекулярными массами (Steevensz et al., 2012; Birkemeyer et al., 2020).
В течение последних десятилетий флоротаннины вызывают серьезный интерес исследователей всего мира в связи с их биологической активностью (антимикробной, противогрибковой, альгицидной, цитотоксической, противовоспалительной, антиоксидантной и антипролиферативной), которая потенциально позволяет использовать их в аквакультуре, медицине и в производстве пищевых продуктов и косметических средств (Singh, Sidana, 2013; Catarino et al., 2017). Подобно другим фенолам растительного происхождения, флоротаннины обладают антиоксидантными свойствами (Hagerman et al., 1998; Ferreres et al., 2012). Было показано, что антиоксидантная активность экстрактов бурых водорослей по отношению к 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилу (ДФПГ) и пероксильным радикалам строго коррелирует с содержанием полифенолов в клетках, что указывает на важную роль флоротаннинов, как природных антиоксидантов (Wang et al., 2012; Liu et al., 2017). Некоторые флоротаннины, изолированные из бурых водорослей порядков Laminariales и особенно Fucales, проявляют более сильные антиоксидантные свойства, чем стандартные коммерчески доступные антиоксиданты, такие как бутилгидрокситолуол (БГТ) или пропилгаллат (Kim et al., 2009; Liu et al., 2017). Например, в тесте с использованием ДФПГ значения 50% ингибирующей концентрации (ИК50) для флоротаннинов, экстрагированных из фукоидов Ascophyllum nodosum и F. vesiculosus, составили 7.2 и 3.8 мкг/мл, соответственно, - эти значения сравнимы с аналогичным показателем для аскорбиновой кислоты и превышают активность БГТ (Liu et al., 2017). Было также показано, что экстракты, обогащенные флоротаннинами, снижали интенсивность формирования пероксида водорода и реакций перекисного окисления липидов с эффективностью, сравнимой с эффективностью пропилгаллата (Wang et al., 2010). В клетках печени человека, обработанных трет-бутилгидропероксидом для индукции в них окислительного стресса, наблюдали снижение количества активных форм кислорода (АФК) и малонового диальдегида после пред-инкубации клеток с флоротаннинами в физиологических концентрациях (0.5–50 мкг/мл). При этом флоротаннины, использованные в этом исследовании, не оказали цитотоксического эффекта (Quéguineur et al., 2013). Флоротаннины, экстрагированные из Ecklonia cava (Laminariales) нейтрализовали внутриклеточные АФК, предотвращая перекисное окисление липидов, и снижали летальность для клеток 2,2’-азобис-2-метилпропанимидамид дигидрохлорида и частоту морфологических нарушений у эмбрионов рыб Danio rerio (Kang et al., 2013). Эти данные указывают на то, что флоротаннины можно рассматривать в качестве потенциальных терапевтических средств для лечения и предотвращения заболеваний, связанных с окислительным стрессом.
Во многих исследованиях была показана антимикробная, противовирусная и противогрибковая активность флоротаннинов (Singh, Sidana, 2013; Catarino et al., 2017). Эти вещества имеют бактерицидный эффект по отношению к грамотрицательным (Pseudomonas aeruginosa) и грамположительным (Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus) бактериям с минимальной ингибирующей концентрацией (МИК) 30-60 мкг/мл для флоротаннинов экстрагированных из представителей порядка Laminariales (Ecklonia stolonifera) и 2-15 мг/мл - для флоротаннинов видов порядка Fucales (Fucus spiralis) (Lee et al., 2008; Lopes et al., 2012). Бактерицидная активность флоротаннинов из E. kurome возрастает с увеличением степени полимеризации молекул (Nagayama et al., 2002). По-видимому, в основе бактерицидного эффекта лежит взаимодействие флоротаннинов с белками микроорганизмов, однако этот вопрос в настоящее время недостаточно исследован (Stern et al., 1996; Singh, Sidana, 2013). Некоторые фракции флоротаннинов, содержащие эколы (Рис. 1), демонстрировали противовирусный эффект, в частности - ингибиторную активность по отношению к обратной транскриптазе вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Значение ИК50 для самого эффективного препарата составило 0.51 мкМ, что сопоставимо с действием невирапина – синтетического противовирусного препарата, используемого для лечения ВИЧ-1 инфекции и рассматриваемого в настоящее время, также, как потенциально эффективный препарат для лечения коронавирусной инфекции (Ahn et al., 2004; Frediansyah et al. 2020). Фунгицидные свойства препаратов флоротаннинов были протестированы на различных видах патогенных грибов (Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton rubrum), МИК в данном случае варьировала в пределах 3.9–31.3 мг/мл (Lopes et al., 2012). В целом можно сделать вывод, что на сегодняшний день антибиотические свойства флоротаннинов убедительно доказаны – следующим этапом работы должно быть выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе этих эффектов.
Помимо относительно хорошо изученных антиоксидантной и антимикробной активностей, флоротаннины также продемонстрировали противовоспалительное действие (Dutot et al., 2012; Kellogg et al., 2015; Bahar et al., 2016), цитотоксический и антипролиферативный эффекты (Barreto et al., 2012; Geisen et al., 2015; Zenthoefer et al., 2017). Препараты флоротаннинов являются эффективными ингибиторами α-амилазы и α-глюкозидазы (Paradis et al., 2011; Liu et al., 2016). Эти ферменты часто используют в качестве мишени при терапии специфической формы диабета 2 типа, поскольку именно они отвечают за образование мономеров глюкозы, которые затем всасываются в тонком кишечнике человека. Флороглюцин и низкомолекулярные флоротаннины снижали интенсивность формирования конечных продуктов глубокого гликирования белков, ответственных за такие осложнения диабета, как ретинопатия, невропатия и кардиомиопатия (Liu, Gu, 2012).
В целом, проведенный обзор литературы позволяет прийти к выводу, что хотя биологическая активность флоротаннинов в течение последних десятилетий активно изучается, в этой области до сих пор остается несколько совершенно не разработанных направлений: 1) большинство исследований было проведено с использованием экстрактов, полученных из водорослей порядка Fucales (роды Fucus, Ascophyllum) или Laminariales (роды Ecklonia, Eisenia), в то время как остальные бурые водоросли (имеющие иные, подчас совершенно неизвестные, молекулярные профили флоротаннинов) исследованы в гораздо меньшей степени или вообще не рассматривались; 2) нам удалось найти всего две работы (Budhiyanti et al., 2011; Liu et al., 2017), в которых рассматривалась фракция флоротаннинов клеточной стенки, которая обычно полностью выпадает из исследований биологической активности этих соединений; 3) практически не исследованы механизмы действия флоротаннинов на биологические объекты – большинство работ в этой области является феноменологическими, и это, во многом, связано с прикладным характером данных исследований и соответствующим выбором объектов. В этих работах в качестве объектов используются, в первую очередь, организмы, обладающие ярко выраженным патогенным эффектом в отношении человека. Однако для обеспечения возможности детального исследования молекулярных механизмов действия флоротаннинов представляется более рациональным использовать объекты, хорошо исследованные не только с точки зрения физиологии и токсикологии, но также являющиеся модельными для молекулярной биологии и генетики, такие как Escherichia coli, Chlamydomonas reinhardtii, Saccharomyces cerevisiae и др. Результаты, полученные на этих объектах можно будет адекватно экстраполировать не только на одноклеточных патогенов человека, но также на планктон и организмы, формирующие поверхностные биопленки в водных экосистемах, и в перспективе использовать их как фундаментальную основу для практического применения в области аквакультуры и борьбы с биообрастанием. В предлагаемом нами проекте мы планируем использовать именно такой подход и, заполнив выявленные нами пробелы в изучении структуры и биологической активности флоротаннинов, сформировать фундаментальную базу для дальнейших детальных исследований молекулярных механизмов действия этих соединений.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.

1. Выделение и структурная характеристика флоротаннинов
1.1 Сбор растительного материала
Сбор бурых водорослей будет производиться в прибрежной акватории Белого и Баренцева морей (на литоральной и сублиторальной зонах) в период вегетационного сезона (июнь-сентябрь). На литорали водоросли будут собираться вручную, в сублиторали – при помощи драгирования и кошкования. Все отобранные экземпляры растений будут определены до вида и заморожены. Всего будет собрано 20 видов бурых водорослей: Fucus vesiculosus, F. serratus, F. edentatus, F. distichus, Ascophyllum nodosum, Pelvetia canaliculata (порядок Fucales); Saccharina latissima, Laminaria digitata, L. hyperborea, Chorda filum (порядок Laminariales); Punctaria plantaginea, Stictyosiphon subarticulatus, Pylaiella littoralis, Chordaria flagelliformis, Dictyosiphon hippuroides, D. chordaria, Ectocarpus siliculosus, Elachista fucicola (порядок Ectocarpales); Desmarestia aculeata (порядок Desmarestiales) и Sphacellaria plumosa (порядок Sphacelariales). Данная группа видов бурых водорослей представляет типичную альгофлору данного региона Российской Арктики (Зинова, 1953; Garbary, Tarakhovskaya, 2013).

1.2. Получение экстрактов флоротаннинов
Экстрагирование растворимых и связанных с клеточной стенкой (КС) флоротаннинов будет выполнено по Birkemeyer с соавт. (Birkemeyer et al., 2020). Замороженный растительный материал гомогенизируется и заливается 70%-ным ацетоном (v/v). Через 1 ч пробы центрифугируют (5000 g, 10 мин), супернатант переносят в новую пробирку, а к осадку добавляют следующую порцию 70%-ного ацетона. Процедуру повторяют 5 раз, супернатанты объединяют и упаривают до водного остатка. Нерастворимая КС-фракция флоротаннинов выделяется из осадка, оставшегося после экстрагирования растворимой фракции. Осадок ресуспендируют в 1 н NaOH, предварительно нагретом до 80°C, и затем инкубируют 2.5 ч при комнатной температуре и перемешивании. Затем пробы центрифугируют (5000 g, 10 мин), супернатант переносят в новую пробирку, а к осадку добавляют следующую порцию 1 н NaOH. Процедуру повторяют 3 раза, супернатанты объединяют и подкисляют до pH 3.0 с помощью концентрированной HCl. Далее экстракты растворимых и КС-связанных флоротаннинов очищают от неполярных соединений тремя порциями дихлорометана (1:1, v/v), и полифенолы экстрагируют пятью порциями этилацетата (1:1, v/v). Содержащая флоротаннины этилацетатная фаза выпаривается, и сухой остаток ресуспендируется в воде для последующего хроматографического анализа и/или физиологических тестов.
Общее содержание фенольных соединений в пробах будет определено спектрофотометрически методом Фолина-Чокалтеу с модификациями (Cicco et al., 2009). Реакционную смесь, состоящую из 0.3 мл анализируемой пробы, 2.4 мл 5%-ного (w/v) Na2CO3 и 0.3 мл реактива Фолина-Чокалтеу, инкубируют при 45°C в течение 20 мин, после чего измеряют экстинкцию растворов при 750 нм. В качестве стандарта для приготовления калибровочных растворов будет использован флороглюцин (Sigma).

1.3. Хромато-масс-спектрометрический анализ флоротаннинов
Схема проведения анализа будет основана на данных, полученных в ходе предшествующих работ научной группы (Birkemeyer et al., 2020). Флоротаннин-содержащие экстракты водорослей (см. Раздел 1.2) будут разделены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке Gemini C18 (150 × 2 мм, Phenomenex, Aschaffenburg, Germany) на Agilent 1100 HPLC-Uv (Agilent, Waldbronn, Germany) в линейном градиенте ацетонитрила в 0.1% (v/v) водном растворе муравьиной кислоты. Масс-спектрометрический анализ будет осуществляться в режиме онлайн с помощью квадруполь-времяпролетного масс-спектрометра (QqTOF-MS, Bruker Impact II, Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Первичная обработка хроматограмм (выравнивание пиков) и статистический анализ будут проведены при помощи пакета компьютерных программ CAMERA в системе R, для интегрирования площадей пиков будет использована программа LC-Quan. В результате будет получена единая матрица данных о структуре флоротаннинов, содержащихся во всех исследуемых экстрактах бурых водорослей. Молекулярная структура доминирующих флоротаннинов из экстрактов, показавших максимальную биологическую активность, будет уточнена с помощью тандемной масс-спектрометрии с ионной ловушкой (ESI-IT-MSn, Bruker Esquire 3000+, Bruker Daltonics).

1.4. Анализ метаболома бурых водорослей
Метаболитный профиль водорослей будет исследован с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии с использованием двухсекторного анализатора с ионизацией электронным ударом. Водно-метанольные экстракты водорослей будут высушены и затем последовательно дериватизированы О-метилгидроксиламин гидрохлоридом (МОА) и N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидом (MSTFA) по методу, модифицированному для анализа метаболитов бурых водорослей (Tarakhovskaya et al., 2017; Birkemeyer et al., 2019). Анализ сахаров, аминов, аминокислот, органических кислот и прочих низкомолекулярных полярных метаболитов (в частности, флороглюцина и димеров флоротаннинов) будет проводиться с использованием 5% -фенил-95% -диметилсилоксановой колонки (DB-5 MS UI, J & W Fisher, Германия) на газовом хроматографе Agilent 6890 (скорость потока 1 мл/мин, инжекция без разделения пробы, температура инжектора 250°C). Данный прибор оснащен автоматическим пробоотборником (автосэмплером) 7683 (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) и совмещен в режиме онлайн с квадрупольным масс-спектрометром (EI-Q-MS, MSD 5973, Agilent Technologies, Böblingen, Germany) с электронной ионизацией (70 eV). Обработка хроматограмм (выделение и выравнивание пиков) будет выполнено с помощью компьютерной программы Automated Mass Spectral Deconvolution & Identification System (AMDIS), идентификация аналитов будет проведена на основе индексов удерживания (RI) по доступным библиотекам масс-спектров (NIST14 и внутренние библиотеки). Количественные расчеты будут производиться на основе интегральных площадей хроматографических пиков, реконструированных для характеристических значений m/z (XIC, ± 0.5 Da) и времени удерживания (RT) с использованием компьютерной программы MassHunter. Для абсолютного количественного анализа будет использован метод добавок стандартов (пять уровней калибровки).

2. Исследование биологической активности флоротаннинов
2.1. Антибактериальная, противогрибковая и альгицидная активность
Исследования будут выполнены с использованием набора объектов, являющихся модельными для токсикологических и молекулярно-биологических исследований: грамотрицательные бактерии Escherichia coli ML35p и K12, дрожжи Saccharomyces cerevisiae штамм BY4742, зеленые микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii штамм CC-124 и Chlorella vulgaris штамм BIN, эвгленовая водоросль Euglena gracilis штамм Z.
Среды, которые будут использованы для культивирования объектов: среда Vogel-Bonner (VB) для E. coli, синтетическая полная среда (SC) для S. cerevisiae, Tris-Acetate-Phosphate (TAP) для Ch. reinhardtii, среда Cramer-Myers для E. gracilis, среда Watanabe для Ch. vulgaris.
Для определения антибиотической активности и расчета значений минимальной ингибирующей концентрации (МИК) препаратов флоротаннинов будут использованы следующие методы:
(1)Метод радиальной диффузии в агарозном геле (Lehrer et al., 1991). К суспензии микроорганизмов, содержащей 4×106 клеток, будет добавлена стерильная 1% (w/v) агароза, после чего смесь будет перенесена в чашку Петри и оставлена до застывания. После затвердевания среды, в ней будут сделаны лунки диаметром 3 мм. Аликвоты по 5 мкл тестируемых экстрактов/фракций будут внесены в лунки и оставлены на 3 ч при 37°C для диффузии. Далее на поверхность геля будет наслоен 1% (w/v) раствор агарозы в питательной среде, и инкубация будет повторена в течение 18 часов при 37°C. Антибиотическая активность будет выражена в условных единицах – одна у.е. соответствует 0.1 мм диаметра зоны подавления роста (зоны вокруг лунки, не содержащей колоний микроорганизмов) за вычетом диаметра лунки (30 у.е.). Значения МИК будут вычислены по уравнению линейной регрессии для зависимости антибактериальной активности от концентрации флоротаннинов.
(2)Метод подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ). Аликвоты суспензионных культур микроорганизмов (5 мкл), содержащие 2×106 КОЕ/мл будут инкубироваться в течение определенного времени (1–12 ч) при оптимальной для роста температуре в присутствии флоротаннинов (серия последовательных разведений). Затем суспензия будет разбавлена в соотношении 1:50, и аликвоты по 50 мкл будут равномерно распределены по поверхности 0.5–1% (w/v) агарозного геля с питательной средой в чашках Петри. После 16–96 ч (в зависимости от объекта) инкубации при оптимальной для роста температуре, будет произведен подсчет колоний, исходя из того, что каждая выжившая колония соответствует 1000 КОЕ/мл исходной культуры микроорганизмов.
(3)Метод прямого подсчета количества клеток (будет использован, преимущественно, для микроводорослей). Аликвоты суспензионных культур микроорганизмов (180 мкл), содержащие 105 клеток/мл, будут высеяны в лунки 96-луночного планшета и будут выращиваться при оптимальной температуре в присутствии флоротаннинов (серия последовательных разведений) в течение 24–96 ч (в зависимости от объекта). После этого будет оценена подвижность клеток (для E. gracilis и Ch. reinhardtii) и будет произведен подсчет количества клеток в лунках при помощи камеры Горяева.

2.2. Токсичность по отношению к расселительным стадиям развития макрофитных водорослей
Будут собраны талломы фукусовых водорослей (Fucus vesiculosus, F. distichus, A. nodosum) со зрелыми рецептакулами и талломы ламинариевой водоросли Saccharina latissima со спороносными пятнами. В лабораторных условиях из рецептакулов фукоидов будут получены суспензии яйцеклеток и антерозоидов (для двудомных видов) или зигот (для F. distichus); из спороносных пятен S. latissima будет получена суспензия зооспор. Получение гамет, зигот и зооспор будет осуществляться по стандартным методикам, поставленным в лаборатории научного коллектива (Tarakhovskaya et al. 2017; Lemesheva et al. 2020). Аликвоты суспензий расселительных стадий развития водорослей будут инкубироваться в течение определенного времени (0.5–24 ч) при оптимальной температуре в присутствии флоротаннинов (серия последовательных разведений), после чего будет произведена отмывка от флоротаннинов, и объекты будут помещены в стерилизованную морскую воду. Токсичность препаратов флоротаннинов будет оцениваться по изменениям подвижности антерозоидов и зооспор, эффективности оплодотворения яйцеклеток, скорости развития зигот и наличию и частоте встречаемости аномалий развития (отсутствие поляризации, неспособность прикрепиться к субстрату, недоразвитие клеточной стенки и др.).

2.3. Генотоксичность
Генотоксические свойства флоротаннинов будут исследованы в тесте Эймса в соответствии со стандартным протоколом (Maron, Ames, 1983). Будут использованы свежие ночные культуры бактерий Salmonella typhimurium (штаммы TA97, TA98, TA100 и TA102), выращенные при 37°C до поздней экспоненциальной фазы (примерно 109 клеток/мл). Для отбора реверсий по генам биосинтеза гистидина будет использована минимальная среда VB с глюкозой и биотином, содержащая гистидин в низкой концентрации, достаточной только для нескольких делений ауксотрофных клеток. Тестирование будет проведено как в условиях метаболической активации промутагенов, так и без нее. Обработка клеток флоротаннинами будет проведена в полужидком верхнем агаре непосредственно на чашках Петри с селективной средой для отбора ревертантов. Для этого в пробирки с 2 мл верхнего агара будет добавлено 50 мкл препаратов флоротаннинов, 100 мкл свежей бактериальной культуры, 0.5 мл смеси для метаболической активации (содержащей 10–30% (v/v) микросомальную фракцию S9 печени грызунов и кофакторы) или 0.5 мл фосфатного буфера. Полученная смесь будет равномерно распределена по поверхности селективной среды в чашке Петри. Для каждого варианта экспериментальных условий будет использовано три повторности. После застывания верхнего агара, чашки будут инкубированы при температуре 37°C. Через 3-5 дней инкубации будет подсчитано число колоний ревертантов на каждой чашке. О наличии мутагенной активности будет свидетельствовать увеличение среднего числа ревертантов в присутствии тестируемой фракции флоротаннинов по сравнению с контролем.
Действие флоротаннинов на частоту мутаций будет проверено на дрожжах S. cerevisiae с использованием теста на индукцию прямых мутаций устойчивости к канаванину. Для этого независимые культуры дрожжей будут выращены в SC среде, содержащей флоротаннины в различной концентрации (по 9 культур для каждой концентрации флоротаннинов). Для определения числа живых клеток и числа мутантов, возникших в ходе роста культуры в присутствии флоротаннинов, дрожжевые культуры в серийном разведении будут высеяны на среду SC и среду SC-Can, содержащую канаванин. После инкубации чашек Петри в течение 3-5 дней при 30°C будет подсчитано число колоний на каждой чашке. Частота мутаций в каждом случае будет определена как отношение числа канаванин-устойчивых мутантов к числу живых клеток в культуре. Аналогичным образом будет оценена частота возникновения реверсий к прототрофности по гистидину и триптофану.

2.4. Метаболомные исследования
В рамках данного раздела будут исследованы изменения профиля первичных и, частично, вторичных метаболитов клеток, подвергшихся обработке флоротаннинами разной молекулярной структуры. Метаболитный профиль объектов будет исследован с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии с использованием двухсекторного анализатора с ионизацией электронным ударом. Водно-метанольные экстракты клеток, обработанных флоротаннинами, будут высушены и затем последовательно дериватизированы О-метилгидроксиламин гидрохлоридом (МОА) и N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидом (MSTFA) (Birkemeyer et al., 2019). Анализ сахаров, аминов, аминокислот, органических кислот, сахароспиртов и прочих низкомолекулярных полярных метаболитов будет проводиться с использованием 5% -фенил-95% -диметилсилоксановой колонки (DB-5 MS UI, J & W Fisher, Германия) на газовом хроматографе Agilent 6890 (скорость потока 1 мл/мин, инжекция без разделения пробы, температура инжектора 250°C). Данный прибор оснащен автоматическим пробоотборником (автосэмплером) 7683 (CTC Analytics, Zwingen, Switzerland) и совмещен в режиме онлайн с квадрупольным масс-спектрометром (EI-Q-MS, MSD 5973, Agilent Technologies, Böblingen, Germany) с электронной ионизацией (70 eV). Обработка хроматограмм (выделение и выравнивание пиков) будет выполнено с помощью компьютерной программы Automated Mass Spectral Deconvolution & Identification System (AMDIS), идентификация аналитов будет проведена на основе индексов удерживания (RI) по доступным библиотекам масс-спектров (NIST14 и внутренние библиотеки). Количественные расчеты будут производиться на основе интегральных площадей хроматографических пиков, реконструированных для характеристических значений m/z (XIC, ± 0.5 Da) и времени удерживания (RT) с использованием компьютерной программы MassHunter. Для абсолютного количественного анализа будет использован метод добавок стандартов (пять уровней калибровки).

Общий план работ на период выполнения проекта:

1 год

Сбор и фиксация растительного материала (20 видов бурых водорослей);
Экстракция внутриклеточных и ассоциированных с клеточной стенкой флоротаннинов из талломов бурых водорослей;
Исследование содержания двух субклеточных фракций флоротаннинов в талломах 20 видов бурых водорослей;
Характеристика молекулярных профилей флоротаннинов разных водорослей-продуцентов с помощью HPLC-MS анализа;
Проведение серии тестовых экспериментов по исследованию антибиотической и генотоксической активности полученных препаратов флоротаннинов.

2 год

Сбор и фиксация растительного материала (при необходимости);
Экстракция внутриклеточных и ассоциированных с клеточной стенкой флоротаннинов из талломов бурых водорослей (при необходимости);
Исследование метаболитных профилей бурых водорослей – продуцентов флоротаннинов;
Исследование биологической активности полученных 40 препаратов флоротаннинов, определение МИК для серии модельных объектов;
Метаболомные исследования клеток, подвергшихся обработке флоротаннинами;
Обобщение и анализ полученных данных.

Научный задел по проекту за 2019-2021 гг.:
Руководителем предлагаемого проекта, совместно с коллегами из Института аналитической химии университета Лейпцига (Германия) был разработан метод анализа флоротаннинов, основанный на высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии с масс-спектрометрической детекцией (HPLC-MS и GC-MS). Флоротаннины трех видов водорослей порядка Fucales были выделены и проанализированы с помощью квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрии, совмещенной с HPLC (RP-HPLC-QqTOF-MS) (Birkemeyer et al., 2020). В этой работе впервые была сделана попытка охарактеризовать фракцию флоротаннинов, связанную с клеточной стенкой. Кроме того, мономер флоротаннинов флороглюцин и ряд низкомолекулярных флоротаннинов и их возможных производных были выделены из взрослых талломов и эмбрионов бурой водоросли Fucus vesiculosus и проанализированы с помощью GC-MS (Birkemeyer et al., 2019; Lemesheva et al., 2020). Было показано, что для разных зон таллома макрофитных водорослей характерны специфические молекулярные профили растворимых флоротаннинов. Например, в меристематических апексах талломов Fucus serratus резко доминируют низкомолекулярные флоротаннины со степенью полимеризации 6–8, в то время как преобладающие флоротаннины ассимиляционных тканей центральной зоны таллома имеют степени полимеризации 7-21. Также, было показано, что субклеточная фракция флоротаннинов, ассоциированная с клеточной стенкой, по молекулярной структуре существенно отличается от фракции растворимых внутриклеточных флоротаннинов. В общей сложности, в клетках трех видов фукусовых водорослей было выявлено более двадцати структурных разновидностей флоротаннинов, многие из которых были описаны впервые (Birkemeyer et al., 2020).Руководитель предлагаемого проекта владеет методами классической и молекулярной генетики микроорганизмов с использованием таких объектов как Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae (Stepchenkova et al. 2021), имеет опыт токсикологических исследований (Popova et al., 2019). Значительный блок работ научного коллектива был выполнен с использованием гамет, зигот и эмбрионов фукусовых водорослей. В частности, были проведены исследования динамики метаболитного профиля и содержания двух субклеточных фракций флоротаннинов в ходе раннего эмбриогенеза Fucus vesiculosus (Lemesheva et al., 2020).Члены коллектива имеют значительный опыт исследования метаболитных профилей макрофитных водорослей с применением GC-MS анализа (Birkemeyer et al., 2019; Lemesheva et al., 2020; Yanshin et al., 2021). В частности, было показано, что распределение флоротаннинов разных структурных классов по таллому бурой водоросли Fucus vesiculosus отражает специфику метаболитного профиля разных зон таллома (репродуктивных органов, зоны активного вегетативного роста, ассимилирующей зоны и др.). По-видимому, низкомолекулярные фуколы преимущественно приурочены к зонам интенсивного роста, в то время как молекулы со степенью полимеризации 14–29 более характерны для центральной части таллома, в которой наиболее активно идут фотосинтетические процессы и накапливаются фотоассимиляты (Birkemeyer et al., 2019, 2020).
Публикации по теме проекта:
1.Yanshin N., Kushnareva A., Lemesheva V., Birkemeyer C., Tarakhovskaya E. Chemical composition and potential practical application of 15 red algal species from the White Sea coast (the Arctic Ocean) // Molecules. 2021. 26. 2489. https://doi.org/10.3390/molecules26092489.2.Stepchenkova E. I., Zhuk A. S., Cui J., Tarakhovskaya E. R., Barbari S. R., Shcherbakova P. V., Polev D. E., Fedorov R., Poliakov E., Rogozin I. B., Lada A. G., Pavlov Y. I. Compensation for the absence of the catalytically active half of DNA polymerase ε in yeast by positively selected mutations in CDC28 // Genetics. 2021. 218(2). iyab060. https://doi.org/10.1093/genetics/iyab060.3.Birkemeyer C., Lemesheva V., Billig S., Tarakhovskaya E. Composition of intracellular and cell wall-bound phlorotannin fractions in fucoid algae indicates specific functions of these metabolites dependent on the chemical structure // Metabolites. 2020. 10. 369. https://doi.org/10.3390/metabo100903694.Lemesheva V., Birkemeyer C., Garbary D., Tarakhovskaya E. Vanadium-dependent haloperoxidase activity and phlorotannin incorporation into the cell wall during early embryogenesis of Fucus vesiculosus (Phaeophyceae) // European Journal of Phycology. 2020. Vol. 55. P. 275-284. https://doi.org/10.1080/09670262.2019.1709131.5.Birkemeyer C., Osmolovskaya N., Kuchaeva L., Tarakhovskaya E. Distribution of natural ingredients suggests a complex network of metabolic transport between source and sink tissues in the brown alga Fucus vesiculosus // Planta. 2019. Vol. 249. P. 377-391. https://doi.org/10.1007/s00425-018-3009-4.6.Popova E. A., Protas A. V., Mukhametshina A. V., Ovsepyan G. K., Suezov R. V., Eremin A. V., Stepchenkova E. I., Tarakhovskaya E. R., Fonin A. V., Starova G. L., Mikolaichuk O. V., Porozov Y. B., Gureev M. A., Trifonov R. E. Synthesis, biological evaluation and molecular docking studies on the DNA and BSA binding interactions of palladium(II) and platinum(II) complexes featuring amides of tetrazol-1-yl- and tetrazol-5-ylacetic acids // Polyhedron. 2019. Vol. 158. P. 36-46. https://doi.org/10.1016/j.poly.2018.10.0387.Lemesheva V., Tarakhovskaya E. Physiological functions of phlorotannins // Biol. Comm. 2018. Vol. 63. P. 70-76. https://doi.org/10.21638/spbu03.2018.1081028.Tarakhovskaya E., Lemesheva V., Bilova T., Birkemeyer C. Early embryogenesis of brown alga Fucus vesiculosus L. is characterized by significant changes in carbon and energy metabolism // Molecules. 2017. Vol. 22(9), 1509. https://doi.org/10.3390/molecules22091509.9.Stepchenkova E., Tarakhovskaya E. Siebler H., Pavlov Yu. Defect of Fe-S cluster binding by DNA polymerase δ in yeast suppresses UV-induced mutagenesis but enhances DNA polymerase ζ - dependent spontaneous mutagenesis // DNA Repair. 2017. Vol. 49. P. 60-69. https://doi.org/10.1016/j.dnarep.2016.11.004.