Проект направлен на решение глобальной междисциплинарной проблемы, имеющей важное фундаментальное и прикладное значение: «Иерархически организованная и композитная структура костной ткани человека и ее уникальные свойства как научная основа для создания новых биотехнологий, природоподобных наноматериалов медицинского назначения и методов медицинской диагностики».
Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы определяется необходимостью научного поиска и построения фундамента для развития новых наукоемких технологий в таких приоритетных направлениях научно-технологического развития Российской Федерации как: «Переход к передовым цифровым, интеллектуальным производственным технологиям, роботизированным системам, новым материалам и способам конструирования,….», а также «Переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровье сбережения».
В Российской Федерации за период с 2006 по 2011 годы распространенность развития патологии костной ткани возросла на 35%. Остеоартрит встречается у каждого третьего пациента в возрасте от 45 до 64 лет и у 60-70% лиц старше 65 лет [1]. По данным последних исследований [3] в России распространенность остеопорозом составляет 13%. Он регистрируется у каждой третьей женщины и каждого четвертого мужчины в возрасте 50 лет и старше. Следует иметь в виду, что согласно [2] имеется недоучет указанных заболеваний. К 2035 г. общее число основных остеопорозных переломов увеличится с 590 тыс. до 730 тыс. случаев в год. В Европе летальность остеопорозных переломов сравнима с онкологическими заболеваниями. Остеоартрит и остеопороз затратны для здравоохранения из-за высокой стоимости лечения, которые сопровождаются существенным снижением качества жизни, инвалидизацией пациентов и летальностью [2]. Ежегодные затраты, по данным разных авторов, достигают 60 миллиардов долларов, что связано лишь с медицинским обслуживанием (51%) и снижением производительности труда (49%). Косвенные расходы, вызванные потерей трудоспособности, необходимостью обеспечить уход на дому и др., также растут. В связи с увеличением продолжительности жизни и развитием концепции «Активного долголетия» технологии регенерации и направленного роста скелетных тканей становятся чрезвычайно актуальными. Это определяет интерес междисциплинарных научных коллективов к разработке новых способов визуализации тканей и методов тканевой инженерии, а также конвергентных (NBICS) технологий конструирования биосовместимых и природоподобных материалов.
Костная ткань является наиболее сложной материей в природе: две иерархически организованные и наноструктурированные (органическая и минеральная) подсистемы, тесно взаимодействующие друг с другом, формируют ее уникальные физико-химические и механические свойства. Исследование костной ткани дает нам новые знания и инструменты для совершенствования тканевой инженерии, технологий сборки новых природоподобных (остео-миметических) материалов с уникальными свойствами, вносят вклад в развитие современной теории биоминерализации [4, 5], расширяют возможности новаторских биотехнологий и биосовместимых нанокомпозитных материалов, биомаркеров и скаффолдов [6-10]. Последние исследования авторов этого проекта показали [11, 12], что кость является своего рода электрической батарейкой, собранной из множества заряженных наноэлементов, электростатическая энергия которых максимальна в молодой кости и убывает с возрастом. Это наблюдение открывает широкие горизонты не только для решения клинических задач регенерации костной ткани, но и указывает путь развития биотехнологий остео-миметического конструирования открывает новые возможности для развития новаторских биотехнологий, направленных на создание новых экологически чистых материалов для преобразования, аккумуляции и хранения электрической энергии.
Решение указанной проблемы требует проведение направленных междисциплинарных исследований с привлечением спектроскопических, кристаллографических и биомедицинских подходов, а также многомасштабного моделирования свойств материалов с использованием современных вычислительных подходов. Взаимодействие нано-, био- и информационных технологий в данном проекте носит синергетический и рекурсивно взаимоусиливающий характер, что проявляется в интерференции технологий направленных на создание новых материалов, способов преобразования энергии и методов здоровьясбережения.
Внедрение в практику этих новаций, превосходящих по эффективности имеющиеся аналоги, должно иметь значимое социально-экономическое значение, так как будет способствовать развитию энергосберегающих и экологически чистых технологий и уменьшению затрат на лечение, реабилитацию и обслуживание пациентов с различными патологиями костной ткани, что приведет к улучшению качества жизни населения России.
Основной комплексной задачей проекта является установление взаимосвязей между нано-, микро- и макро-структурой иерархически организованной костной ткани в организме человека и ее уникальными эмергентными свойствами и на их основе создать научную базу для новых методов визуализации костной ткани на субклеточном уровне и ранней диагностики ее патологии.
Для решения этой задачи предполагается:
1. Изучить взаимосвязь иерархической организацией костной ткани различной морфологии с её наноструктурой, выявить закономерности взаимосвязи характеристик макро и нано-структурных элементов костной ткани и сделать заключение о механизмах формирования её эмергентных свойств.
2. Разработать новые физические модели для описания электронного и атомного строения костной ткани и развития квантово-механических методов расчета ее характеристик и апробировать разработанные модели и методы путем сравнительного анализа экспериментальных и клинических данных и результатов модельных расчетов.
3. Изучить влияние механических нагрузок и элементного состава на нано- и микроструктуру различных типов костных тканей человека и их эмергентные свойства в норме и патологии.
4. Выявить биомаркеры костной ткани, характеризующие наноструктуру минерального и органического матрикса и межкристаллитной воды в костной ткани.
5. Разработать физические основы для создания новых методов визуализации костной ткани на субклеточном уровне и ранней диагностики ее патологии.
Проект носит ярко выраженный междисциплинарный характер. Поставленные фундаментальные и прикладные задачи охватывают Физику конденсированного состояния, Химическую физику, Медицинскую физику, Кристаллофизику и Остеологию. Для их решения предполагается привлечь широкий комплекс физических и кристаллографических методов и подходов, и сопоставить полученные результаты с данными современной медицинской диагностики. Полученные результаты должны внести свой вклад в такие глобальные проблемы, как электронная и атомная структура иерархически организованной материи, теория строение самоорганизованных биоминеральных нанокомпозитных систем. Эти результаты должны способствовать переходу России к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровье сбережения.
Научная новизна планируемых исследований заключается, в первую очередь, в комплексном междисциплинарном подходе к решению поставленных в проекте задач, использовании оригинальных результатов полученные ранее участниками проекта, а также глубине и детальности изучения иерархической, электронной и атомной структуры костной ткани человека и ее эмергентных свойств.
Использование широкого комплекса современных спектроскопических и дифракционных методов и подходов с учетом данных медицинской диагностики должно привести к получению принципиально новых фундаментальных результатов. Впервые будут установлены взаимосвязи между нано-, микро- и макроструктурой иерархически организованной костной ткани и ее уникальными эмергентными свойствами; выявлены новые биомарекры наноструктуры костной ткани, разработаны и апробированы новые физические модели для описания электронного и атомного строения костной ткани и развития квантово-механических методов расчета значений биомаркеров. Впервые будет изучено влияние механических нагрузок и элементного состава на наноструктуру различных типов костных тканей человека в норме и патологии, будут исследованы особенности химической связи атомов на межфазовых границах нанокристаллит – коллаген – гидратные нанослои, пьезоэлектрического эффекта и эффекта линейного дихроизма фотопоглощения в костных тканях, впервые обнаруженного авторами этого проекта. Полученные результаты должны внести свой вклад в развитие представлений о электронном и атомном строении и физических свойствах самоорганизованной твердой материи. Важной отличительной особенностью проекта является также наличие оригинальных идей по созданию фундаментальных основ для разработки физических методов визуализации костной ткани на субклеточном уровне и ранней диагностики ее патологии на основе применения оригинального набора биомаркеров физиологических процессов и фармакологических ответов на терапевтическое вмешательство, что должно внести важный вклад в развитие российских медицинских технологий здоровье сбережения.
Достижимость решения поставленной междисциплинарной задачи и возможности получения предполагаемых результатов обусловлены, в первую очередь, объединением усилий ученых различных областей знаний (физиков, кристаллографов и медиков) которые много лет работают над близкими проблемами и имеют существенные научные достижения в данной области, а также тем, что более половины исследовательской группы составляют талантливые, увлеченные своей работой активные молодые специалисты и студенты. Этому будет способствовать также оригинальные методические разработки, полученные участниками проекта при выполнении грантов РФФИ (15-02-06369, 19-02-00891). Ключевую роль в успешном выполнении проекта сыграет наличие в распоряжении исследовательской группы широкого комплекса современного оборудования Ресурсных центров СПбГУ, а также использованием источников синхротронного излучения (Курчатовский источник СИ (КИСИ), Москва. Предполагается факультативное использование оборудования электронного накопителя BESSY II, Гельмгльц-Центр (г. Берлин, Германия) и источников синхротронного излучения Elettra (г. Триест, Италия), и MAX IV (г. Лунд, Швеция). Последние позволят повысить результативность данного проекта, но их использование не является необходимым для его выполнения.
Научная новизна исследований определяется, прежде всего,
(i) совокупностью выявленных количественных характеристик и биомаркеров наноструктуры костной ткани различной морфологии на основе спектроскопических (в широком диапазоне длин волн), дифракционных и электрон-микроскопических измерений биоптатов с использованием современных экспериментальных и теоретических методов изучения электронной и атомной структуры вещества и современных методов приготовления и консервации биоптатов;
(ii) определением новых эмергентных свойств костной ткани и их взаимосвязи с иерархической организацией скелета;
(iii) установлением закономерностей показаний биомаркеров наноструктуры костной ткани с данными ее клинической диагностики, полученной с использованием современных биомедицинских технологий;
(iv) результатами анализа взаимосвязи характеристик костной ткани на субклеточном уровне с макроструктурных изменений костной ткани;
(v) установлением взаимосвязи биомеханических и биохимических механизмов на нано- и микроструктуру костной ткани;
(vi) результатами исследования явления линейного дихроизма фотопоглощения в костной ткани;
(vii) разработкой основ новых методов медицинской визуализации и диагностики костной на субмолекулярном уровне и методов адресной доставки лекарственных средств, а также проведением оценки их перспективности для решения задачи о переходе к персонализированной медицине.
Впервые для решения поставленной задачи будет использован комплекс современных методов и технологий (а) спектроскопических измерений в широком диапазоне длин волн, (в) обработки и анализа экспериментальных данных и (г) моделирования электронной и атомной структуры, молекулярной динамики и атомно-молекулярной архитектуры костной ткани и её взаимодействия с коллагеновыми волокнами и внутри- и межкристаллитной водой. Впервые будет получена количественная информация о влиянии механических нагрузок на нано- и микроструктуру костной ткани с использованием специально подобранной последовательности биоптатов медиального и латерального мыщелков бедренной и большеберцовой кости при эндопротезировании коленного сустава различной деформации и различной степени порозности. Сравнительный анализ клинико-рентгенологических данных с результатами спектроскопических, дифракционных, электрон-микроскопических и модельных исследований позволит (а) получить новые фундаментальные знания о взаимосвязи иерархической организации скелета с электронной и атомной структурой и атомно-молекулярной архитектурой костной ткани, (б) определить количественные характеристики нано- и микроструктуры, ориентации, размеров нанокристаллитов и их сверхупорядоченности в костной ткани и зависимости от возраста и механических нагрузок.
Экспериментальные исследования будут проводиться с использованием оборудования ресурсных центров «Нанотехнологии», «Физические методы исследования поверхности», «Рентгенодифрационные методы», «Оптические и лазерные методы исследования вещества» научного парка СПбГУ, а также с использованием источников синхротронного излучения Курчатовский источник СИ (КИСИ) и клинических возможностей ФГБУ «РНИЦ травматологии и ортопедии им. Р.Р. Вредена». Достижимость решения поставленной задачи и возможность получения запланированных результатов основана на проведенных ранее (i) успешных измерениях спектров КР, ИК, ФЭ и NEXAFS-спектров кортикальной костной ткани крыс и биоптатов субходральной костной ткани при эндопротезтровании коленного сустава с использованием лазерного, рентгеновского характеристического и синхротронного излучения, подтвердивших перспективность спектроскопических подходов для изучения атомно-молекулярной архитектуры иерархической организации минерального матрикса костной ткани, (ii) успешной апробации 3DSL модели для анализа КР, ФЭ и NEXAFS-спектров. Проведенные авторами проекта исследования выявили заметное влияние иерархической организации костной ткани на энергию рентгеновских переходов из внутренних электронных оболочек атомов кальция, фосфора и кислорода в незанятые состояния расположенные вблизи дна зоны проводимости кристалла апатита, на энергии связи электронных уровней в интактной зоне и зонах поражения остеоартритом, на форму рамановских переходов, отвечающих полносимметричным колебаниям в ионах фосфата в костных тканях различного возраста. Выявлено возникновение эмергентных свойств, а именно линейный рентгеновский дихроизм кортикальной костной ткани, а также заметные отличия энергий связи Ca 2p уровней в интактной и поврежденных остеоартритом зонах бедренной кости, Коллектив обладает большим опытом проведения и решения сложных теоретических и спектроскопических исследований.
Изучение особенностей строения костной в живых организмах имеет фундаментальное значение для выяснения механизмов эволюции минеральной и органической материи, приведших к формированию биосферы, которая стала мощным фактором, влияющим на литосферу, гидросферу и атмосферу [1-4]. Постоянно возрастающий интерес научной общественности к изучению твердых биологических тканей связан, в первую очередь, с тем, что их биомиметические аналоги, благодаря биосовместимости, широко используются для создания новых материалов медицинского назначения (имплантов, биометок, скаффолдов, средств доставки и удаления лекарств и др.) [5-10].
Современные представления об иерархической организации костной ткани и ее микроструктуре основаны на результатах полученных, прежде всего, в рамках кристаллографических и медико-биологических и исследований, которые опираются на данные электронной микроскопии и рентгеноструктурного анализа. Иерархическая организация скелета позволяет обеспечить в любой его точке биологически требуемую комбинацию жесткости и прочности [11, 12]. Это свойство детерминировано особенностями организации элементов, формирующих костные структуры на каждом иерархическом уровне, в разных пространственных масштабах [13].
Трехмерная иерархическая (нано- и мезоуровневая) модель костной ткани, состоящая из компланарных ансамблей нанокристаллитов гидроксилапатита, разделенных нанослоями из молекул воды, предложена в [14. 15]. Модель позволяет объяснить взаимодействие параметров ближнего, дальнего и сверхдальнего порядка. Однако, влияние иерархической организации костной ткани на ее электронные и атомные свойства, температурный диапазон ее образования требуют дальнейшего изучения.
Образование костных и зубных тканей живых организмов осуществляется в результате биоминерализации — механизма, определяющего эволюцию живого организма путем рационального создания уникальных комплексов «организм - материал» [16 – 18]. Результаты исследования физиогенных и патогенных карбонатгидроксилапатитов, образующихся в организме человека, показали, что они характеризуются переменным нестехиометрическим составом, что отражает нестационарные условия их образования [19]. Нарушение стехиометрия составов биологических апатитов связана с присутствием вакансий в позициях кальция и OH-ионов, а переменный состав — с изоморфными замещениями во всех кристаллографических позициях. Концентрации примесных ионов в биологических апатитах ограничены, в первую очередь, их предельными содержаниями в физиологических растворах. Представления разных авторов об отличительных особенностях биологических апатитов существенно различаются, что свидетельствует о необходимости их уточнения [19, 20].
В основе механизмов, определяющих свойства человеческого скелета лежат биокосные взаимодействия между белковой (коллагеновой) и минеральной (апатитовой) составляющих. Существенное влияние на свойства апатита и апатит-содержащих композитов оказывает присутствие примесных ионов в различных концентрациях, что позволяет направленно их изменять, добиваясь требуемых значений. Вопросам использования синтетических гидроксилапатитов, содержащих различные примеси, для создания различных природоподобных материалов и технологий посвящены многочисленные статьи, а также обзоры [5,6,8, 21]. Многие особенности образования минералов биологических твердых тканей могут быть объяснены только с использованием неклассического подхода, предполагающего агрегационный рост кристаллов, при котором в качестве строительных единиц используются мульти-ионные комплексы, кластеры и даже наночастицы [22]. Такой подход позволяет объяснить образование аморфных фаз, выполняющих роль прекурсоров, на начальном этапе биологической кристаллизации и образование мезокристаллов, состоящих из сотен или тысяч нанокристаллов, но дифрагирующих, как монокристаллы, на ее конечном этапе.
Расчеты, проведенные Jager и Fratz [23], показали, что с позиций классической механики оптимальной является ступенчатая организация минеральных частиц в фибриллах, что было подтверждено в [24]. К сожалению, модель Jager’а и Frantzl’, лишь схематично учитывает морфологические характеристики минерального матрикса на наноуровне. В этой модели не учитывается, что (i) минеральные структуры распределены не только внутрифибриллярно, но и внефибриллярно, (ii) нанопластинки минералов, разделенные прослойками молекул коллагена, не могут передавать напряжения и деформации к минеральным пластинкам, поскольку их модули упругости различаются на два порядка, (iii) отсутствуют данные о механизмах связи между молекулами коллагена и минеральными пластинками, (iv) не учитывается различная степень минерализации фибрилл. Частично эти недостатки нивелированы в морфологической модели, предложенной Ю.И. Денисовым-Никольским с соавторами [25]. В ней заложен принципиально другой механизм, определяющий жесткость и прочность костных структур. Авторы считают, что отдельные кристаллиты взаимосвязаны между собой через их гидратную оболочку. По данным Fantner с соавторами [26]. Механическую связь кристаллитов апатита между собой обеспечивает гидратный слой, который представляет собой двойной слой с избытком ионов кальция, компенсирующих заряды ионов фосфата и карбоната на поверхности кристаллита [27, 28].
Взаимодействия между всеми составляющими нанокомпозитной системы «белок –апатит –вода» претерпевают заметные изменения в процессе старения организма, развития остеопороза и в зонах пораженных остеоартритом [29, 30]. Их изучение на наноуровне позволит разработать новые диагностические тесты и новые подходы к лечению локальной и системной патологии скелета.
Современные физические исследования локальной структуры костной ткани, как правило, используют просвечивающую электронную микроскопию, малоугловое рассеяние рентгеновских лучей и ИК-спектроскопию (см. [31]). Первые два метода позволяют выявить организацию минерального матрикса, представляющую копланарный конгломерат и определить размеры нанокристаллитов (или области когерентгого рассеяния). Достижения этих методов широко используются в структурной модели костной ткани Денисова-Никольского с соавторами. ИК спектроскопия позволяет измерять частоты колебания молекулярных или квазимолекулярных фрагментов костной ткани.
Проведенные в последние годы исследования костных тканей методами рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (ФЭС) [32] и абсорбционной (особенно NEXAFS) спектроскопии высокого разрешения [14, 33 – 34], продемонстрировали ее применимость и перспективность для изучения локальной электронной структуры нативной костной ткани в условиях сверхвысокого вакуума. Эти исследования позволяют выявить влияние иерархической организации костной ткани на её локальную электронную и атомную структуру, которое проявляется в (а) низкоэнергетическом сдвиге рентгеновских переходов [14, 34] и (б) появлении, зависящих от зоны сдвигах энергий связи остовных электронов в ионах кальция и фосфора [32, 35]. Были выявлены новые эмергентные свойства костной ткани, а именно, дихроизм поглощения линейно поляризованного рентгеновского излучения вблизи Ca 2p края. Показано, что интенсивность фотопоглощения зависит от ориентации электрического вектора излучения относительно главной оси костной ткани [37]. Этот результат подтверждается исследованиями Гессе [39]. Следует особо отметить, что исследования Ca 2p ФЭС показали, что состояния ионов кальция могут рассматриваться как биомаркеры локального состояния костной ткани: в интактных зонах субхондральной кости наблюдался апатитный кальций (100%), тогда как в зонах поврежденных остеоартритом доминировал неапатитный кальций (88%) [32]. Последние исследования авторов проекта показали, что как энергии связи Ca 2p, так и P 2p и N 1s электронов могут рассматриваться как биомаркеры старения костной ткани. Эти энергии найдены минимальными для кортикальных костей новорожденных крыс. Эти энергии возрастают с возрастом здоровых крыс (эти результаты приведены в сопутствующем материале). В пределе энергии Ca 2p, так и P 2p электронов стремятся к соответствующим значениям в апатите. Было также обнаружено, что изменения постоянной «с» кристаллической ячейки апатита в костной ткани закономерно меняется с возрастом. Важным фактором для понимания особенностей взаимосвязи локальной электронной и атомной структуры костной ткани с её иерархической организацией является модель 3D сверхрешетки [14], которая опирается на морфологическую модель, предложенную Ю.И. Денисовым-Никольским с соавторами [25], и учитывает квантово-механические особенности распространения электронных волн в сверхпериодическом потенциале. Эта модель позволяет понять особенности поглощения рентгеновского излучения в минеральном матриксе кости ткани и их отличия от поглощения в биоапатите. Однако, эта модель требует всесторонней проверки.
Проведенный анализ современного состояния исследований в данной области науки свидетельствует об актуальности междисциплинарной фундаментальной научной задачи, на решение которой направлен проект.
1.Вернадский В.И. Биосфера. Л.: НХТИ, 1926. 147 с.
2.Самойлов Я.В Биолиты, Л.: НХТИ, 1929. 140 с.
3.Ферсман А.Е. Геохимия. Т. 2. - Л.: ОНТИ-Химтеорет, 1934. - 354 с.
4.Юшкин Н.П. Биоминеральные взаимодействия: 42-е чтения им. В.И. Вернадского. М.: Наука, 2002, 600 с.
5. Barinov S.M. Calcium phosphate-based ceramic and composite materials for medicine// Russ.Chem.Rev.,79 (1), 2010. 13–29.
6. Barinov S. and Komlev V. Calcium Phosphate based Bioceramics for Bone Tissue Engineering. Switzerland, UK, USA: Trans Tech Publications LTD, 2008.162.p.
7.Iafisco M., Delgado-López J.M. (Editors) Apatite: Synthesis, Structural Characterization and Biomedical Applications In Geology and Mineralogy Research Developments Materials Science and Technologies Series/Geology and mineralogy research developments Nova Science Publishers, Incorporated, 2014. 364 p.
8.Iafisco M., Delgado-López J.M. (Editors) Apatite: Synthesis, Structural Characterization and Biomedical Applications In Geology and Mineralogy Research Developments Materials Science and Technologies Series/Geology and mineralogy research developments Nova Science Publishers, Incorporated, 2014. 364 p.
9.Landis W.J., Hodgens K.J., Arena J., Song M.J., McEwen B.F. Structural relations between collagen and mineral in bone as determined by high voltage electron microscopic tomography. // Microscopy Res and Technique. N 33. 1996.192-202.
10.Lin K., Wu C., Chang J. Advances in synthesis of calcium phosphate crystals with controlled size and shape// ActaBiomater. 10. 2014. 4071–4102.
11. Weiner S.,Wagner H.D. 1998 Annu. Rev. Mater. Sci. 28 271 – 98
12. Frost H. M. Defining Osteopenias and Osteoporoses: Another View (With Insights From a New Paradigm). Bone. 1997; 20(5):385-391.
13. Currey J. Sacrificial bonds heal bone. Nature.2001; 414(6865):699.
14. Pavlychev, A. A., Vinogradov, A. S., Filatova, E. O., Doctorov, A. A., Krivosenko, Y. S., Samoilenko, D. O., Svirskiy, G. I., Konashuk, A. S. & Rostov, D. A., Local electronic structure and nanolevel hierarchical organization of bone tissue: theory and NEXAFS study .// Nanotechnology. 2016, 27, 50, стр. 1-8.
15 А.С. Аврунин, А.А. Павлычев, А.А. Докторов, А.С. Виноградов, Д.О. Самойленко, Г.И. Свирский О влиянии иерархической организации скелета на электронные состояния ионов минерального матрикса // ТРАВМАТОЛОГИЯ И ОРТОПЕДИЯ РОССИИ, 2016. — T. 22, — № 4.
— С. 88-97
16. Yao S., Jin B., Liu Z., Shao C., Zhao R., Wang X., and Tang R. Biomineralization: From Material Tactics to Biological Strategy//Adv. Mater. 29, 2017. 1605903.
17. Cuéllar-Cruz M. Synthesis of inorganic and organic crystals mediated by proteins in different biological organisms. A mechanism of biomineralization conserved throughout evolution in all living species//Progress in Crystal Growth and Characterization of Materials 63. 2017. 94–103.
18. .Engel J. A Critical Survey of Biomineralization. Control, Mechanisms, Functions and Material Properties. Springer Briefs in Applied Sciences and Technology Springer International Publishing 2017. 64 p.
19. Frank-Kamenetskaya O.V., Izatulina A.R., Kuz’mina M.A. Ion Substitutions, Non-stoichiometry and formation conditions of oxalate and phosphate minerals of the human body. In “Biogenic-Abiogenic Interactions in Natural and Antrophogenic Systems” (Eds. Frank-Kamenetskaya O.V., Panova E.G., Vlasov D.Yu.) Springer International Publishing Switzerland 2016. 425 – 442.
20. Deymier A.C., Nair A.K., Depalle B., Qin Z., Arcot K., Drouet C., Yoder C.H., Buehler M.J., Thomopoulos S., Genin G., Pasteris M., Jill D. Protein-free formation of bone-like apatite: New insights into the key role of carbonation//Biomaterials 127 2017. 75-88.
21. Šupová M. Substituted hydroxyapatites for biomedical applications: A review//Ceramics International 41. 2015. 9203–9231.
22. Colfen H., Antonietti M. Mesocrystals and Nonclassical Crystallization. John Wiley & Sons. 2008. 288 p.
23. Fratzl P., Weinkamer R. 2007 Prog. Nat. Sci. 52 1263-334.
24. J Lv, W Wang, T Krafft, Y Li, F Zhang, F Yuan. Biological trace element research 143 (2), 702-716, 2011
25. Денисов-Никольский Ю.И., Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Матвейчук И.В. Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии. М.:ОАО «Типография «Новости»; 2005. 336 с.
26. Fantner G.E., Hassenkam T., Kindt J.H., Weaver J.С., Birkedal H., Pechenik L., Cutroni J.A., Cidade G.A.G.,Stucky G.D., Morse D.E., Hansma P.K. Sacrificial bonds and hidden length dissipate energy as mineralized fibrils separate during bone fracture. Nature materials. 2005 Vol. 4I, 612-616
27. Wilson E. E., Awonusi A., Morris M. D. et al. Highly ordered interstitial water observed in bone by nuclear magnetic resonance. J bone mineral research. 2005, v. 20, № 4, p. 625-634
28. Wilson E.E., Awonusi A., Morris M.D., Kohn D.H., Tecklenburg M.M.J., Beck L.W. Three structural roles for water in bone observed by solid-state NMR. Biophysical J., 2006, v. 90, № 10, p. 3722-3731.
29. А.С. Аврунин, Ю.И. Денисов-Никольский, А.А. Докторов, Ю.С. Кривосенко, Д.О. Самойленко, А.А. Павлычев, И.И. Шубняков Влияние воды, различных включений и замещений на физико-химические свойства биоапатита и механические свойства минерализованных тканей // ТРАВМАТОЛОГИЯ И ОРТОПЕДИЯ РОССИИ, 2015. — № 3 (77). — С. 37 – 50
30. Cherny A.A., Kovalenko A.N., Bilyk S.S., Denisov A.O., Kazemirskiy A.V., Kulyaba T.A., Kornilov N.N. [Early Outcomes of Patient-Specific Modular Cones for Substitution of Methaphysial and Diaphysial Bone Defects in Revision Knee Arthroplasty]. Travmatologiya i ortopediya Rossii [Traumatology and Orthopedics of Russia]. 2019;25(2):9-18.(in rus). DOI: 10.21823/2311-2905-2019-25-2-9-18.]
31. A. Nikolaev, V.V. Bazhenov, O.V. Frank-Kamenetskaya, O. V. Petrova, Psychrophilic Calcification In Vitro. In: Extreme Biomimetrics, Ed. H. Ehrlich, Springer IP AG 2017.
32. X.O. Brykalova, N.N. Kornilov, Y.A. Rykov, A.A. Cherny, A.A. Pavlychev, Site-Dependent Peculiarities of Calcium Bonds in Bone Tissue, J. Phys. Chem. Lett. (2020) 11, 7839-7842, doi: 10.1021/acs.jpclett.0c01722
33. Rajendran J. 2011 XANES and FTIR study of dried and calcined bones. Master Thesis, The University of Texas at Arlington.
34. A.S. Konashuk, D.O Samoilenko, A. Y Klyushin, G.I. Svirskiy, S. S. Sakhonenko, X.O. Brykalova, M.A. Kuz'mina, E.O Filatova, A.S. Vinogradov, A.A.Pavlychev Thermal changes in young and mature bone nanostructure probed with Ca 2p excitations // BIOMEDICAL PHYSICS & ENGINEERING EXPRESS, 2018. — Vol. 4, — P. 035031-1-8
35. Xenia O. Brykalova, Nikolai N. Kornilov, Alexander A. Cherny, Yuri A. Rykov, Andrey A. Pavlychev Electronic and atomic structure of subchondral femoral bone in intact and osteoarthritic knee compartments // Eur. Phys. J. D (2019) 73: 113. DOI: 10.1140/epjd/e2019-100114-8
36. A.S. Konashuk, X.O. Brykalova, N.N. Kornilov, E.O. Filatova, A.A. Pavlychev, Hierarchy-induced X-ray Linear Dichroism in Cortical Bone// Emergent Materials (2020) v. 3, n.4, 515-520, doi: 10.1007/s42247-020-00105-1
37 B. Hesse et al. Biomed. Opt. Express, 10(1) 18-28 (2019). DOI: 10.1364/BOE.10.000018
Изучение пространственно-временных изменений и их взаимосвязи с атомно-молекулярной архитектурой костной ткани предполагает (а) систематические экспериментальные, а именно: спектроскопические (в широком диапазоне длин волн), дифракционные и электрон-микроскопические исследования образцов костных тканей и (б) сравнительный анализ полученных данных с результатами модельных расчетов электронной структуры и атомной динамики костной ткани и с данными клинических исследований. Модельные расчеты будут проведены в рамках оригинальной 3DSL модели, учитывающей достижения как современных феноменологических представлений о взаимосвязи иерархической организации скелета с наноструктурой косной ткани, так и квантово-механических подходов к описанию распространения электронных волн в минеральном матриксе кости. В качестве образцов для проведения экспериментальных измерений будут использованы специально подобранные последовательности (1) костных тканей (специальным образом подготовленные спилы бедренной и большеберцовой кости при артропластике коленного сустава), соответствующие различным патологическим изменениям, разичной степени повреждения, порозности, а также (2) кортикальной кости крыс различного возраста. Особое внимание будет уделено изучению статистических особенностей взаимосвязи пространственно-временных изменений с атомно-молекулярной архитектурой, требующей детального исследования, пациент-зависимости характеристик наноструктуры костной ткани.
С точки зрения биомеханики Вольфа, согласно которой распределение механических напряжений, возникающих при выполнении локомоторных функций, определяет пространственную архитектуру кости, полученный результат является неожиданным. В работе авторов этого проекта высказано предположение, что не только биомеханика, но и биохимические (каталитические) процессы на межфазовых границах определяют особенности нано- и микроструктуры костной ткани. Анализ фотоэлектронных спектров (ФЭС) показал, что в отличии от интактной зоны, где регистрируется только апатитный кальций (100%), в зонах 2 и 3 наблюдается иные химические состояния кальция несвойственные минералу апатита. Вклад таких «неапатитных» состояний достигает максимума (88%) в зоне 3. Предположительно, появление «неапатитного» кальция обусловлено его химическим связыванием с анионами [CO_3]^{2-} и с фрагментами поврежденных молекул коллагена. Рентгенографические измерения показали, что степень кристалличности заметно меньше в зоне 3 чем в зонах 1 и 2 и подтвердили вывод о взаимосвязи биомеханических и биохимических реакций на межфазовой границе «коллаген – минерал». Анализ результатов указывает, что «неапатитные» состояния кальция формируются прежде всего в зонах, где объем области когерентного рассеяния рентгеновского излучения является наименьшим. (Б). Сопоставление характеристик атомно-молекулярной архитектуры костных тканей новорожденных, взрослых и зрелых здоровых крыс выявило отчетливую корреляцию изменений энергетических, стехиометрических и пространственных характеристик атомно-молекулярной архитектуры и упорядочения кристаллической решетки в костной ткани с возрастом. Энергии связи внутренних электронных оболочек всех атомов в кристаллите, степень кристалличности, и постоянная $с$ кристаллической ячейки гидроксилапатита имеют наименьшее значение в костях новорожденных крыс. С возрастом эти значения растут и приближаются к значениям свойственным минералу гидроксилапатита [5]. При этом появление «неапатитных» состояний кальция, свойственных артриту, не обнаружено. Анализ пространственно-временных изменений и атомно-молекулярной архитектуры, указывает на избыток отрицательного электрического заряда нанокристалитов (как в копланарных, так и мозаичных конгломератах) и, наоборот, положительного заряда в гидратных нанослоях, разделяющих кристаллиты. С возрастом происходит уменьшение электрического заряда. Эти результаты являются новыми. Они указывают на сложную природу межкристаллитных взаимодействий, их зависимость от электрического заряда кристаллитов, диэлектрической проницаемости межкристаллитной воды и высказать предположение о связи возрастных изменений костной ткани с электростатической энергией, аккумулированной в ее минеральном матриксе.
Представленные результаты демонстрируют отчетливую связь пространственно-временной организации скелета с атомно-молекулярной архитектурой костной ткани и применимость предлагаемых методов для установление общих закономерностей пространственно-временных изменений, получение количественных характеристик атомно-молекулярной архитектуры, особенностей зарядового распределения, выявление механизмов аккумуляции и диссипации электрической энергии в костной ткани. Полученные результаты откроют широкие перспективы для развития новых подходов к визуализации костной ткани на субклеточном уровне, её регенерации, а также к построению фундамента новых биотехнологий конструирования природоподобных и экологически чистых материалов для аккумуляции и хранения электрической энергии.
Общий план. Работа над проектом будет вестись в следующих взаимосвязанных направлениях:
-- изучение влияния (1) механических нагрузок; (2) возрастных и стехиометрических изменений на атомно-молекулярную архитектуру и особенности распределения электрического заряда и электростатической энергии в минеральном матриксе; (3) органической подсистем на минеральную;
-- обобщение экспериментальных, клинических и теоретических результатов;
-- выявление (1) общих закономерностей взаимосвязи пространственно-временных характеристик и атомно-молекулярной архитектуры и (2) механизмов, осуществляющих эту взаимосвязь в нано масштабе;
-- проведение систематического анализа всей совокупности результатов для разработки фундаментальных основ методов регенерации костной ткани и ее визуализации на субклеточном уровне,
-- всесторонняя проверка гипотезы о взаимосвязи возрастных изменений костной ткани с аккумуляцией электростатической энергии в ней и разработка фундаментальной основы биотехнологии конструирования природоподобных (остеомиметических) композитных материалов;
-- адаптация квантово-механических методов расчета электронной структуры костной ткани развитие методов симуляции пространственно-временных изменений атомно-молекулярной архитектуры костной ткани на основе 3DSL-модели.
-- представление полученных результатов на международных и российских конференциях междисциплинарной направленности и публикация результатов в высокорейтинговых журналах (индексируемых в Scopus, Web of Science, РИНЦ и других базах данных) междисциплинарной, материаловедческой, биомедицинской и биоинженерной направленности.
При реализации проекта будут использованы образцы костной ткани, получаемые и охарактеризованные при эндопротезировании коленного сустава в Национальном медицинском исследовательском центре травматологии и ортопедии (НМИЦ ТО) им. Вредена. Клинические исследования будут использованы для постановки точного медицинского диагноза и необходимости эндопротезирования. Клинические исследования будут проведены с использованием томографических, рентгенографических, гистологических, хронобиологических, рентгенологических и других методов. Пробоподготовка и консервация образцов для проведения экспериментальных исследований будет проводиться в НМИЦ ТО и, непосредственно перед измерениями, в Научном Парке СПбГУ. В качестве эталонных образцов для сопоставления с характеристиками минерализованной кости будут использованы фтор- и гидроксил апатиты с различным содержанием карбонат-ионов, а также моно- и дигидроортофосфат кальция. Синтез указанных соединений будет произведен при комнатной температуре химическим методом в СПбГУ.
В проекте в качестве основных экспериментальных методов исследования костной ткани будут использованы
(1) рентгенографические методы, которые позволят определить соотношение в костной ткани аморфной и кристаллических фаз, размеры области когерентного рассеяния, микронапряжения и параметры элементарной ячейки,
(2) спектроскопические (фото- и Оже-электронная спектроскопия, спектроскопия характеристических потерь, рентгеновская абсорбционная) и электронно-микроскопические методы, которые будут применены для изучения локальной электронной структуры костной ткани различной морфологии в различных зонах, для количественного описания её атомно-молекулярной архитектуры, особенностей химической связи; фото- и Оже-электронная спектроскопия позволит изучить особенности химической связи, электронную и атомную структуру на поверхности костной ткани; методы высокоразрешающей просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) с привлечением анализа дифракционных картин от различных костных тканей позволят детально охарактеризовать их наноструктуру: определить размеры пор и нанокристаллитов, а также особенности их ориентации и взаимного положения;
(3) методы ИК и рамановской спектроскопии позволят на полуколичественном уровне оцененить относительное содержание воды и карбонат-иона, для которого также будет сделано заключение о месте локализации в структуре апатита;
(4) энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDX) позволит получить сведения о вариациях элементного состава костной ткани;
(5) теоретические методы расчеты локальных структур костной ткани на разных уровнях с использованием оригинальной модель трехмерной сверхрешетки (3DSL); данная модель успешно апробирована для решения задач количественного описания электронной структуры костной ткани на субклеточном уровне; эта модель будет использоваться для моделирование атомно-молекулярной архитектуры и симуляции пространственно-временных изменений минерального матрикса с учетом его взаимодействия с коллагеновыми молекулами, особенностями зарядового распределения, аккумуляции электрической энергии в конгломератах костной ткани;
(6) методы анализа экспериментальных данных с использованием L*L*G подхода для нахождения спектроскопических характеристик из фотоэмиссионных спектров;
(7) методы рентгеновской абсорбционной (NEXAFS) спектроскопии; их использование в данном проекте носит факультативный характер; эти методы предполагается использовать для изучения линейного и кругового дихроизма фотопоглощения рентгеновского излучения в костной ткани, для изучения зависимости атомно-молекулярной архитектуры и упорядочения кристаллической решетки при рассогласовании вектора максимальной нагрузки и направления главной оси кости.
В результате выполнения междисциплинарного проекта будут получены принципиально новые фундаментальные результаты по структуре и свойствам костной ткани в организме человека и на этом примере созданы научные основы визуализации и характеризации самоорганизующейся иерархической материи.
