Данный проект ставит своей целью охарактеризовать эффект конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ) на протеом ризобактерий Rizobium leguminosarum в клеточной культуре или в качестве бактериального симбионта в корневых клубеньках растений гороха (Pisum sativum).
Для достижения данной цели, необходимо выполнить следующие задачи:
1. Синтезировать свободные гликированные аминокислоты. Основываясь на выполненных ранее исследованиях (см. раздел 4.11), будут синтезированы следующие конечные продукты глубокого гликирования: гидроимидазолон 1, образованный метилглиоксалем (MG-H1), Nδ-(карбоксиэтил)аргинин (CEA), Nε-(карбоксиметил)лизин (CML) и Nε-(карбоксиэтил)лизин (CEL). Для этого будут применены стандартные методы синтеза данных дериватов, известные из литературы и опыта руководителя проекта [1-3].
2. Синтезировать модельные пептиды, содержащие модифицированные остатки, соответствующие дериватам, использованным в рамках выполнения предыдущей задачи. Гликированные аминокислоты будут инкорпорированы в последовательность Ac-AFGSAХASGA-NH2 (где Х соответствует модифицированному остатку) с помощью пост-синтетического подхода, ранее использованного в модельных экспериментах руководителя проекта [3;4]. Для этого будет использован метод твердофазного пептидного синтеза с последующей селективной депротекцией целевых остатков и их модификацией на смоле, как описано в работах руководителя проекта [5]. Для контроля вхождения пептидов в клетки, в последовательность будет инкорпорирована флуоресцентная метка.
3. Провести инкубацию R. leguminosarum в присутствии гликированных аминокислот и пептидов в культуре клеток. Для этого будет использован штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae RCAM1026 (Российская Коллекция Сельскохозяйственных Микроорганизмов, НИИСХМ), используемый в данное время в работе руководителя проекта. КПГГ-модифицированные аминокислоты и белки будут добавлены в культуральную среду. После инкубации в течение 1 – 7 дней будет определена максимальная нетоксичная концентрация КПГГ. Выбор штамма позволит обсуждать результаты работы в свете итогов других проектов руководителя (в частности, РНФ 17-16-01042).
4. Изолировать тотальный бактериальный протеом из суспензии клеток R. leguminosarum. Для этого, клетки будут лизированы в присутствии кислотолабильного детергента, и, после определения содержания белка, полученный препарат будет подвергнут триптическому гидролизу, согласно протокола, оптимизированного к клеточным культурам [6]. Полученные гидролизаты будут очищены и разделены с помощью нанопоточной высоко-эффективной жидкостной хроматографии с квадруполь-времяпролетной детекцией в режиме онлайн. Идентификация пептидов и аннотация белков будут основаны на поиске против базы данных R. leguminosarum с использованием различных поисковых машин. Количественный анализ будет осуществлен без использования изотопной метки (label-free quantification).
5. Изучить влияние КПГГ-модифицированных аминокислот и пептидов на ризобиальный протеом клубеньков гороха посевного (Pisum sativum). Таким образом, влияние КПГГ на динамику протеома ризобий будет оценено непосредственно в составе активного симбиоза с растением. Для этого будет использована гидропонная культура, недавно освоенная в лаборатории руководителя проекта. Гликированные аминокислоты и пептиды будут добавлены в культуральную среду на четвертой неделе после прорастания растений. После 1 - 10 дней инкубации, клубеньки будут собраны, и тотальный белок будет изолирован методом фенольной экстракции с последующим глобальным протеомным анализом, как описано в предыдущих работах руководителя проекта [7]. При этом, изменения ризобиального протеома будут рассмотрены в функциональном аспекте и соотнесены с таковыми, наблюдаемыми в растительном протеоме.
Литература
1. Bergmann R, Helling R, Heichert C, Scheunemann M, Mading P, Wittrisch H, Johannsen B, and Henle T (2001) Nahrung 45:182-188.
2. Henle T, Walter AW, Haeßner R, and Klostermeyer H (1994) Z. Lebensm. Unters. Forsch. 199:55-58.
3. Schmidt R, Böhme D, Singer D, and Frolov A (2015) J. Mass Spectrom. 50:613-624.
4. Greifenhagen U, Nguyen VD, Moschner J, Giannis A, Frolov A, and Hoffmann R (2014) J. Proteome. Res. 14:768-777.
5. Greifenhagen U, Frolov A, and Hoffmann R (2015) Amino. Acids 47:1065-1076.
6. Gladilovich V, Greifenhagen U, Sukhodolov N, Selyutin A, Singer D, Thieme D, Majovsky P, Shirkin A, Hoehenwarter W, Bonitenko E, Podolskaya E, and Frolov A (2016) J. Chromatogr. A 1443:181-190.
7. Frolov A, Bilova T, Paudel G, Berger R, Balcke GU, Birkemeyer C, and Wessjohann LA (2016) J. Plant Physiol. 280:70-83.
