Трейсамины (trace amines, TA) как нейромедиаторы были известны давно, в то время как рецепторы к ним (trace amine-associated receptors, TAARs) были открыты только в 2001 году. TAARs играют роль в регуляции разных процессов: внимания, питания, движения, настроения. Известно, что изменения в системе TA и TAARs являются составной частью патогенеза целого ряда психических заболеваний, таких как шизофрения, депрессия, наркотическая зависимость и других. Однако еще очень многие функции TAARs остаются не изученными.
В последнее время появилось предположение, что TAARs могут играть роль в регулировании процесса нейрогенеза. Данные, полученные на TAAR5 нокаутных животных, подтверждают эту идею: отсутствие TAAR5 рецептора приводит к увеличению числа дофаминергических нейронов в черной субстанции среднего мозга, повышению уровня дофамина в стриатуме и ряду других эффектов, свидетельствующих об участии TAARs в регулировании нейрогенеза, в частности нейрогенеза дофаминергических нейронов.
Болезнь Паркинсона (БП) – это широко распространенное нейродегенеративное заболевание, при котором происходит гибель дофаминергических нейронов в черной субстанции среднего мозга. Существующие на данных момент варианты лечения БП обычно эффективны только в течение определенного времени, после которого дозы препаратов приходится увеличивать, а эффект от них снижается, кроме того они имеют целый ряд побочных эффектов. Одним из разрабатываемых в настоящий момент методов лечения БП является клеточная заместительная терапия, при которой дофаминергческие предшественники, полученные из плюрипотентных стволовых клеток вводят в стриатум с целью восстановления пула нейронов и повышения уровня дофамина. Разработано уже несколько вариантов эффективных протоколов дифференцировки, на лабораторных животных показана эффективность данного метода и уже начаты несколько клинических испытаний, но перед исследователями еще стоит целый ряд задач по снижению длительности протоколов дифференцировки и улучшению приживаемости трансплантата.
Проект посвящен изучению роли системы следовых аминов и их рецепторов в дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток человека в дофаминергические нейроны, и влияния данной системы на выживаемость, конечное созревание и эффективность интеграции в существующую нейрональную систему предшественников дофаминергических нейронов, при введении их в стриатум модельным животным. Проект имеет как фундаментальное значение, поскольку позволит расширить существующие представления о функции TAAR и их роли в нейрогенезе дофаминергических нейронов, так и прикладное значение в области высокотехнологичного здравоохранения, поскольку проект может внести вклад в развитие новых методов лечения БП.
В рамках выполнения первой запланированной на 2023 год задачи по разработке протоколов проточной цитометрии с использованием антител против маркеров дофаминергических нейронов, таких как тирозин гидроксилаза (tyrosine hydroxylase (TH)) и FOXA2, как и было запланировано был использован набор PerFix-nc-Kit (Beckman Coulter, кат. номер B10825), который позволяет проводить подготовку проб и окрашивание для последующего проведения проточной цитометрии без использования центрифугирования. Для анализа были использованы антитела анти-TH Alexa Fluor conjugated 594 (BioLegend, кат. номер 818003) и анти-FoxA2 Alexa Fluor conjugated 488 (R&D Systems, кат. номер IC2400G). Было выполнено одиночное и двойное окрашивание образцов на разных стадиях дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) человека в дофаминергические нейроны, а также сравнение данных проточной цитометрии, полученных при выполнении дифференцировки по протоколу, опубликованному Doi D. et al., 2014 [1], и по протоколу, опубликованному Nolbrant S. et al., 2017 [2], который в ходе второго года реализации проекта был выбран в качестве основного протокола.
В рамках выполнения второй задачи по разработке стандартизированных методов характеристики и анализа графтов, полученных после трансплантации дофаминергических прогениторов в стриатум лабораторных животных были выполнены операции по подсадке нейрональных прогениторов, полученных с использованием протокола дифференцировки иПСК человека в дофаминергические нейроны, который был выбран основным для реализации проекта. Операции были выполнены на мышах дикого типа, после операций животные в течение двух месяцев получали иммуносупрессивную терапию, через 2 месяца после трансплантаций выполнялась эвтанация, забор мозга и последующее гистологическое исследование с иммунофлюоресцентным окрашиванием с использованием антител против TH (Santa Cruz Biotechnology, кат. номер 14007) . В ходе работы было оценено, является ли эффективным и достаточным метод фиксации в виде инкубации полученного материала в растворе 4% параформальдегида (4% PFA) на PBS в течение ночи при комнатной температуре с последующем насыщением материала 30% сахарозой. Данный метод является предпочтительным, учитывая, что на следующий год реализации проекта запланированы операции на группах животных, а использование перфузии для фиксации материала более затратно по времени. Был выбран метод нарезки материала при помощи криостатирующего микротома. Учитывая количество получаемых срезов, для окраски был выбран метод плавающих срезов и с учетом этого была подобрана оптимальная толщина срезов 40 мкм, что позволяет сохранятся срезам без повреждения во время окраски и при этом выполнять подсчет отдельных клеток. В качестве метода визуализации был выбран метод иммунофлюоресцентной микроскопии, что в дальнейшем позволит использовать двойное мечение.
В ходе работы были оценены морфологические характеристики получаемых графтов и принято решение, что для оценки размера графта будут проанализованы все получаемые срезы, расположенные в пределах зоны трансплантации. Учитывая, что трансплантируемые клетки располагаются по ходу всего канала введения, было принято решение, что в рамках характеристики получаемого графта подсчет клеток будет осуществляться по-отдельности в пределах стриатума, мозолистого тела и коры, а также будет посчитано общее число клеток в графте и объем графта.
Автоматический анализ по подсчету клеток было решено не использовать на данном этапе выполнения проекта, поскольку весь объем получаемых графтов может быть оценен в пределах 10-15 срезов, а ручной подсчет позволяет более точно определить иммунопозитивные клетки.
В рамках выполнения третьей задачи по продолжению отработки протоколов для трансплантации в стриатум лабораторных животных нейрональных прогениторов, полученных при дифференцировке иПСК человека в дофаминергические нейроны была выполнена дифференцировка линии иПСК человека WTSli046-A по протоколу, который был выбран основным для данного проекта. На 16 день дифференцировки полученные клетки были сняты, часть клеток использована для трансплантации в стриатум мышам дикого типа, а часть заморожена в виалах по 4 млн клеток в каждой. Заморозка осуществлялась по протоколу описанному в Nolbrant S. et al., 2017. Для оценки выживаемости клеток, через 48 часов после заморозки они были разморожены и рассеяны на Geltrex в разведении 1:100 в среду, содержащую Neurobasal medium, L-glutamine (1x), Penicillin-Streptomycin (1x), B27 (1x) Ascorbic acid (0,2 мМ), dbc AMP (500 мкМ), GDNF (10 нг/мл), BDNF (20 нг/мл). Затем новые виалы криозамороженных клеток были использованы для трансплантации.
Трансплантация нейрональных прогениторов (без криозаморозки и после криозаморозки) была выполнена мышам дикого типа, в каждой группе было прооперировано по 3 животных. Клеточная суспензия готовилась непосредственно перед оперативным вмешательством: при работе с нейрональными прогениторами без использования криозаморозки клетки снимались с культуральных чашек при помощи TtypLE Select (ThermoFisher Scientific, кат. номер 12563011), производился подсчет клеток и их растворение в среде, содержащей Neurobasal medium, L-glutamine (1x), Penicillin-Streptomycin (1x), B27 (1x), Y27632 (10 мкМ). Далее клетки доставлялись в операционную с сохранением температурного режима (+37 оС), где проводилось центрифугирование суспензии клеток и последующее растворение осадка в HBSS, содержащем DNase (50 ед/мл), до концентрации 100 тыс. клеток/мкл. При работе с нейрональными прогениторами, которые прошли криозаморозку, виалы, содержащие 4 млн клеток каждая, доставлялись в операционную на сухом льду, после чего клетки размораживали по стандартному протоколу, и, как и в случае с незамороженными клетками, растворяли в HBSS, содержащем DNase (50 ед/мл), до концентрации 100 тыс. клеток/мкл. Полученная суспензия клеток находилась в операционной не более 3х часов, в промежутках времени, когда проводилась подготовка животных к вмешательству и проводилась разметка точки введения трансплантата, клеточная суспензия переносилась на +4 оС.
Операции были выполнены с использованием изофлюранового наркоза. Введение осуществлялось с помощью стереотаксической установки по координатам ML -1.3 AP 1.2 DV -3.5, объем введения 2 мкл со скоростью 1 мкл в минуту. Для введения был использован микроинъектор UMP3 -- UltraMicroPump III, что обеспечивает более надежную фиксацию шприца, а также снижает потери в количестве клеток. Начиная со дня операции все животные получали иммуносупрессивную терапию преднизолоном 2 мг/кг в сутки. Через 2 месяца после проведения трансплантаций была выполнена эвтаназия, забор мозга и последующее гистологическое исследование с иммунофлюоресцентным окрашиванием антителами к TH. Для каждого животного были подсчитаны все иммунопозитивные клетки во всех срезах, полученных в зоне трансплантации. Было выполнено сравнение результатов, полученных при трансплантации нейропрогениторов без и с криозаморозкой.
В рамках выполнения четвертой задачи по подбору последовательностей и наработке вирусных частиц, несущих короткие шпилечные РНК (shRNA) к TAAR2, TAAR5, TAAR9, для выбора последовательностей shRNA были использованы данные коллекции The RNAi Consortium (TRC) (Sigma-Aldrich) и выбраны shRNA к TAAR2, TAAR5, TAAR9. Для каждого гена были выбраны по 5 вариантов shRNA, что, как указывает производитель, гарантирует, что хотя бы один из этих вариантов позволит получить 70% уменьшение экспрессии гена интереса. Выбранные shRNA могут быть заказаны у производителя в виде готовых, стандартизированных лентивирусных частиц.
В рамках выполнения пятой задачи полученные результаты были представлены на VI Инновационном Петербургском медицинском форуме в рамках Симпозиума НЦМУ: Индуцированные плюрипотентные клетки для моделирования заболеваний человека. Помимо этого, материалы реализуемого проекта были использованы для написания диссертации на соискание звания кандидата биологических наук Католиковой Н. В., защита которой состоялась в июле 2023 года.
В дополнение к поставленным задачам также был продолжен анализ экспрессии TAARs на разных стадиях дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в дофаминергические нейроны, что было начато в первый и второй год реализации проекта. Были выбраны и проанализированы наборы, содержащие данные РНК секвенирования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека GSE80264 [3], GSE130829, GSE146701 [4], GSE134228 [5], иПСК человека, которые не были проанализированы в предыдущий год, E-ENAD-35, E-EMTAB-4748, а также данные РНК секвенирования Substatia nigra и Ventral tegmental area человека GSE166024 [6], GSE114918 [7].
1. Doi, D. et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Rep. 2014, 2, 337–350.
2. Nolbrant, S. et al.. Generation of high-purity human ventral midbrain dopaminergic progenitors for in vitro maturation and intracerebral transplantation. Nat. Protoc. 2017, 12, 1962–1979.
3. Dang, J.; Tiwari, S.K.; Lichinchi, G.; Qin, Y.; Patil, V.S.; Eroshkin, A.M.; Rana, T.M. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell 2016, 19, 258–265, doi:10.1016/j.stem.2016.04.014.
4. Fatima, M.; Ahmad, M.H.; Srivastav, S.; Rizvi, M.A.; Mondal, A.C. A Selective D2 Dopamine Receptor Agonist Alleviates Depression through Up-Regulation of Tyrosine Hydroxylase and Increased Neurogenesis in Hippocampus of the Prenatally Stressed Rats. Neurochemistry International 2020, 136, 104730, doi:10.1016/j.neuint.2020.104730.
5. Philippi, A.; Heller, S.; Costa, I.G.; Senée, V.; Breunig, M.; Li, Z.; Kwon, G.; Russell, R.; Illing, A.; Lin, Q.; et al. Mutations and Variants of ONECUT1 in Diabetes. Nat Med 2021, 27, 1928–1940, doi:10.1038/s41591-021-01502-7.
6. Monzón‐Sandoval, J.; Poggiolini, I.; Ilmer, T.; Wade‐Martins, R.; Webber, C.; Parkkinen, L. Human‐Specific Transcriptome of Ventral and Dorsal Midbrain Dopamine Neurons. Annals of Neurology 2020, 87, 853–868, doi:10.1002/ana.25719.
7. Aguila, J.; Cheng, S.; Kee, N.; Cao, M.; Wang, M.; Deng, Q.; Hedlund, E. Spatial RNA Sequencing Identifies Robust Markers of Vulnerable and Resistant Human Midbrain Dopamine Neurons and Their Expression in Parkinson’s Disease. Front. Mol. Neurosci. 2021, 14, 699562, doi:10.3389/fnmol.2021.699562.
В течение третьего года выполнения проекта был отработан протокол проточной цитометрии с использованием набора PerFix-nc-Kit (Beckman Coulter, кат. номер B10825) для оценки процента клеток, положительных по маркерам, специфичным для дофаминергических нейронов – TH и FOXA2. При помощи отработанного протокола было показано, что на 53 день дифференцировки по протоколу Doi D. et al., 2014 92,8% полученных клеток экспрессировали TH и только 14,1% экспрессировали FOXA2. При двойном окрашивании процент клеток, положительных по обоих маркерами был равен 14,1%, т.е. все клетки, которые экспрессировали FOXA2, также экспрессировали и TH. В тоже время на 53 день дифференцировки по протоколу Nolbrant S. et al., 2017, выбранному как основной для реализации проекта, 95,51% полученных клеток экспрессировали TH и 64% экспрессировали FOXA2. При двойном окрашивании, также как и в случае предыдущего протокола, все клетки, которые экспрессировали FOXA2, также экспрессировали TH. На 16 день дифференцировки по основному протоколу, на этапе, когда проводится криозаморозка, 92,64% клеток экспрессировали маркер FOXA2. Было также выполнено сравнение полученных данных с данными иммунофлюоресцентной микроскопии, однако в нашем распоряжении в настоящий момент имеются только антитела против TH, подходящие для данного метода, и сравнение полученных данных показало, что использование проточной цитометрии в значительной степени расширяет возможности характеристики получаемой клеточной культуры и позволяет количественно оценить эффективность проводимой дифференцировки. Полученные результаты показывают, что среди двух использованных протоколов дифференцировки иПСК человека в дофаминергические нейроны более эффективным оказался протокол, опубликованный в Nolbrant S. et al., 2017 и что использование данного протокола в качестве основного для дальнейшей реализации проекта обосновано.
В ходе разработки стандартизированных методов подсчета количества клеток и характеристики получаемых графтов были выполнены трансплантации нейрональных прогениторов в стриатум мышей дикого типа с последующим гистологическим исследованием. В результате оценки полученных данных для дальнейшей работы были выбраны следующие протоколы: а) в качестве основного метода фиксации выбрана инкубация полученного материала в растворе 4% параформальдегида (4% PFA) на PBS в течение ночи при комнатной температуре с последующем насыщением материала 30% сахарозой б) нарезка материала будет осуществляться при помощи криостатирующего микротома Leica CM-3050S в) для окраски будет использован метод плавающих срезов г) в работе будут использованы срезы толщиной 40 мкм д) визуализация будет выполнятся при помощи иммунофлюоресценции, что позволит использовать двойное мечение е) для оценки размера графта будут проанализированы все срезы, расположенные в пределах зоны введения нейропрогениторов ж) подсчет клеток будет осуществляться по-отдельности в пределах стриатума, мозолистого тела и коры. Так же будет посчитана общее число клеток в графте и объем графта. Автоматический подсчет клеток было решено не использовать на данном этапе выполнения проекта. Разработанный протокол окрашивания и оценки характеристик получаемых графтов будет использован в ходе дальнейших исследований, что позволит стандартизовано описывать результаты, получаемые при трансплантации нейропрогениторов в стриатум лабораторных животных, и проводить сравнение данных по группам.
В ходе отработки протоколов трансплантации дофаминергических прогениторов в стриатум лабораторных животных была выполнена дифференцировка линии иПСК человека WTSli046-A по протоколу, описанному Nolbrant S. et al., 2017. Часть клеток, полученных на 16 день дифференцировки, была сразу использована для трансплантации, часть была заморожена. Для криозаморозки клеток был отработан протокол, описанный в Nolbrant S. et al., 2017. Таким образом введение клеток в стриатум мышам дикого типа было выполнено в двух вариантах: 1) непосредственно на 16 день дифференцировки 2) после выполнения криозаморозки (разморозка клеток в данном случае осуществлялась непосредственно перед оперативным вмешательством). Объем введенной суспензии составлял 2 мкл, количество клеток на каждое введение составляло 200 тыс. клеток. После трансплантации животные получали иммуносупрессивную терапию преднизолоном в концентрации 2 мг/кг в сутки. Гистологическое исследование проводилось через 2 месяца после проведения трансплантаций. Для характеристики получаемых графтов было использовано иммунофлюоресцентное окрашивание с использованием анти-TH антител. На полученных срезах видно, что введенные клетки визуализируются в ткани головного мозга мыши. Основная масса клеток располагается по ходу канала введения в стриатуме, мозолистом теле и коре, кроме того часть иммунопозитивных клеток обнаруживается на некотором расстоянии от канала введения по ходу мозолистого тела. Одной из основных задач третьего года реализации проекта было сравнение эффективности трансплантации нейрональных прогениротов без и с проведением предшествующей криозаморозки. Для этого было подсчитано общее число иммунопозитивных клеток во всех срезах, полученных от каждого животного, и было показано, что клетки выживают при обоих вариантах введения, однако число клеток, трансплантированных без использования криозаморозки, превышает число выживших клеток, которые были трансплантированы после криоконсервации. На основании этих данных был сделан вывод, что для последующих трансплантаций будут использованы клетки после криозаморозки, поскольку это позволяет, во-первых, не проводить дифференцировку непосредственно перед трансплантациями, а, во-вторых, обеспечивает значительно большую стандартизацию качества вводимых нейрональных прогениторов, однако число вводимых клеток будет увеличено до 400 тыс. на одно введение.
В ходе подбора последовательностей и наработки вирусных частиц, несущих shRNA для последующего создания нокдаунов TAARs в линиях иПСК человека были использованы данные коллекции The RNAi Consortium (TRC) (Sigma-Aldrich) и выбраны shRNA к TAAR2, TAAR5, TAAR9. Для каждого гена были выбраны по 5 вариантов shRNA. Производитель гарантирует, что при работе с 5 разными shRNA хотя бы один из этих вариантов позволит получить 70% уменьшение экспрессии гена интереса. Указанные shRNA поставляются производителем в виде готовых, упакованных лентивирусных частиц, что обеспечивает быстроту и стандартизацию работы с ними.
Полученные результаты были представлены на VI Инновационном Петербургском медицинском форуме в рамках Симпозиума НЦМУ: Индуцированные плюрипотентные клетки для моделирования заболеваний человека. Помимо этого, материалы реализуемого проекта были использованы для написания диссертации на соискание звания кандидата биологический наук Католиковой Н. В., защита которой состоялась в июле 2023 года.
Дополнительным результатом третьего года выполнения проекта стали новые данные анализа экспрессии TAARs на разных стадиях дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека в дофаминергические нейроны, которые были получены при обработке наборов данных РНК секвенирования, выбранных из открытых источников. Анализ данных РНК секвенирования ЭСК человека показал, что в этих клетках не наблюдается экспресcии TAARs, в то время как данные, полученные из дополнительных наборов иПСК человека, показали, что в части линий может быть обнаружена экспрессия TAAR9, а также TAAR8, TAAR6, TAAR1 и TAAR2. Данные, полученные при анализе наборов РНК секвенирования частей среднего мозга человека показали, что в Substantia nigra и в Ventral tegmental area обнаруживается экспрессия TAAR5 и в несколько меньшей степени TAAR6, TAAR8, TAAR1 и TAAR9. Полученные данные дополняют предыдущие результаты, которые в целом свидетельствуют о том, что значимая экспрессия TAARs обнаруживается в пределах среднего мозга человека в зонах расположения дофаминергических нейронов (Substantia nigra и в Ventral tegmental area), в то время как в плюрипотентных клетках человека и на разных этапах их дифференцировки в дофаминергические нейроны уровни экспрессии TAARs крайне низки и имеют спорадический характер.
