ОТЧЕТ
О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
«Создание нового поколения вакцинных препаратов для птиц на основе
рекомбинантных антигенов и адъювантов – иммуностимуляторов»
(итоговый, этап 3)
При выполнении 3 этапа НИР необходимо было решить следующие задачи:
1. Оценить влияние копийности экспрессионной кассеты на уровень синтеза целевого белка.
2. Исследовать влияние модифицированной последовательности альфа-фактора на уровень секреции целевых рекомбинантных белков.
3. Получить штаммы E. coli - продуцентыв белков вируса инфекционной бурсальной болезни.
4. Подготовить образцы полноразмерного белка VP2, его фрагментов для оценки их иммуногенности
5. Определить сайты встраивания структурного гена куриного гамма-интеферона и структуру вставки у трансгенной люцерны. Оценить присутствие трансгена и уровень его экспрессии у трансгенной люцерны поколения Т1.
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ КОПИЙНОСТИ ЭКСПРЕССИОННОЙ КАССЕТЫ НА УРОВЕНЬ СИНТЕЗА ЦЕЛЕВОГО БЕЛКА ДРОЖЖАМИ-ПРОДУЦЕНТАМИ
Развитие современных биотехнологий открывает широкие возможности получения новых, более эффективных и дешевых в производстве типов вакцин для птицеводства. Одним из основных направлений исследований при этом является разработка субъединичных вакцин на основе рекомбинантных белков. Для увеличения продукции рекомбинантных белков в дрожжах P. pastoris можно использовать разные подходы, в том числе, создание штаммов с множественными копиями экспрессионных кассет [18]
Одним из способов получения многокопийных штаммов является последовательная трансформация дрожжей несколькими экспрессионными плазмидами с разными селективными маркерами. Количество копий в этом случае может быть ограничено количеством доступных маркеров селекции. Наиболее распространенными селективными маркерами для P. pastoris являются ауксотрофный маркер his4 и маркеры устойчивости к антибиотикам зеоцину (ZeoR), генетицину/канамицину (KanR) и бластицидину.
Существенной проблемой получения и использования штаммов с несколькими копиями экспрессионной кассеты является их генетическая нестабильность. Потеря копий может быть связана с рекомбинацией между гомологичными участками тандемных повторов экспрессионных кассет, расположенных в одном локусе. На стабильность таких штаммов также влияет количество копий целевого гена и уровень продукции рекомбинантного белка. Повышение количества рекомбинантного белка сопровождается увеличением метаболической нагрузки для продуцента и, в итоге, может приводить к потере копий гетерологичных генов. Поэтому штаммы-продуценты, которые содержат от 1 до 6 копий целевого гена, как правило, оказываются более стабильными в течение длительного времени [19].
Для выяснения возможности получения штаммов дрожжей с множественными встройками целевого гена и оценки стабильности этих штаммов необходимо было на первом этапе получить набор экспрессионных плазмид с разными селективными маркерами: ZeoR, HIS4, KanR. В качестве модельного гетерологичного белка использовали белок Neo-2/15, который является агонистом рецептора к ИЛ-2. Neo 2/15 избирательно связывается с гетеродимером βγc рецептора ИЛ-2 (IL-2Rβγc), но не имеет сайта связывания с IL-2Rα (известным как CD25) или IL-15Rα (также известным как CD215). Neo-2/15 рассматривается в качестве замены препаратам ИЛ-2 при терапии некоторых типов опухолей [20].
1.1. Получение плазмиды pPIC9-Neo
Для получения плазмиды pPIC9-Neo, несущей ген HIS4 в качестве селективного маркера, плазмиду pPICZα-Neo гидролизовали по сайтам рестрикции SacI и AsiGI (AgeI) и выделяли фрагмент 1427 п.о, содержащий PAOX1, терминаторную области, ген Neo-2/15, α-фактор дрожжей S. cerevisiae, с-myc эпитоп и 6хHIS tag. Этот фрагмент лигировали с плазмидой pPIC9, обработанной теми же рестриктазами для получения плазмиды pPIC9-Neo. Лигазной смесью трансформировали клетки E. coli, на среде с ампициллином проводили отбор трансформантов, из которых выделяли плазмидную ДНК.
Структуру полученной плазмиды pPIC9-Neo проверяли при помощи рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз рестрикции PmeI и SalI и ПЦР с праймерами к 5’AOX1 и 3’AOX1.
Результаты проверки подтверждают, что структура плазмиды pPIC9- Neo соответствует теоретически ожидаемой.
1.2. Получение штаммов P. pastoris, синтезирующих белок Neo-2/15
При трансформации дрожжей линеаризованной плазмидой pPIC9-Neo может быть получено 3 варианта трансформантов, содержащих экспрессионную кассету в разных локусах. При трансформации плазмидой, гидролизованной рестриктазой BglII, происходит интеграция кассеты экспрессии в локус AOX1 дрожжей P. pastoris с замещением гена алкогольоксидазы 1. В этом случае получаются трансформанты MutS (methanol utilization slow), у которых при индукции промотора AOX1 метанолом происходит только синтез рекомбинантного белка, и ресурсы клетки не тратятся на синтез алкогольоксидазы 1. Поэтому, как правило, MutS штаммы эффективнее синтезируют рекомбинантные белки.
Линейный фрагмент, полученный при гидролизе плазмиды pPIC9-Neo по сайту SacI, встраивается также в локус АОХ1, но при этом не происходит замещения гена АОХ. При гидролизе плазмиды pPIC9-Neo рестриктазой Stu1 получается линейный фрагмент, который встраивается в локус HIS4. Последние два варианта трансформантов сохраняют активность алкогольоксидазы 1 и имеют фенотип Mut+.
Полученными линейными фрагментами плазмиды pPIC9-Neo трансформировали штамм дрожжей P. pastoris GS115, ауксотрофный по гистидину [21]. Отбор трансформантов проводили на минимальной среде без гистидина.
У полученных трансформантов выделяли хромосомную ДНК [22] и проверяли наличие экспрессионной кассеты с помощью ПЦР с праймерами к α-MF и 3’AOX.
Появление фрагмента ДНК около 540 п.о. свидетельствовало о наличии экспрессионной кассеты в геноме проверенных трансформантов GS115/pPIC9-Neo (BglII) и GS115/pPIC9-Neo (SacI).
1.3. Анализ секреции белка Neo-2/15 у штамма GS115/pPIC9-Neo (SacI)
Штамм GS115/pPIC9-Neo (SacI). культивировали в среде BMGY (1% глицерина, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 0,4 г CaCl2, 10 г дрожжевого экстракта, 2 г сульфата аммония, 0,4 мг биотина, 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 6,0 на л) при 30С на качалке с перемешиванием (200-220 об/мин) в течение 24 часов. Затем стерильно собирали клетки центрифугированием при 6-7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4С и ресуспендировали их в среде BMМ, которая в отличие от среды BMGY в качестве источника углерода содержит 0,5% метанола. При смене источника углерода происходила активация промотора гена АОХ1 и индукция синтеза целевого белка. Культивирование на стадии индукции проводили при 20С в течение 72 часов. По окончании культивирования клетки собирали центрифугированием при 6-7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4С. Надосадочную жидкость концентрировали ультрафильтрацией на установке УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0.3-10ПС, (НПК «Биотест», Кириши), отсекающей соединения с молекулярной массой менее 10 кДа. Далее проводили электрофоретическое разделение белков культуральной жидкости в градиентном полиакриламидном геле 8-16% Novex (Thermo Fisher Scientific, США) в присутствии ДСН. В качестве контроля использовали культуральную жидкость исходного штамма GS115 дрожжей P. pastoris, не несущего рекомбинантных генов, выращенного в тех же условиях. Далее белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану и обрабатывали антителами [23]. Использовали первичные антитела мыши к c-myc эпитопу (Helicon, Россия) и вторичные антитела кролика к антителам мыши, меченые пероксидазой (SigmaAldrich, Германия). Результаты электрофоретического разделения белков культуральной жидкости штамма GS115/pPIC9-Neo (SacI). и вестерн-блот гибридизации с антителами к c-myc эпитопу показали, что полученный штамм дрожжей P. pastoris GS115/pPIC9-Neo (SacI), синтезирует и секретирует белок Neo-2/15.
1.4. Анализ секреции белка Neo-2/15 у штаммов GS115/pPIC9-Neo (BglII)
Культивирование двух трансформантов GS115/pPIC9-Neo (BglII) (№7 и №9) и электрофоретический анализ белков культуральной жидкости проводили в условиях, приведенных в разделе 1.3 для штамма GS115/pPIC9-Neo (SacI). Результаты электрофоретического разделения белков, а также денситограмма говорят о том, что уровень продукции рекомбинантного белка у трансформанта 9-GS115/pPIC9-Neo (BglII) значительно выше, чем у трансформанта 7-GS115/pPIC9-Neo (BglII)
Одной из причин повышенного уровня продукции рекомбинантного белка может быть большее количество копий экспрессионной кассеты у трансформанта 9-GS115/pPIC9-Neo (BglII). При помощи метода ПЦР в режиме реального времени определили число копий гена Neo-2/15 у этих трансформантов. Полученные результаты показали, что трансформант 9- GS115/pPIC9-Neo (BglII) действительно содержит в 3 раза больше экспрессионных кассет, чем трансформант 7-GS115/pPIC9-Neo (BglII).
Таким образом, полученные штаммы GS115/pPIC9-Neo (BglII), как и штаммы GS115/pPIC9-Neo (SacI), синтезируют и секретируют белок Neo-2/15. При этом увеличение копийности гена Neo-2/15 приводит к увеличению продукции соответствующего белка. Поэтому следующим этапом работы стало получение штаммов-продуцентов с множественными копиями гена белка Neo-2/15.
1.5. Получение штаммов дрожжей P. pastoris, содержащих несколько экспрессионных кассет
Для получения таких штаммов проводили последовательную трансформацию клеток плазмидами с разными маркерами, несущими целевой ген. В работе использовали полученные ранее плазмиды pPIC9-Neo (с маркером HIS4), pPICZa-Neo (с маркером устойчивости к зеоцину) и pPICKan-Neo (с маркером устойчивости к канамицину/генетицину), которая была получена на предыдущем этапе выполнения проекта.
Штаммы P. pastoris GS115/pPIC9-Neo (SacI) - Mut+ и 9-GS115/pPIC9-Neo (BglII)-Х3 - Muts, несущие кассеты экспрессии гена Neo-2/15 в локусе AOX1, последовательно трансформировали плазмидами pPICZa-Neo и pPICKan-Neo, линеаризованными по сайту SacI.
Для оценки количества копий экспрессионной кассеты с геном Neo-2/15 с помощью количественной ПЦР было отобрано 10 штаммов P. pastoris. Количество целевого гена Neo-2/15 нормализовали с использованием референсного гена ACT1. Полученные значения сопоставляли со штаммом 7-GS115/pPIC9-Neo (BglII). Результаты ПЦР-РВ показали, что проанализированные штаммы содержат разное количество копий Neo-2/15.
1.6. Оценка стабильности множественных копий гена Neo-2/15 у штаммов P. pastoris
Для оценки стабильности множественных копий гена Neo-2/15 были выбраны Mut+ штаммы GS115/S/H-Neo (GS115/pPIC9-Neo-SacI), GS115/SS/HK-Neo-X2 (GS115/ pPIC9-Neo- SacI+pPICKan-Neo-SacI) и GS115/SSS/HKZ-Neo-X3 (GS115/ pPIC9-Neo-SacI +pPICKan-Neo-SacI +pPICZ-Neo-SacI), несущие соответственно 1, 2, 3 копии целевого гена в локусе AOX1. Штаммы засевали в среду BMGY с глицерином как источником углерода и культивировали в течение 24 часов. Далее клетки переносили в среду BMMY с метанолом в качестве источника углерода и проводили индукцию в течение недели. Перед индукцией, через 72 часа и 168 часов индукции метанолом готовили разведения культур и отсевали клетки на твердую полную среду для последующего анализа. Выросшие клоны культивировали на селективных средах (минимальной и содержащих антибиотики - зеоцин и генетицин). Затем анализировали рост на чашках с селективной средой.
Полученные результаты говорят о том, что штамм GS115/SS/HK-Neo-X2, несущий две копии экспрессионной кассеты в одном локусе АОХ1, стабильно сохраняет их в течение 168 часов индукции экспрессии целевого гена и синтеза рекомбинантного белка. Штамм GS115/SSS/HKZ-Neo-X3 с тремя копиями экспрессионной кассеты в одном локусе АОХ1 менее стабилен. После 72 часов индукции три клона GS115/SSS/HKZ-Neo-X3 из проанализированных 131 потеряли по одной копии экспрессионной кассеты, о чем свидетельствует неспособность расти на минимальной среде Md или на среде с генетицином. После 168 часов индукции два клона из 162 также потеряли по одной копии экспрессионной кассеты и способность расти на среде Md или на среде с генетицином.
Можно предположить, что при интеграции в один локус две копии экспрессионной кассеты могут стабильно поддерживаться в течение длительного времени культивирования штаммов-продуцентов. Исходя из того, что уровень продукции целевого белка повышается при увеличении количества копий клонированного гена, штаммы даже с двумя копиями гетерологичного гена будут более эффективными продуцентами целевого белка.

2. ВЛИЯНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АЛЬФА-ФАКТОРА НА УРОВЕНЬ СЕКРЕЦИИ ЦЕЛЕВЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ
2.1. Получение плазмид pPICZ-PHO1 и pPICZalphaMF-PHO1
Секреция гетерологичных белков значительно упрощает процедуру их выделения и очистки, а также способствует снижению метаболической нагрузки на клетки штамма-продуцента. В качестве сигнала секреции у P. pastoris чаще всего используется сигнальная последовательность альфа-фактора S. cerevisiae. Эффективность секреции разных белков сильно варьирует. Одной из возможных причин наблюдаемых различий в уровне секреции может быть частичное экранирование сигнальной последовательности при формировании третичной структуры гетерологичного белка. Для решения этой проблемы можно использовать другие сигнальные последовательности или модифицированные варианты последовательности α-фактора [24, 25].
Ранее было показано, что повышения эффективности секреции рекомбинантных белков удается добиться за счет делеции определенного участка в последовательности, кодирующей сигнальный пептид альфа-фактора. Для оценки эффективности работы модифицированных сигналов секреции использовали репортерный белок Pho1- кислую фосфатазу дрожжей P. pastoris.
Сначала получили плазмиду pPICZ-PHO1, которая содержала ген РНО1 с собственной сигнальной последовательностью. При помощи ПЦР на матрице хромосомной ДНК штамма X-33 дрожжей P. pastoris амплифицировали нужный фрагмент ДНК, который обрабатывали рестриктазами AgeI и BstBI. Далее плазмиду pPICZα гидролизовали рестриктазами AgeI и BstBI для удаления сигнальной последовательности альфа-фактора и встраивали в нее фрагмент гена PHO1, обработанный теми же рестриктазами.
Параллельно получали плазмиду pPICZalphaMF-PHO1, в которой вместо нативного сигнал секреции Pho1 присутствовала последовательность альфа-фактора. Для этого фрагмент ДНК, включающий часть структурного гена PHO1 без собственной сигнальной последовательности амплифицировали при помощи ПЦР на матрице хромосомной ДНК штамма X-33 дрожжей P. pastoris. Затем этот фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами AgeI и XhoI и лигировали с плазмидой pPICZα, обработанной теми же рестриктазами.
Полученными лигазными смесями трансформировали клетки E. coli. Анализ плазмидных ДНК pPICZ-PHO1 и pPICZalphaMF-PHO1, выделенных из бактериальных трансформантов, проводили с помощью ПЦР и рестрикционного анализа.
Результаты рестрикционного анализа и ПЦР подтвердили соответствие структуры плазмид pPICZαMF-PHO1 и pPICZ-PHO1.теоретически ожидаемым.
2.2. Сравнение секреции кислой фосфатазы P. pastoris при использовании нативного сигнала секреции и альфа-фактора дрожжей S. cerevisiae
Плазмидами pPICZ-PHO1 и pPICZαMF-PHO1, линеаризованными по сайту рестрикции Sac1, трансформировали штамм Х-33 дрожжей P. pastoris. Трансформанты, отобранные на среде с зеоцином пересевали на среды с глюкозой или метанолом в качестве источника углерода. Результаты качественного определения активности кислой фосфатазы показали, что оба варианта плазмиды с разными сигналами секреции обеспечивают эффективную секрецию кислой фосфатазы, о чем свидетельствует окрашивание колоний на среде с метанолом – индуктором экспрессии промотора АОХ1.
2.3. Получение штамма дрожжей P. pastoris с плазмидой, содержашей модифицированную последовательность альфа-фактора
На предыдущем этапе выполнения проекта при помощи сайт-направленного мутагенеза были получены делеционные варианты альфа-фактора, которые встраивали в плазмиду рPICZα. Проверка полученной плазмиды pPICZαС-Δ57-70α с помощью метода ПЦР и секвенирования доказала наличие искомой делеции в сигнале секреции альфа-фактора.
Таким образом, на данном этапе работы получены плазмиды с дополнительными селективными маркерами и плазмиды с модифицированным сигналом секреции гетерологичных белков. Использование этих плазмид для клонирования чужеродных генов будет способствовать получению более эффективных штаммов продуцентов целевых белков.

3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ E. COLI - ПРОДУЦЕНТОВ БЕЛКОВ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БУРСАЛЬНОЙ БОЛЕЗНИ
3.1. Оценка продукции мимотопа дрожжами P. pastoris
Известно, что при гетерологичном синтезе аутентичного антигена или его фрагментов могут возникнуть сложности, обусловленные особенностями аминокислотной последовательности или пространственной структуры интересующего белка. Одним из решений возникающих проблем может быть использование мимотопов – небольших пептидов, которые имитируют нативные эпитопы, способны индуцировать требуемые специфические антитела и могут быть использованы в качестве вакцин. Поиск конкретных мимотопов стал возможен благодаря развитию технологии фагового дисплея для скрининга пептидных библиотек [26].
На предыдущем этапе выполнения проекта мы использовали нуклеотидную последовательность мимотопов F1-F7-B34-2B1-2G8, которая обеспечивала синтез белка EPIS в бактериальных клетках [27] и заменили некоторые кодоны аминокислот синонимическими, наиболее часто используемыми дрожжами (https://www.genscript.com/tools/gensmart-codon-optimization/).
Полученная нуклеотидная последовательность была клонирована в составе плазмиды pPICZα по сайтам XhoI/XbaI:
CTCGAGAAG AGA ATG CCG AAG ACG CAT AAT AGT GGA CGG TCA AAC GTG GAC GGC GGC GGC TCC ACC TTA CAC CTA CCC CAC TTG TGG CGC CCA CTC TCA GGA GGA GGG TCT CAC AAC GCA AAA TAT GTA TCC GCT GAG TCG TGG GGA GGA GGG AGC CAT CCC GAC AGT ATT CAC CCT TTT CTC GCG TCT CCG GGT GGC GGT AGC GAT ACA CTG CAT GGG CAT GGG TTC ACT AAT TGG TTT GGT GGT GGC TCT CTA GA
Структура полученной плазмиды pPICZα/5EPIS была подтверждена секвенированием.
Полученной плазмидой pPICZα/5EPIS трансформировали штамм GS115 дрожжей P. pastoris методом электропорации [21]. Трансформантов отбирали за счёт появления у них устойчивости к антибиотику зеоцину. Несмотря на наличие сигнала секреции не удалось обнаружить мимотоп в культуральной жидкости. Дальнейший анализ показал, что мимотоп синтезируется штаммом-продуцентом, но в очень малом количестве, и весь белок остается внутри клеток.
Основываясь на данных об успешной продукции мимотопа в клетках E. coli [27], поставили задачу сравнить возможности бактериальной и дрожжевой системы экспрессии.
3.2. Получение штаммов E. coli - продуцентов полноразмерного белка VP2 и M фрагмента вируса ИББ
На предыдущих этапах выполнения проекта нами были получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие и секретирующие полноразмерный белка VP2 и его центральную область (M фрагмента) [28]. Поэтому для полноценного сравнения эффективности двух систем экспрессии сначала получили штаммы E. coli – продуценты полноразмерного белка VP2 и M фрагмента.
На первом этапе работы были получены плазмиды pET23a-VP2 и pET23a-MVP2, содержащие полноразмерную последовательность гена белка VP2 и использованную нами ранее последовательность М фрагмента [28].
Полноразмерная последовательность гена VP2 была амплифицирована с помощью метода ПЦР с праймерами к 5’ и 3’концам гена VP2. В качестве матрицы использовали плазмиду pPICZα-VP2, полученную ранее. Полученный фрагмент обрабатывали последовательно рестриктазами AspA2I (AvrII) и Sfr274I (XhoI). Плазмиду pET23a обрабатывали рестриктазами AsuNHI (NheI) и Sfr274I (XhoI), а затем проводили дефосфорилирование 5’-концов. После проведения электрофореза полученные фрагменты очищали из агарозного геля и лигировали.
Последовательность, соответствующая М фрагменту гена VP2, была амплифицирована с помощью метода ПЦР с праймерами к 5’ и 3’ концам, последовательности, кодирующей M фрагмент белка VP2. качестве матрицы использовали плазмиду pPICZα-VP2. Полученный фрагмент обрабатывали последовательно рестриктазами FauNDI (NdeI) и Sfr274I (XhoI). Плазмиду pET23a обрабатывали рестриктазами FauNDI (NdeI) и Sfr274I (XhoI), а затем проводили дефосфорилирование 5’-концов. После проведения электрофореза полученные фрагменты очищали из агарозного геля и лигировали.
Лигазными смесями трансформировали клетки штамма E. coli DH5alpha и отбирали трансформантов на среде с ампициллином. Из клеток полученных трансформантов выделяли плазмидную ДНК и проверяли ее с помощью метода ПЦР и рестрикционного анализа. Таким образом, была получена плазмида pET23a-VP2, содержащая полноразмерную последовательность гена VP2, а также плазмида pET23a-MVP2 содержащая последовательность его М фрагмента.
Последовательности гена VP2 и его М фрагмента находятся под контролем промотора полимеразы Т7. Поэтому плазмидами рET23a-VP2 и pET23a-MVP2 трансформировали клетки штамма E. coli BL21(DE3)pLysS. Данный штамм содержит кассету экспрессии, обеспечивающую регулируемый синтез РНК-полимеразы Т7, которая в свою очередь обеспечивает транскрипцию последовательностей гена VP2 и его М-фрагмента в составе плазмид экспрессионных плазмид.
Для анализа синтеза рекомбинантных белков полученных трансформантов культивировали в 20 мл жидкой среды LB (1% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, 170 мМ NaCl) с добавлением ампициллина в течение 12 часов при 37°С. Для индукции синтеза белка в среду добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 100 мМ и культивировали еще 12 часов при 30°С. В контрольные пробы ИПТГ не добавляли. Для выделения внутриклеточных белков клетки бактерий из 1 мл культуры собирали центрифугированием. Отбирали среду и разводили клетки в 300 мкл буфера для лизиса (100 мМ NaH2PO4, 10 мМ Трис-HCl, 8М мочевина, рН 8.0). В пробы добавляли 0,3 г стеклянных шариков (d=0,5 мм) и перемешивали их на вортексе в течение 10 мин. После центрифугирования отбирали надосадочную жидкость и анализировали в ней внутриклеточные белки с помощью электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.
Полученные результаты свидетельствуют, что полученные на основе штамма E. coli BL21(DE3)pLysS бактериальные трансформанты синтезируют рекомбинантные белки ожидаемого размера (48 кДа для полноразмерного белка VP2 и 15 кДа для М фрагмента).
В настоящее время проводится работа по клонированию последовательности, кодирующей мимотоп, в бактериальных экспрессионных плазмидах и получению бактерий-продуцентов этого белка.
Дальнейшее сравнение эффективности синтеза белков вируса ИББ с использованием разных организмов-продуцентов позволит выбрать наиболее перспективную систему для получения целевых белков.

4.ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦОВ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛНОРАЗМЕРНОГО БЕЛКА VP2 И ЕГО ФРАГМЕНТОВ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИХ ИММУНОГЕННОСТИ
Штаммы дрожжей P. pastoris-продуценты полноразмерного белка VP2 и его фрагментов выращивали в среде BMGY (1% глицерина, 1 г KH2PO4, 0,5 г MgSO4·7H2O, 0,4 г CaCl2, 10 г дрожжевого экстракта, 2 г (NH4)2SO4, 0,4 мг биотина, 50 мМ калий-фосфатный буфер рН 6,0 на л) при 30°С на качалке с перемешиванием (200-220 об/мин) в течение 48 часов. Затем стерильно собирали клетки центрифугированием при 6–7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4°С и ресуспендировали их в среде BMМ, которая в отличие от среды BMGY в качестве источника углерода содержит 0,5% метанола. При смене источника углерода происходила активация промотора гена АОХ1 и индукция синтеза целевого белка. Культивирование на стадии индукции проводили при 20°С в течение 72 часов.
После окончания культивирования клетки дрожжей собирали центрифугированием при 6–7 тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4°С. Надосадочную жидкость, которую использовали в качестве источника целевых белков, пропускали через ультрафильтрационную установку УПЛ-0,6 с использованием мембраны АР-0,2-10ПА (НПК «Биотест», Кириши). В результате этой процедуры происходит удаление низкомолекулярных компонентов культуральной среды с молекулярной массой менее 10 кДа и концентрирование целевых белков.
Для получения полноразмерного белка VP2 и его фрагментов из клеток E. coli бактериальные штаммы-продуценты выращивали в условиях, приведенных в разделе 3.2 за исключением того, что штаммы культивировали в 1 л среды. Разрушение клеток бактерий также проводили способом, приведенным в разделе 3.2. После разрушения клеток и центрифугирования отбирали надосадочную жидкость, из которой получали белки осаждением 80% раствором сульфата аммония. После центрифугирования при тыс. об/мин в течение 15 минут, при +4°С осадок растворяли в буфере PBS (NaCl 137 мМ, KCl 2,7 мМ, Na2HPO4 10 мМ, KH2PO4 1,76 мМ, pH 7,4) и диализовали против этого же буфера.
На всех этапах выделения целевых белков контролировали их присутствие при помощи электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН. Далее проводили стерилизацию концентрата культуральной жидкости дрожжей-продуцентов или препаратов белков бактериальных продуцентов, пропуская образцы через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. В настоящее время подготовлены образцы, содержащие фрагменты белка VP2 и М фрагмента, синтезированные бактериями и дрожжами, а также продолжается работа по разработке схемы частичной очистки рекомбинантных целевых белков бактериального происхождения.
Дальнейшее сравнение уровня синтеза белков вируса ИББ и их иммуногенности в зависимости от используемых организмов-продуцентов позволит выбрать наиболее эффективную систему для получения субъединичных вакцин.
На предыдущем этапе выполнения проекта было показано, что полноразмерный белок VP2, синтезированный и секретируемый дрожжами, стимулирует синтез нейтрализующих антител [29]. М фрагмент белка VP2, также синтезированный и секретируемый дрожжами, реагирует с сывороткой, содержащей антитела, специфичные к белкам вируса ИББ. Это дает основание полагать, что полученные рекомбинантные белки можно будет использовать для создания тест-системы для ИФА и вакцинации птиц.
Таким образом, в результате выполнения проекта нами получены разные организмы-продуценты рекомбинантного белка VP2 вируса ИББ и его фрагментов (таблица 1).
Таблица 1
Организмы-продуценты рекомбинантного белка VP2 вируса ИББ и его фрагментов
№Организм-
продуцент Генотип штамма Синтезируемый белок
1 Р. pastoris Paox1-VP2 внутриклеточный VP2
2 Р. pastoris Paox1-VP2-c-myc/His-tag внутриклеточный VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
3 Р. pastoris Paox1-VP2- His-tag внутриклеточный VP2 с гистидиновой меткой
4 Р. pastoris Paox1-VP2 секреторный VP2
5 Р. pastoris Paox1-VP2-c-myc/His-tag секреторнй VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
6 Р. pastoris Paox1-NVP2-c-myc/His-tag ZeoR секреторн. N фрагмент VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
7 Р. pastoris Paox1-MVP2-c-myc/His-tag ZeoR секреторн. M фрагмент VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
8 Р. pastoris Paox1-NVP2-c-myc/His-tag ZeoR his4 секреторн. N фрагмент VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
9 Р. pastoris Paox1-MVP2-c-myc/His-tag ZeoR his4секреторный M фрагмент VP2 с c-myc эпитопом и гистидиновой меткой
10 *E. coliP T7-VP2 внутриклеточный VP2
11 *E. coliP T7-MVP2 внутриклеточный M фрагмент VP2 (613–757)
* Штаммы-продуценты, полученные при выполнении 3 этапа проекта.

5.ОПРЕДЕЛЕНИЕ САЙТОВ ВСТРАИВАНИЯ СТРУКТУРНОГО ГЕНА КУРИНОГО ГАММА-ИФН И СТРУКТУРА ВСТАВОК У ТРАНСГЕННОЙ ЛЮЦЕРНЫ. ПРОВЕРКА ПРИСУТСТВИЯ ТРАНСГЕНА И УРОВЕНЬ ЕГО ЭКСПРЕССИИ У ТРАНСГЕННОЙ ЛЮЦЕРНЫ ПОКОЛЕНИЯ Т1
Применение растительных систем в качестве продуцентов разнообразных веществ фармацевтической промышленности является одним из актуальных направлений современной биотехнологии и метаболической инженерии, направленной на реализацию трансгенной клеткой новых биохимических реакций. Высшие растения как автотрофные организмы отличаются быстрым ростом и накоплением биомассы при минимальных энергетических затратах, что может обеспечить низкую себестоимость и значительный выход целевого белка. Важным преимуществом растительных систем экспрессии является возможность не только получать целевой гетерологичный белок в очищенном виде, но и употреблять растение-продуцент целиком, вместе с синтезированным им продуктом.
Подобная практика позволяет снизить затраты на выделение и очистку белка. Более того, растительных тканях гетерологичные белки могут длительное время сохраняться без каких-либо изменений и снижения биологической активности. Пероральное применение подобных растений позволяет обеспечить пролонгированное действие препарата, поскольку наличие целлюлозной клеточной стенки создает своеобразную естественную капсулу, постепенное разрушение которой в пищеварительном тракте животного обеспечивает длительное воздействие гетерологичного белка на слизистые оболочки [30].
На предыдущих этапах выполнения проекта впервые была получена трансгенная люцерна с нативным геном куриного гамма-ИФН. Выход целевого рекомбинантного белка зависит от его стабильности. Ранее нами было показано, что для повышения устойчивости куриного гамма-ИФН к протеолитической деградации необходимо удалить сайты расщепления трипсиноподобными протеазами, находящимися в С-концевой части молекулы белка. Модифицированные варианты гамма-ИФН, синтезированные в клетках дрожжей P. pastoris, обладали большей стабильностью и сохраняли биологическую активность [31]
В 2021 г. нуклеотидные последовательности, кодирующие нативный (ggIFNGnat) и два модифицированных варианта куриного гамма-ИФН (ggIFNGtr1 и ggIFNGtr2), были клонированы под контролем промотора 35S в составе векторов pHm43GW::p35S::ggIFNGnat::t35S, pHm43GW::p35S::ggIFNGtr1::t35S, pHm43GW::p35S::ggIFNGtr2::t35S для агробактериальной трансформации люцерны. При помощи агробактериальной трансформации были получены трансгенные растения люцерны, которые по данным ПЦР несут модифицированные варианты гена куриного гамма-ИФН. Методом ОТ-ПЦР была подтверждена экспрессия трансгена.
5.1. Определение сайтов встраивания структурного гена куриного гамма-ИФН и структуры вставок у трансгенной люцерны
Экспрессия трансгена и уровень продукции целевого белка могут зависеть от интеграции трансгена в районы генома с разной транскрипционной активностью. Для локализации сайтов встраивания трансгенных вставок в геном полученных растений использовали метод SWPOP (Stepwise partially overlapping primer-based PCR), представляющий собой три последовательных ПЦР с вложенными праймерами [32]. По результатам секвенирования полученных ПЦР-фрагментов установлено, что в случае растения, несущего полноразмерный ген куриного гамма-ИФН ggIFNGnat, вставка произошла в транскрипционно активный участок хромосомы 3. У растений, несущих модифицированный ген куриного гамма-ИФН встраивание произошло в разные участки генома: у ggIFNGtrII_5, ggIFNGtrII_9 встраивание Т-ДНК произошло в разные участки хромосомы 1; у ggIFNGtrII_10 Т-ДНК встроилась в участок повторов. Однозначно установить хромосому невозможно — наблюдается сходство с хромосомами 2, 3, 6, 8.
Встраивание единичной копии трансгена в транскрипционно активный район генома является оптимальным вариантом. Полученные результаты позволяют предварительно выделить по этому критерию растения с полноразмерным геном куриного гамма-ИФН и trII_9 с укороченным вариантом этого гена.
Предварительно установлена структура вставок: у 3 растений (с полноразмерным геном куриного гамма-ИФН - ggIFNGnat, с модифицированным геном куриного гамма-ИФН - ggIFNGtrII_5, ggIFNGtrII_9) в кластеры; у 1 растения (с модифицированным геном куриного гамма-ИФН - ggIFNGtrII_10) – две вставки в разных регионах генома; у 1 растения (с модифицированным геном куриного гамма-ИФН - ggIFNGtrII_11) – единственная вставка.
Семена трансгенной люцерны поколения Т0 высажены, получены растения поколения Т1.
5.2. Проверка присутствия трансгена и уровень его экспрессии у трансгенной люцерны поколения Т1
Для проверки экспрессии трансгена провели ОТ-ПЦР анализ 39 трансгенных растений поколения Т1.
Далее провели анализ уровня экспрессии трансгена относительно уровня экспрессии гена актина и обнаружили вариабельность как у потомков разных растений Т0, так и потомков одного растения. Потомки трансформантов trII_9 и trII_11 продемонстрировали наиболее стабильный и высокий уровень экспрессии гетерологичного гена.
Таким образом, получена трансгенная люцерна поколения Т1, содержащая и экспрессирующая ген куриного гамма-интерферона. В настоящее время проводится анализ уровня продукции целевого белка разными растениями поколения Т1.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе выполнения третьего этапа НИР получены следующие основные результаты:
1.Изучено влияние копийности экспрессионной кассеты на уровень синтеза целевого белка дрожжами-продуцентами.
2.Исследовано влияние модифицированной последовательности альфа-фактора на уровень секреции целевых рекомбинантных белков.
3.Получены штаммы E. coli - продуценты белков вируса инфекционной бурсальной болезни.
4.Проведена подготовка образцов полноразмерного белка VP2, его фрагментов для оценки их иммуногенности
5.Определены сайты встраивания структурного гена куриного гамма-интерферона и структура вставок у трансгенной люцерны. Проверено присутствие трансгена и уровень его экспрессии у трансгенной люцерны поколения Т1.
Не менее важными для дальнейшего развития исследований по получению организмов-продуцентов антигенов, белков-иммуномодуляторов и субъединичных вакцин являются результаты, полученные при выполнении предыдущих этапов проекта:
•Проведен биоинформатический анализ нуклеотидной последовательности гена V2, кодирующего структуру зрелого белка VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни.
•Последовательность гена V2 клонирована в плазмидах pPIC9 и pPICZальфа А под контролем промотора гена АОХ1 для последующей экспрессии в дрожжах Pichia pastoris.
•Получены штаммы дрожжей, синтезирующие и секретирующие белок VP2. При внутриклеточной продукции VР2 частично агрегирует. При секреции весь белок VP2 находится в виде высокомолекулярных олигомеров. Предложены способы дезагрегации олигомеров.
•Показано, что вакцинация птиц культуральной жидкостью штамма-продуцента, содержащей белок VP2, вызывает защитный иммунитет.
•Получены рекомбинантные плазмиды pPICZaльфа A/(52-417) и pPICZaльфа A/(613-757), несущие нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные фрагменты белка VP2 вируса под контролем промотора гена АОХ1.
•Проведена трансформация дрожжей P. pastoris плазмидами pPICZαВ/(52-417) и pPICZαВ/(613-757), получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие и секретирующие M и N фрагменты белка VP2 вируса, вызывающего инфекционную бурсальную болезнь.
•M и N фрагменты белка VP2 очищены при помощи аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозе.
•Показана возможность использования M фрагмента белка VP2 для проведения ИФА.
•Подготовлены образцы фрагментов M и N фрагменты белка VP2 для пробной иммунизация птиц.
•Для повышения эффективности секреции рекомбинантных белков проведена модификация последовательности альфа-фактора в составе экспрессионных плазмид. Получена плазмида pPICZdel57-70alpha с модифицированным сигналом секреции.
•Получена плазмида pPIC-Kan-Neo-2/15 для клонирования гетерологичных генов в дрожжах P. pastoris, содержащая новый селективный маркер – ген устойчивости к канамицину, что позволит получать дополнительные копии целевых генов в геноме дрожжей.
•Синтезирована последовательность нуклеотидов, кодирующая мимотоп, котрый имитирует эпитопы белка VP2. Получена рекомбинантная плазмида pPICZaВ/5EPIS которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую мимотоп.
•Получена плазмида pHm43gw::p35S::ggIFNGnat::t35S для экспрессии нативной формы гена гамма-интерферона курицы в растениях. Отобраны клоны Agrobacterium tumefaciens AGL1, несущие эту плазмиду, для последующей агробактериальной трансформации люцерны.
•Впервые получены трансгенные растения люцерны поколения Т0, в геноме которых присутствует ген куриного гамма-интерферона. Получены семена трансгенной люцерны.
В ходе проведенных исследований разработаны подходы и усовершенствованы методы получения трансгенных организмов с заданными свойствами. Полученные результаты позволяют подойти к эффективному гетерологичному синтезу рекомбинантных антигенов и белков иммуномодуляторов в дрожжах и растениях, также открывают перспективы дальнейшего совершенствования систем экспрессии гетерологичных генов, обозначают способы увеличения выхода целевых белков и дальнейшее развитие вариантов рекомбинантных вакцинных препаратов.

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

19.Zhu, T., Guo, M., Sun, C. et al. A systematical investigation on the genetic stability of multi-copy Pichia pastoris strains // Biotechnol. Let.. - 2009. Vol. 31(5). P. 679–684. https://doi.org/10.1007/s10529-009-9917-4.
20.Silva, D. A., Yu, S., Ulge, U. Y. et al. De novo design of potent and selective mimics of IL-2 and IL-15 // Nature.- 2019.- Vol. 565(7738). – P. 186–191. https://doi.org/10.1038/s41586-018-0830-7.
21.Wu S., Letchworth G.J. High efficiency transformation by electroporation of Pichia pastoris pretreated with lithium acetate and dithiothreitol // Biotechniques. 2004. – Vol. 36(1). – Р.:152-154. doi: 10.2144/04361DD02.
22.Fujimura H., Sakuma Y.. Simplified isolation of chromosomal and plasmid DNA from yeasts // Biotechniques. – 1993.- Vol. 14(4. P. 538-540.
23.Padkina, M.V., Parfenova, L.V., Gradoboeva, A.E. et al. Heterologous interferons synthesis in yeast Pichia pastoris // Appl. Biochem. Microbiol. - 2010. - Vol. 46. - P. 409–414. doi: 10.1134/S0003683810040083.
24.Barrero, J. J., Casler, J. C., Valero, F. et al. An improved secretion signal enhances the secretion of model proteins from Pichia pastoris // Microb. Cell Fact. – 2019.- Vol. 17(1). – P. 161. https://doi.org/10.1186/s12934-018-1009-5.
25.Fitzgerald I., Glick B.S. Secretion of a foreign protein from budding yeasts is enhanced by cotranslational translocation and by suppression of vacuolar targeting // Microb. Cell Fact. – 2014. – Vol. 13(1). – P. 125. doi:10.1186/s12934-014-0125-0.
26.Partidos C.D. Peptide mimotopes as candidate vaccines // Curr. Opin. Mol. Ther. - 2000. - Vol. 2(1). - P. 74-79.
27.Wang Y.S., Fan H.J., Li Y. et al. Development of a multi-mimotope peptide as a vaccine immunogen for infectious bursal disease virus // Vaccine. – 2007. - Vol. 25(22). – Р. 4447-4455. doi: 10.1016/j.vaccine.2007.03.018.
28.Румянцев А.М., Цыганков М.А., Веретенников В.В., Самбук Е.В., Падкина М.В. Гетерологичный синтез N и M фрагментов капсидного белка VP2 вируса инфекционной бурсальной болезни птиц в дрожжах Pichia pastoris // Экологическая генетика. – 2022. – Т. 20. – № 1. – С. 49-59. – DOI 10.17816/ecogen83441. – EDN TLTCEC.
29.Джавадов Э.Д., Румянцев А.М., Веретенников В.В., Тарлавин Н.В. Использование рекомбинантного белка VP2 в качестве субъединичной вакцины против инфекционной бурсальной болезни // Межд. вестник ветеринарии.- 2021. - No 3. - С. 9-14.
30.Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. - 2001. - Vol. 98, № 20. - P. 11539-11544.
31.Tsygankov M.A.; Zobnina A.E., Padkina M.V. Synthesis of recombinant gamma interferons resistant to proteolysis in the yeast Pichia pastoris //Appl. Biochem. Microbiol. - 2014. - Vol. 50. - P. 279-285.
32.Chang K., Wang Q., Shi X. et al. Stepwise partially overlapping primer-based PCR for genome walking // AMB Expr. - 2018. – Vol. 8. – P. 77. https://doi.org/10.1186/s13568-018-0610-7.