Создание нового поколения вакцинных препаратов для птиц на основе рекомбинантных антигенов и адъювантов – иммуностимуляторов

Научная проблема, на решение которой направлен проект

Современное промышленное птицеводство – наиболее передовая, наукоемкая и динамично развивающаяся отрасль агропромышленного комплекса, обеспечивающая, в том числе, продовольственную безопасность России. Вместе с тем, интенсификация отрасли ставит перед биологической и ветеринарной наукой новые сложные задачи по обеспечению защиты поголовья от постоянно увеличивающегося количества инфекционных болезней птиц и иммуносупрессивных факторов различной этиологии.
Наиболее мощным и действенным способом предупреждения инфекционных заболеваний у животных и у человека является вакцинация. При разработке современных вакцин нельзя ограничиваться одним получением препаратов на основе иммуногенных антигенов. Необходимо проведение разнообразных исследований, включающих также поиск и синтез эффективных адъювантов, совершенствование тест-систем для контроля вакцинирования, а также разработку средств для поддержания и защиты иммунной системы птицы. Такое разнообразие задач требует разработки комплексного подхода к получению современных вакцинных препаратов.
Предлагаемый проект посвящён созданию нового поколения вакцинных препаратов для птиц. В ходе проекта за счёт применения эффективных организмов-продуцентов, дрожжей и растений, будут синтезированы рекомбинантные белки – антигены, которые можно будет использовать в качестве компонентов вакцин и тест-систем. Одновременно будут синтезированы рекомбинантные белки – иммуномодуляторы, которые будут применены как адъюванты и в качестве основы иммуностимулирующих препаратов. Будут также получены организмы-продуценты, которые можно будет непосредственно применять в качестве компонентов вакцин и пищевых добавок.
Таким образом, в рамках данного проекта за счёт применения методов синтеза рекомбинантных белков и использования эффективных организмов-продуцентов будет разработан комплексный подход к получению современных вакцинных препаратов. При этом проводимые исследования будут направлены на противодействие наиболее опасным вирусным заболеваниям у птиц. В первой части проекта будут получены новые вакцины против вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ). Далее разработанные методы и подходы будут применены для получения вакцин против вирусов, вызывающих болезнь Ньюкасла у куриц и геморрагический энтерит у индеек.

Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы

Предлагаемый проект направлен на разработку комплексного подхода к профилактике опасных вирусных заболеваний птиц - инфекционной бурсальной болезни (ИББ), болезни Ньюкасла и геморрагического энтерита индеек.
Во всех регионах мира, производящих птицу, вирус инфекционной бурсальной болезни (ИББ) продолжает оставаться одной из главных проблем для птицеводов. Вирус вызывает у цыплят анемичность и обезвоженность мышечной ткани, также кровоизлияния в мышцах голени, бедра, крыльев и груди. Наиболее характерные для данной болезни изменения наблюдаются в фабрициевой бурсе. В первые 2-4 дня после заражения птицы она увеличивается в 2-3 раза. Ее слизистая оболочка становится отечна, гиперемирована, в ней обнаруживаются кровоизлияния и некротические участки. Основной опасностью ИББ является вызываемое ей иммунодепрессивное состояние.
Последствиями иммуносупрессии, связанной с ИББ, являются недостаточность вакцинации и восприимчивость цыплят к условно-патогенным микроорганизмам. Также показано, что инфицированные ИББ птицы могут стать распространителями других вирусных патогенов.
Первые штаммы вируса ИББ были обнаружены в США более 50 лет назад [1]. С тех пор вирус распространился по всему миру. Все крупные регионы-производители мяса птицы сообщают о выявлении двух или более штаммов различной вирулентности [2]. Недавнее исследование, посвященное глобальной молекулярной эпизоотологии ИББ с четырех континентов, показало, что 60-76% изолятов ИББ относятся к очень вирулентным штаммам. Однако другие штаммы, включая вариантные, также набирают силу и являются наиболее распространенными в США.
Вакцинация является наиболее важной мерой для борьбы с ИББ в полевых условиях. Используемые в настоящее время инактивированные вирусные вакцины эффективны против ИББ, но имеют определенные недостатки. В популяции привитых куриц одинакового возраста титры антител сходны. Их цыплята через желточный мешок получают материнские антитела (МА), которые обеспечивают защиту в течение первых нескольких недель после вылупления. При этом у потомства различных вакцинированных популяций могут быть разные титры антител к вирусу ИББ [3]. При совместном выращивании это может привести к различному уровню МА в потомстве и разделить стадо на особей с низкой или высокой восприимчивостью к вирулентному ИББ. Кроме того, из-за низкой эффективности имеющиеся инактивированные вакцины необходимо применять как минимум дважды, что является трудоемким и дорогостоящим процессом.
Широкое использование живых вакцин в полевых условиях, как полагают, способствует появлению новых вирусных штаммов за счёт процессов реассортации и рекомбинации. Это может привести к появлению новых мутантных штаммов вируса ИББ, уклоняющихся от вакциноиндуцированного иммунитета и обладающих ещё большей вирулентностью [4]. Кроме того, живые вакцины в ряде случаев могут сами вызвать повреждение бурсы [5].
Подобные проблемы характерны не только для ИББ, но и для болезни Ньюкасла и геморрагического энтерита индеек. Болезнь Ньюкасла (англ. – Newcastle Disease) (БН) – высококонтагиозная болезнь птиц из отряда куриных, проявляющаяся поражением органов дыхания, желудочно-кишечного тракта и центральной нервной системы. Вирус вызывающий болезнь Ньюкасла относится к семейству самых опасных вирусов – Paramixoviridae, роду Аvulavirus, к которому относятся возбудители чумы рогатого скота, чумы плотоядных, парагриппа многих видов животных. Представители этого семейства также являются возбудителями болезней человека [6].
Болезнь Ньюкасла поражает кур, индеек, цесарок, фазанов, павлинов. Степень восприимчивости к заболеванию птиц разных пород и возрастов варьирует. Вакцинация домашней птицы живыми и инактивированными вакцинами против БН является эффективным методом контроля и профилактики болезни. Однако, учитывая растущее число вспышек в коммерческих стадах домашней птицы по всему миру, появляется необходимость разработки новых типов вакцин.
Геморрагический энтерит (мраморная болезнь селезенки, англ. Haemorrhagic enteritis of turkeys) (ГЭ) - острая вирусная болезнь индеек и фазанов, которая характеризуется иммунодепрессией, пятнистыми кровоизлияниями и внезапной гибелью. ГЭ является экономически важным заболеванием индеек и вызывается ДНК-содержащим вирусом из семейства Adenoviridae II типа. Вирус распространен повсеместно. Полевые данные и лабораторные исследования показывают, что вирус ГЭ вызывает иммунодепрессию как гуморального, так и клеточного иммунитета индеек. Механизм иммунодепрессии неизвестен. Вакцины, доступные в настоящее время коммерческому производителю птицы, эффективны в предотвращении вспышек заболеваний, однако все они сами по себе являются иммуносупрессивными, что увеличивает актуальность разработки и применения рекомбинантных вакцин.
Отдельно следует отметить, что вирусы, используемые для приготовления вакцин, в частности вакцины против ИББ, необходимо размножать в клеточных культурах, куриных эмбрионах или тканях бурсы молодых цыплят. В связи с этим коммерческое производство таких вакцин для иммунизации птиц является дорогостоящим.
Таким образом, на сегодняшний день существует необходимость в разработке новых вакцин, сочетающих простоту и дешевизну производства с высокой эффективностью и небольшим количеством побочных эффектов. Одним из наиболее перспективных направлений является разработка вакцин на основе рекомбинантных белков. Для этих целей активно применяются дрожжи, в частности P. pastoris [7].
Заметно повысить эффективность вакцин позволяет также использование различных добавок – адъювантов. В качестве адъювантов широко используются белки-иммуномодуляторы, например интерфероны и интерлейкины, а также бактериальные антигены, в частности флаггелины. Использование дрожжей P. pastoris и растений, являющихся одними из самых эффективных и известных систем экспрессии гетерологичных генов, позволит синтезировать различные белки-адъюванты в больших количествах.
Для эффективного применения вакцин в птицеводстве необходимо иметь возможность быстро и точно определять титры антител, специфичных к вирусным белкам. Это позволяет рассчитать напряженность иммунитета в группах привитых кур и, таким образом, контролировать эффективность проведенного вакцинирования. В связи с тем, что у молодых цыплят есть материнский иммунитет, при проведении вакцинации необходимо определять наличие в сыворотке крови материнских антител. Для решения подобных задач разработаны наборы и тест-системы, основанные на применении реакции диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментного анализа (ИФА). В составе этих наборов в качестве контрольных образцов часто используются живые антигены и сыворотки крови птиц. Работа с живыми антигенами и сывороткой животных опасна, поэтому возникает необходимость замены этих компонентов на более безопасные аналоги, например, рекомбинантные антигены или антитела. Применение рекомбинантных белков в данных наборах и тест-системах также позволит удешевить их производство.
Действие на птицу различных стрессовых факторов: кормового, температурного, механических и других воздействий, приводит к подавлению иммунной системы, снижению устойчивости птицы к заболеваниям. Иммунодепрессивное состояние в производственных условиях сопровождается повышенной гибелью птицы, ухудшением основных производственных показателей: снижением привесов у бройлеров, спадом яйценоскости у несушек, ухудшением показателей воспроизводства стада в племенных хозяйствах. Применение эффективных ранее биопрепаратов, призванных обеспечить надежную специфическую защиту поголовья против многих бактериальных и вирусных болезней птиц, в случае иммунодепрессии не дает ожидаемого результата. Все чаще имеют место «прорывы» поствакцинального иммунитета у привитых птиц и их повышенная гибель. В этой связи, поиск и широкое применение эффективных средств поддержания и защиты иммунной системы птицы, например иммуномодуляторов, является важным направлением в современном промышленном птицеводстве. К препаратам этого класса можно отнести антигены микробных клеток, препараты тимуса (гормоны), цитокины, нуклеиновые кислоты, препараты иммуноглобулинов, полисахариды из стенок дрожжевых клеток (бетаглюканы).
Белки иммуномодуляторы, интерфероны и интерлейкины, способны координировать работу иммунной системы, контролировать силу и интенсивность иммунного ответа [8]. Куриный гамма-интерферон модулирует иммунный ответ, активирует макрофаги, проявляет противовирусную активность, активирует экспрессию генов белков MHC класса II и стимулирует образование окиси азота макрофагами [9]. Показано, что рекомбинантный гамма-интерферон курицы подавляет развитие вируса гриппа H5N1 и вируса болезни Марека в культуре фибробластов цыпленка [10]. Кроме того, рекомбинантный гамма-интерферон курицы повышает бактерицидную активность макрофагов и предотвращает развитие наиболее распространенных микробных инфекций птиц: кокцидоза, сальмонеллеза, колибактериоза [11-13]. Гамма-интерферон является также противоопухолевым агентом [14].
Возможность применения интерферонов в промышленном птицеводстве определяется их доступностью, способом доставки и применения. Использование гетерологичного синтеза позволяет получать значительные количества интерферонов, которые могут быть использованы в качестве адъюванта при вакцинации или в качестве лекарственного средства для лечения и профилактики болезней.
Создание организмов-продуцентов белков-иммуномодуляторов животных является наиболее перспективным направлением современной биотехнологии. Применение непатогенных дрожжей P. pastoris и растений в качестве продуцентов белков высших эукариотических организмов позволяет не только получать рекомбинантные белки, пригодные для ветеринарии, но и использовать организмы-продуценты в качестве иммунопробиотической пищевой добавки. Клеточные стенки растений и дрожжей способны предохранить рекомбинантный белок от воздействия кислой среды желудка и дают возможность этому белку достичь лимфоидных органов кишечника в неповрежденном виде [15, 16].

1.Cosgrove. An apparently new disease of chickens: avian nephrosis. Avian Dis. 1962;6(3):385–389
2.Jackwood DJ, Sommer-Wagner S. Genetic characteristics of infectious bursal disease viruses from four continents. Virology. 2007;365(2):369–375.
3.Lucio B, Hitchner SB (1979) Infectious Bursal Disease Emulsified Vaccine: Effect upon Neutralizing-Antibody Levels in the Dam and Subsequent Protection of the Progeny. Avian Dis 23: 1037–1050.
4.Jackwood DJ, Sommer SE. Identification of infectious bursal disease virus quasispecies in commercial vaccines and field isolates of this double-stranded RNA virus. Virology. 2002;304(1):105–113.
5.Tsukamoto K, Tanimura N, Kakita S, Ota K, Mase M, et al. (1995) Efficacy of three live vaccines against highly virulent infectious bursal disease virus in chickens with or without maternal antibodies. Avian Dis 39: 218–229.
6.Аристова В.А., Ковтунов А.И., Прилипов А.Г., Ямникова С.С., Львов Д.К. Молекулярно-вирусологический мониторинг вируса болезни Ньюкасла (Paramixoviridae, avulavirus) в популяциях диких птиц дельты Волги / Вопросы вирусологии. – 2006. – Т. 51. – № 5. – С. 32-38. 4
7.Taghavian O, Spiegel H, Hauck R, Hafez HM, Fischer R, Schillberg S Protective oral vaccination against infectious bursal disease virus using the major viral antigenic protein VP2 produced in Pichia pastoris.PLoS One. 2013 Dec 20;8(12):e83210. doi: 10.1371/journal.pone.0083210. eCollection 2013.
8.Goossens K.E., Ward A.C., Lowenthal J.W., Bean AG. Chicken interferons, their receptors and interferon-stimulated genes // Dev. Comp. Immunol. 2013. V.41(3). P.370-376.
9.Takehara K., Kobayashi K., Ruttanapumma R. et al. Adjuvant Effect of Chicken Interferon-γ for Inactivated Salmonella Enteritidis Antigen // J. Vet. Med. Sci. 2003. V.65. P.1337-1341.
10.Xing Z., Schat K.A. Inhibitory Effects of Nitric Oxide and Gamma Interferon on In Vitro and In Vivo Replication of Marek's Disease Virus // J. Virol. 2000. V.74. P.3605-3612.
11.Heriveau C., Dimier-Poisson I., Lowenthal J. et al. Inhibition of Eimeria tenella replication after recombinant IFN-g activation in chicken macrophages, fibroblasts and epithelial cells // Vet. Parasitol. 2000. V.92. P.37-49.
12.Kogut M.H., Rothwell L., Kaiser P. IFN-γ Priming of Chicken HeterophilsUpregulates the Expression of Proinflammatory and Th1 Cytokine mRNA Following Receptor-Mediated Phagocytosis of Salmonella entericaserovarenteritidis // J. Interferon Cytokine Res. 2005. V.25. P.73-81
13.Janardhana V., Ford M.E., Bruce M.P. et al. IFN-gamma enhances immune responses to E. coli infection in the chicken // J. Interferon Cytokine Res. 2007, V.27(11). P.937-946.
14.Plachy J., Weining K.C., Kremmer E. et al. Protective Effects of Type I and Type II Interferons toward Rous Sarcoma Virus-Induced Tumors in Chickens // Virology. 1999. V.256. P.85-91.
15.Kong Q., Richter L., Yang Y.F. et al. Oral immunization with hepatitis B surface antigen expressed in transgenic plants // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2001. V.98(20). P.11539-11544.
16.Bagherpour G., Ghasemi H., Zand B. et al. Oral Administration of Recombinant Saccharomyces boulardii Expressing Ovalbumin-CPE Fusion Protein Induces Antibody Response in Mice // Front. Microbiol. 2018. V.9. P.723.

Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб

В ходе предлагаемого проекта будут получены новые вакцинные препараты для птиц на основе рекомбинантных белков. Для достижения этой цели будут решены следующие задачи:
1)Получить штаммы дрожжей Pichia pastoris, синтезирующие высокоиммуногенные рекомбинантные белки вирусов ИББ, болезни Ньюкасла и геморрагического энтерита индеек, которые могут быть использованы как компоненты вакцин и тест систем.
2)Получить штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие эффективные адъюванты, которые могут быть использованы как компоненты вакцин.
3)Получить трансгенные растения, синтезирующие белки-иммуномодуляторы, которые могут быть использованы в качестве средств поддержания и защиты иммунной системы птиц.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов

На сегодняшний день исследования, посвящённые возможности использования рекомбинантных белков, как основы для создания вакцин, вызывают всё больший интерес. Примером может служить инфекционная бурсальная болезнь (ИББ). В ряде работ были синтезированы различные рекомбинантные антигены, исследована их иммуногенность и возможность применения как компонентов вакцин. Однако в данных исследованиях использовали различные организмы-продуценты: бактерии, дрожжи, растения и клеточные линии. При этом для анализа иммуногенности вируса применяли разные методики [1]. Эти различия делают невозможным надёжное сравнение эффективности синтезированных рекомбинантных антигенов и выбор их наиболее иммуногенных сочетаний.
В предлагаемой работе в качестве организма – продуцента рекомбинантных белков будут использованы метилотрофные дрожжи P. pastoris. Для синтезированных белков и их фрагментов будут использованы стандартизованные методы очистки и анализа иммуногенности. Такой подход позволит впервые надёжно сравнить иммуногенность отдельных белков исследуемых вирусов, их фрагментов и различных сочетаний антигенов и адъювантов.
В предлагаемом проекте методы дрожжевого дисплея впервые будут использованы для получения компонентов вакцин против вирусов, вызывающих заболевания птиц. В работе [2] дрожжи, синтезирующие внутриклеточный белок VP2 вируса ИББ, использовались в качестве оральных вакцин. Преимуществами подобного подхода являются отсутствие необходимости предварительной очистки рекомбинантного белка и проведения инъекций, что может сильно удешевить производство вакцин. Однако было показано, что эффективность иммунизации была ниже, чем при инъекции очищенных белков или использовании вирусных частиц. Эти результаты авторы связывали с медленным разрушением клеточных стенок дрожжей в кишечном тракте куриц, что снижало доступность рекомбинантных антигенов. При применении метода дрожжевого дисплея клетки P. pastoris будут экспонировать антигены на своей поверхности, что увеличит их доступность для иммунокомпетентных клеток.
Однако наиболее перспективной выглядит возможность применения клеток P. pastoris, экспонирующих антигены вирусов, в сочетании с инъекционным методом введения. В работе [3] клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, экспонирующие H5N1 гемагглютинин в качестве антигена, использовали для вакцинации мышей. При этом проводилась инъекция непосредственно суспензии клеток, убитых температурной обработкой. Была показана 100% защита вакцинированных таким образом мышей от вирулентного вируса птичьего гриппа H5N1. При этом не было обнаружено каких-либо побочных эффектов. При подобном подходе нет необходимости в очистке рекомбинантных белков. Таким образом, вакцины, полученные на основе методов дрожжевого дисплея, могут быть необычайно дешевыми, оставаясь при этом эффективными. В данном проекте впервые будут исследованы возможности применения дрожжевого дисплея для получения вакцин против ИББ, болезни Ньюкасла и геморрагического энтерита индеек.
Гарантией достижимости поставленных в проекте задач является использование необычайно эффективных организмов, продуцентов рекомбинантных белков – дрожжей Pichia pastoris и трансгенных растений.
Метилотрофные дрожжи P. pastoris (так же известные как Komagataella phaffii) применяются в современной биотехнологии для производства самых разнообразных белков в больших количествах. Эти дрожжи способны расти в средах относительно простого состава и, при этом, достигать исключительно высоких значений плотности культуры. Другим преимуществом дрожжей P. pastoris как объекта биотехнологии является наличие необычайно сильных и при этом строго регулируемых промоторов. Обычно для экспрессии гетерологичных генов в P. pastoris применяются промоторы генов метаболизма метанола, в частности гена алкогольоксидазы AOX1. При этом возможность P. pastoris расти в средах с метанолом, который негативно влияет на жизнедеятельность большинства микроорганизмов, позволяет заметно снизить риск контаминации [4].
Перечисленные факторы сделали P. рastoris одной из самых эффективных из известных систем экспрессии гетерологичных генов. Опыт применения этих дрожжей в биотехнологии показал, что вероятность успешного синтеза любого чужеродного белка с помощью P. pastoris составляет около 75%, что является очень высоким показателем. Причём основным этапом является получение штаммов, синтезирующих целевой белок на любом, даже самом минимальном уровне, поскольку использование P. рastoris предоставляет широкие возможности для дальнейшей оптимизации условий культивирования [4]. Во множестве работ с помощью P. рastoris были достигнуты уровни синтеза целевых белков ≥1 г/л, что является очень хорошим показателем. При этом существуют примеры успешного синтеза внутриклеточных белков в количествах до 22 г/л, а секреторных белков – до 15 г/л. Так же существует ряд примеров успешного синтеза белков с помощью P. рastoris, которые ранее не удавалось синтезировать с помощью других систем на основе Baculovirus или S. cerevisiae [5].
Использование растительных систем в качестве продуцентов гетерологичных белков является одним из актуальных направлений современной биотехнологии [6]. Высшие растения как автотрофные организмы отличаются быстрым ростом и накоплением биомассы при минимальных энергетических затратах, что может обеспечить низкую себестоимость и значительный выход целевого белка.
Применение съедобных растений в качестве продуцентов белков птиц и млекопитающих позволяет не только получать рекомбинантные белки, пригодные для ветеринарной медицины, но и использовать организмы-продуценты в качестве иммунопробиотической кормовой добавки.
Иммунопробиотические добавки имеют определенные преимущества по сравнению с лекарственными препаратами. Использование иммунопробиотической кормовой добавки является экономически выгодным, т.к. позволяет исключить трудоемкие процедуры по выделению и очистке рекомбинантного белка. Использование люцерны слабоусеченной в качестве организма-продуцента обусловлено тем, что её геном секвенирован и она относительно легко трансформируется агробактериями. Кроме того, люцерна используется в птицеводстве для приготовления витаминно-травяной муки – важного элемента подкормки [7].

1.Alkie T.N., Rautenschlein S. Infectious bursal disease virus in poultry: current status and future prospects. Vet Med (Auckl). 2016 Jan 19;7:9-18. doi: 10.2147/VMRR.S68905. eCollection 2016.
2. Taghavian O, Spiegel H, Hauck R, Hafez HM, Fischer R, Schillberg S. Protective oral vaccination against infectious bursal disease virus using the major viral antigenic protein VP2 produced in Pichia pastoris. PLoS One. 2013 Dec 20;8(12):e83210. doi: 10.1371/journal.pone.0083210. eCollection 2013.
3. H. Lei, S. Jin, E. Karlsson, S. Schultz-Cherry, K. Ye Yeast Surface-Displayed H5N1 Avian Influenza Vaccines J Immunol Res. 2016;2016:4131324. doi: 10.1155/2016/4131324.
4. Cereghino J.L., Cregg J.M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris// FEMS Microbiol. Rev. – 2000. – V.24. – P.45-66.
5. Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Jun;98(12):5301-17. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5. Epub 2014 Apr 18.
6. Рукавцева Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. Трансгенные растения для фармакологии// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2006. № 2. C. 3-12
7. Егоров И.А., Струкова С.Г. Использование травяной муки в птицеводстве // Птицеводство. 2013. №8. С.2-6

Современное состояние исследований по данной проблеме

Против вируса ИББ применяются вакцины различной природы: живые и инактивированные аттенуированные вакцины, вирусно-векторные вакцины. Вирусы, используемые для приготовления этих вакцин, необходимо размножать в клеточных культурах, куриных эмбрионах или тканях бурсы молодых цыплят. При этом различные штаммы ИББ реплицируются с разной эффективностью в разных системах. Поэтому коммерческое производство таких вакцин для иммунизации птиц является дорогостоящим. Развитие современных биотехнологий открывает широкие возможности для получения новых, более эффективных и дешёвых в производстве типов вакцин для применения в птицеводстве. Одним из основных направлений исследований при этом является разработка субъединичных вакцин на основе рекомбинантных белков.
Для вируса ИББ в качестве антигена в первую очередь рассматривается капсидный белок VP2. Синтез VP2 был произведен в ряде работ с использованием как эукариотических, так и прокариотических систем экспрессии [1, 2, 3]. Субъединицы VP2, синтезированные с помощью эукариотических систем, предположительно, являются более иммуногеными, чем при использовании прокариотических систем. Улучшенная иммуногенность субъединиц VP2 наблюдалась при дополнительном использовании иммуномодуляторов, в частности куриного интерлейкина-2 или интерлейкина-18 [4]. Изучались иммуногенные свойства и других белков ИББ, в частности VP5, а также пептидных эпитопов (мимотопов) [6]. Была получена вакцина, на основе мимотопа, содержащего несколько эпитопов от вируса ИББ, синтезированного в бактериях E. coli [5]. Вакцина индуцировала нейтрализующие антитела и защищала цыплят от ИББ.
Против болезни Ньюкасла (БН), были разработаны вакцины различного типа: живые и инактивированные, ДНК вакцины и вакцины на основе рекомбинантных белков [6]. В разработку новых вакцин вкладываются большие усилия из-за недостатков существующих вакцин. В качестве основных антигенов вируса БН рассматриваются два гликопротеина F и HN.
Для получения вакцин на основе рекомбинантных белков вируса БН антигены HN и F синтезировали с использованием различных продуцентов: трансгенных растений, дрожжей и молочнокислых бактерий. Так в одной из работ продемонстрировали, что белки F и HN могут быть эффективно синтезированы в трансгенных растениях картофеля [7]. Шахрияри и др. [8] изучали применение корней табака для экспрессии эпитопов F и HN вируса Ньюкаслской болезни. Канг и др. [9] продемонстрировали иммуногенный потенциал белка F БН, синтезированного с помощью метилотрофных дрожжей P. pastoris. Полученный белок индуцировал сильный гуморальный и клеточно-опосредованный иммунный ответ у подопытных мышей. Хулапе и др. [10] использовали дрожжи S. cerevisiae для синтеза белка HN. Было показано, что дрожжевые клетки способны синтезировать гликозилированный белок HN с правильной структурой и иммуногенностью. Цзян и др. [11] получили штамм Lactobacillus plantarum (рLP), синтезирующий HN белок.
Имеющиеся в настоящее время вакцины против геморрагического энтерита индеек (ГЭИ) получают либо из гомогената селезенки 6 недельных индюшат, вакцинированных инокулярно авирулентным штаммом ГЭИ, либо производят в лабораторных условиях с использованием клеток линии RP19. Эти вакцины обеспечивают адекватную защиту, но коммерчески доступны только вакцины на основе культуры клеток. В некоторых странах были разработаны вакцины из авирулентного штамма ГЭИ, выращенного на лейкоцитах периферической крови [12, 13].
Ранее в работе Питковски и др. [14] была получена субъединичная вакцина на основе капсидного белка (knob protein) ГЭИ, который синтезировали в бактериях E. coli. Были проведены эксперименты с этим рекомбинантным белком, которые показали адекватную защиту от вируса. Также исследовались векторные вакцины с использованием вируса оспы птиц, содержащего последовательность, кодирующую нативный гексон ГЭИ [15].
Таким образом, на сегодняшний день для вирусов ИББ, НБ и ГЭИ продемонстрирована возможность применения рекомбинантных белков для получения вакцин. При этом в представленных работах используются разные организмы-продуценты и сильно различающиеся методы оценки эффективности применения синтезированных рекомбинантных антигенов. В предлагаемом проекте будет применён стандартизированный подход, заключающийся в использовании одного организма продуцента, а также одинаковых методов синтеза, очистки и анализа иммуногенности рекомбинантных белков. Исходя из полученных результатов, наиболее иммуногенные фрагменты вирусных белков ИББ, НБ и ГЭИ впервые будут использованы для получения вакцин на основе метода дрожжевого дисплея.
За последние десятилетия технологии иммобилизации белков на различных поверхностях получили широкое распространение. Одним из направлений является использование биологических систем в качестве платформ для закрепления белков и пептидов. Технология дрожжевого дисплея заключается в экспрессии генов химерных белков, состоящих из белка клеточной стенки, отвечающего за закрепление в клеточной стенке, и целевого белка. Исследовательская группа Шредера в 1993 г. впервые получила штамм дрожжей S. cerevisiae, экспонирующий на своей поверхности гетерологичный белок [16]. Несколькими годами позже дрожжевой дисплей использовали для отбора фрагментов антител с нужными свойствами из библиотеки случайных мутантов [17], открыв дорогу для применения дрожжевого дисплея в белковой инженерии. Помимо S. cerevisiae в качестве платформ для экспонирования различных белков используются и другие виды дрожжей, такие как Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica и дрожжи рода Kluyveromyces [18, 19, 20].
Дрожжевой дисплей обладает рядом преимуществ перед другими клеточными системами и охарактеризован некоторыми исследователями как один из наиболее перспективных подходов для белковой инженерии. Дрожжи, будучи эукариотами, могут осуществлять различные посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование и образование дисульфидных связей, фолдинг и секрецию эукариотических белков. Дрожжевой дисплей дает возможность катализировать реакции с использованием крупных субстратов, которые не могут попасть в клетку, а также в условиях, неоптимальных для работы фермента. Помимо этого он позволяет повысить устойчивость целевого белка к изменениям pH, температуры, наличию органических растворителей, протеаз и даже улучшить его кинетические свойства. Попадание синтезируемого фермента в конечный продукт при этом может быть полностью исключено. Дрожжи как и бактерии не требуют для культивирования особых технических затрат и для них разработано большое количество генетических методов. При этом, в связи с большим размером клеток дрожжей, на их поверхности размещается больше молекул целевого белка (порядка 104-105), и их проще отделить от среды.
Дрожжевой дисплей находит применение и в птицеводстве. На его основе ведутся работы по созданию оральных вакцин. Так был разработан штамм P. pastoris, на поверхности клеток которого иммобилизован гемагглютинин высокопатогенного штамма вируса птичьего гриппа (подтип H5N1). Добавление этого штамма в куриный корм привело к появлению у куриц антител, нейтрализующих вирус [21]. В предлагаемом проекте подобные исследования впервые будут проведены для вирусов ИББ, НБ и ГЭИ.
Основной опасностью вируса ИББ является вызываемое им иммунодепрессивное состояние. Последствиями иммуносупрессии, связанной с ИББ, являются недостаточность вакцинации и восприимчивость цыплят к условно-патогенным микроорганизмам. Для вируса ГЭИ показано, что наличие иммуносупрессивных агентов, таких как птичий метапневмовирус или наличие остаточных дезинфицирующих средств для воды снижает эффективность вакцинации [22]. В этой связи, поиск и широкое применение эффективных средств поддержания и защиты иммунной системы птицы, например иммуномодуляторов, является важным направлением в современном промышленном птицеводстве. В данном проекте предлагается использовать дрожжи и растения для синтеза иммуномодулирующих белков.
Растения имеют ряд особенностей и преимуществ в отношении других системам наработки рекомбинантных белков (бактерии, микроорганизмы и культуры клеток животных). В первую очередь следует отметить высокую инфекционную безопасность растений для животных, поскольку они свободны от патогенных микроорганизмов и вирусов животных, а также прионов, и могут быть выращены без использования материалов животного происхождения. Для прироста биомассы им необходимы только свет, углекислый газ и минеральные вещества, что упрощает и удешевляет производство. По сравнению с микроорганизмами системы гликозилирования и других посттрансляционных модификаций белков у растений и животных близки, что позволяет получать сложные гликопротеины с сохранением их биологической активности и стабильности. Для растений существуют разнообразные, относительно простые и к настоящему времени хорошо разработанные методики трансформации. Сельскохозяйственные технологии выращивания позволяют добиться минимальной цены за единицу биомассы среди трансгенных систем экспрессии. Наконец, для некоторых белков медицинского назначения, способных оказывать эффект при пероральном применении, существует возможность полностью отказаться от процедур выделения, очистки и инъекционного введения, используя растения как съедобные иммуномодуляторы и вакцины, что устраняет наиболее сложные и дорогостоящие этапы производства, требующие привлечения квалифицированного персонала. Эти меры могут резко снизить стоимость наработанного в растениях рекомбинантного белка и упростить его применение [23, 24, 25].
В растениях-продуцентах успешно получены антитела против вируса Эбола [26], фрагменты патогена для иммунизации [27], ферменты человека или животных для компенсации их недостатка (Elelyso, глюкоцереброзидаза для лечения болезни Гоше), гормоны и другие сигнальные белки (эритропоэтин, интерфероны, интерлейкины) [24]. Действующее вещество можно выделять из растительной ткани, а можно использовать целые растения в качестве съедобных вакцин или иммуномодуляторов. Механизм иммунизации съедобными вакцинами основан на антиген-представляющей способности макрофагов тонкого кишечника [28, 29]. Получение съедобных растений-вакцин (растений-адъювантов в случае с интерферонами) на основе пищевых и кормовых растений также позволяет применять их в качестве не только иммуномодулирующей, но также витаминной и питательной добавки.
Важным фактом для успешного внедрения инновации является ее совместимость с существующими технологиями. Выбор люцерны как продуцента обусловлен следующими факторами:
- Хорошая изученность, наличие отработанных методик трансформации (люцерна – один из модельных объектов генетики растений).
- Использование в птицеводстве как составляющей зерновых кормов и витаминно-травяной муки.
- Поскольку используется все надземные части растения, нет необходимости сосредотачивать синтез рекомбинантного белка в семенах или корнях. Таким образом, в трансгенной конструкции можно применить классический конститутивный промотор 35S. Создание конструкций с тканеспецифичными промоторами потребует дополнительных затрат.
- Трансгенные растения возможно выращивать в теплицах, с применением гидропонных установок и искусственного освещения, что позволяет соблюдать необходимые для лекарственных средств меры безопасности и чистоты, а также избежать распространения ГМО в окружающей среде.

1.M. Arnold, V. Durairaj, E. Mundt, K. Schulze, K.D. Breunig, S.E. Behrens Protective vaccination against infectious bursal disease virus with whole recombinant Kluyveromyces lactis yeast expressing the viral VP2 subunit. PLoS One, 7 (2012), p. e42870
2.H. Muller, E. Mundt, N. Eterradossi, M.R. Islam Current status of vaccines against infectious bursal disease Avian Pathol., 41 (2012), pp. 133-139
3.J. Pitcovski, B. Gutter, G. Gallili, M. Goldway, B. Perelman, G. Gross, S. Krispel, M. Barbakov, A. Michael Development and large-scale use of recombinant VP2 vaccine for the prevention of infectious bursal disease of chickens. Vaccine, 21 (2003), pp. 4736-4743
4.N. Kong, X. Wang, J. Zhao, J. Hu, H. Zhang, H. Zhao A recombinant baculovirus expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus (IBDV) and chicken interleukin-18 (ChIL-18) protein protects against very virulent IBDV. J. Anim. Vet. Adv., 10 (2011), pp. 2706-2715
5.Y. Wang, H. Fan, L. Yin, S. Zheng-liang, P. Ying, L. Cheng-ping Development of a multi-mimotope peptide as a vaccine immunogen for infectious bursal disease virus. Vaccine, 25 (2007), pp. 4447-4455
6.PEETERS B.P., DE LEEUW O.S., VERSTEGEN I., KOCH G., GIELKENS A.L. (2001): Generation of a recombinant chimeric Newcastle disease virus vaccine that allows serological differentiation between vaccinated and infected animals. Vaccine, 19, 1616–1627.
7.ARNTZEN J. C., MASON H. S. (1995): Oral vaccine production in the edible tissues of transgenic plants. In: New Generation Vaccines. 2nd edition. Eds Levine M.M., Woodrow G. C., Kaper J. B. and Coban G. S. Dekker, New York, USA, 263-277.
8.SHAHRIARI A.G., BAGHERI A.R., BASSAMI M.R., SHAFAROUDI S.M., AFSHARIFAR A. (2015): Cloning and Expression of Fusion (F) and Haemagglutinin-neuraminidase (HN) Epitopes in Hairy Roots of Tobacco (Nicotiana tabaccum) as a Step Toward Developing a Candidate Recombinant Vaccine Against Newcastle Disease. Journal of Cell and Molecular Research, 7, 1, 11-18
9.KANG X., WANG J., JIAO Y., TANG P., SONG L., XIONG D., YIN Y., PAN Z., JIAO X.(2016): Expression of recombinant Newcastle disease virus F protein in Pichia pastoris and its immunogenicity using flagellin as the adjuvant. Protein Expression and Purification, 128, 73-80
10. HULAPE S.A., MAITY H.K., PATHAK D.C., MOHAN C.M., DEY S. (2015): Antigenic validation of recombinant hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus expressed in Saccharomyces cerevisiae. Acta Virologica, 59, 3, 240-246.
11. JIANG Y., HU J., GUO Y., YANG W., YE L., SHI C., LIU Y., YANG G., WANG C. (2015): Construction and immunological evaluation of recombinant Lactobacillus plantarum expressing HN of Newcastle disease virus and DC-targeting peptide fusion protein. Journal of Biotechnology, 216, 82-89.
12. Pierson FW, Fitzgerald SD. 2013. Hemorrhagic enteritis and related infections. In: Diseases of Poultry, 13th Edition, Swayne D.E., John R. Glisson, Larry R. McDougald, Lisa K. Nolan, David L. Suarez, and Venugopal Nair., Eds. Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA. pp: 237-247
13.van den Hurk JV. 1990. Efficacy of avirulent hemorrhagic enteritis virus propagated in turkey leukocyte cultures for vaccination against hemorrhagic enteritis in turkeys. Avian Dis. 34: 26-35.
14.Pitcovski J, Fingerut E, Gallili G, Eliahu D, Finger A, Gutter B. 2005. A subunit vaccine against hemorrhagic enteritis adenovirus. Vaccine. 23: 4697-4702
15.Cardona CJ, Nazerian K, Reed,WM, Silva RF. 2001. Characterization of a recombinant fowlpox virus expressing the native hexon of hemorrhagic enteritis virus. Virus Genes. 22: 353-361
16.Schreuder M.P. et al. Targeting of a heterologous protein to the cell wall of Saccharomyces cerevisiae // Yeast. 1993. Т. 9. № 4. С. 399–409.
17.Boder E.T., Wittrup K.D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries // Nat. Biotechnol. 1997. Т. 15. № 6. С. 553–557.
18.Kim S.-Y. et al. A cell surface display system using novel GPI-anchored proteins in Hansenula polymorpha // Yeast. 2002. Т. 19. № 13. С. 1153–1163.
19. Tanaka T. et al. Recent developments in yeast cell surface display toward extended applications in biotechnology // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. Т. 95. № 3. С. 577–591.
20. Bielen A. et al. Microbial anchoring systems for cell-surface display of lipolytic enzymes // Food Technol. Biotechnol. 2014. Т. 52. № 1. С. 16–34.
21.Wasilenko J.L. et al. Cell surface display of highly pathogenic avian influenza virus hemagglutinin on the surface of Pichia pastoris cells using alpha-agglutinin for production of oral vaccines // Biotechnol. Prog. 2010. Т. 26. № 2. С. 542–547.
22. Chary P, Rautenschlein S, Sharma JM. 2002. Reduced efficacy of hemorrhagic enteritis virus vaccine in turkeys exposed to avian pneumovirus. Avian Dis. 46: 353-359.
23.Рукавцева Е.Б., Бурьянов Я.И., Шульга Н.Я., Быков В.А. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2006. № 2. C. 3-12.
24.Савельева Н.В., Бурлаковский М.С., Емельянов В.В., Лутова Л.А. // Экологическая генетика. 2015. T. XIII, № 2. С. 77-99.
25.Schillberg S, Raven N, Spiegel H, Rasche S and Buntru M (2019) Critical Analysis of the Commercial Potential of Plants for the Production of Recombinant Proteins. Front. Plant Sci. 10:720. doi: 10.3389/fpls.2019.00720
26.Lee JS, Adhikari NKJ, Kwon HY, Teo K, Siemieniuk R, Lamontagne F, Chan A, Mishra S, Murthy S, Kiiza P, Hajek J, Bah EI, Lamah MC, Kao R, Fowler RA. Anti-Ebola therapy for patients with Ebola virus disease: a systematic review. BMC Infect Dis. 2019 May 2;19(1):376. doi: 10.1186/s12879-019-3980-9.
27.Birtukan Girma, Dereje Shegu, Ayelech Muluneh and Fanos Tadesse woldemariyam. (2019). Vaccine production in transgenic plants for animal and human diseases. Archives of Veterinary and Animal Sciences 1(1)
28.Daniell H., Kulis M. and Herzog RW. (2019) Plant cell-made protein antigens for induction of Oral tolerance. Biotechnology Advances, https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2019.06.012
29.Дейнеко Е.В. // Вестник Томского государственного университета. Биология. 2012. № 2 (18). С. 41-51.

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта

Исходя из задач проекта, общий план работы можно разделить на несколько частей:
1)Синтез рекомбинантных белков вирусов, вызывающих инфекционную бурсальную болезнь, болезнь Ньюкасла и геморрагический энтерит индеек. Оценка иммуногенности синтезированных белков и возможности их применения в качестве вакцин и компонентов тест-систем.
2)Получение адъювантов и оценка их влияния на иммуногенность белков вирусов.
3)Оптимизация синтеза и очистки наиболее иммуногенных белков вирусов и наиболее эффективных адъювантов.
4)Получение штаммов дрожжей P. рastoris, экспонирующих на поверхности белки вирусов. Анализ эффективности применения методик дрожжевого дисплея при вакцинации птиц.
5)Получение трансгенных растений, синтезирующих белки-иммуномодуляторы. Анализ их применения в качестве средств поддержания и защиты иммунной системы птиц.

1)На первом этапе предлагаемого проекта планируется провести синтез рекомбинантных белков вируса инфекционной бурсальной болезни (ИББ) и их фрагментов. Далее аналогичные исследования будут проведены для белков вирусов, вызывающих болезнь Ньюкасла и геморрагический энтерит индеек.
На сегодняшний день для синтеза белков вируса ИББ используются различные организмы – продуценты: бактерии, дрожжи, культуры клеток и растения [1]. Большинство работ посвящено синтезу белка VP2, являющегося основным компонентом оболочки вируса. Гидрофобные свойства участков VP2 обуславливают его склонность к образованию агрегатов, что усложняет его очистку и дальнейшее использование. В связи с этим в ряде работ проводят синтез различных фрагментов белка VP2. При этом значительно различаются методы, используемые для оценки эффективности применения синтезированного фрагментов белка в качестве рекомбинантной вакцины [1].
При синтезе рекомбинантных белков будет применён стандартизированный подход, заключающийся в использовании одного организма продуцента, а также одинаковых методов синтеза, очистки и анализа иммуногенности рекомбинантных белков. Подобный стандартизированный подход позволит сравнить эффективность применения белков ИББ и их фрагментов в качестве вакцин и компонентов тест систем, используемых в птицеводстве.
В качестве организма-продуцента планируется использовать метилотрофные дрожжи P. pastoris. В работе [2] эти дрожжи были использованы для синтеза внутриклеточного варианта полноразмерного белка VP2. Авторами заявки уже получен штамм P. pastoris, синтезирующий секреторный белок VP2, и показана возможность его применения для вакцинации птиц. Таким образом, поскольку дрожжи P. pastoris являются одной из самых эффективных из известных систем экспрессии гетерологичных генов [3] и для них показана возможность синтеза функциональных белков ИББ, они прекрасно подходят в качестве организма-продуцента. Коллектив авторов заявки имеет большой опыт применения данных дрожжей для синтеза различных рекомбинантных белков [4, 5, 6].
В качестве синтезируемых белков будут использованы белки оболочки ИББ - VP2 и VP3 и их фрагменты. Анализ литературы и проведенный предварительный анализ последовательности белка VP2 позволяет выделить в его структуре 3 участка – N-концевой, центральный и С-концевой. При синтезе полноразмерного рекомбинантного белка VP2 происходит его агрегация за счёт наличия в его составе гидрофобных участков [3]. Чтобы её избежать проводят синтез отдельных фрагментов, например содержащего центральный и С-концевой домен или отдельно N-концевой домен. В данном проекте планируется провести подробный анализ последовательностей и доступных структур белков VP2 и VP3. Для этого будет использована программа для визуализации и анализа белковых структур UCSF Chimera. Будут выявлены элементы последовательностей исследуемых белков, участвующие в образовании их контактной поверхности, а также гидрофобные участки. С помощью множественного сравнения последовательностей белков различных геногрупп ИББ будут определены консервативные и вариабельные элементы их поверхностей.
Исходя из полученных результатов, будут выбраны фрагменты белков VP2 и VP3 для проведения синтеза. Авторами заявки уже была амплифицирована и клонирована полноразмерная нуклеотидная последовательность, кодирующая белок VP2. Сходным образом из вирусных частиц ИББ будет выделена РНК, проведен синтез кДНК, амплифицирована и клонирована последовательность, кодирующая белок VP3. Далее будут амплифицированы нуклеотидные последовательности, соответствующие выбранным фрагментам белков, которые будут встроены в вектор рPICZalphaA под контроль промотора гена АОХ1. В рамку считывания также будут добавлены последовательность альфа-фактора, обеспечивающего секрецию, а также последовательности c-myc эпитопа и 6xHis-метки, что упростит детекцию и очистку синтезируемого белка.
Полученные плазмиды будут использованы для трансформации штамма дрожжей P. pastoris GS115 методом электропорации. В результате будут отобраны трансформанты, содержащие встроенные в геном последовательности, обеспечивающие синтез фрагментов белков вируса ИББ. Будет проведено культивирование полученных штаммов. Синтез и секреция целевых белков будут подтверждены с помощью методов электрофореза в денатурирующих условиях и Вестерн-блот гибридизации с антителами, специфичными к c-myc эпитопу.
Таким образом, будет получен набор штаммов P. pastoris, синтезирующих фрагменты белков VP2 и VP3. Эти рекомбинантные белки будут синтезированы и, за счёт наличия у них 6xHis-метки, очищены из среды с помощью методов аффинной хроматографии. Концентрации белков будут определены с помощью метода Бредфорда.
Эквивалентные количества синтезированных белков будут использованы для вакцинирования птиц и оценки эффективности иммунизации. Цыплята породы Lohmann brown будут вакцинированы рекомбинантными белками за счёт подкожной инъекции. В течение 30 дней птицы будут находиться в одинаковых условиях содержания, поения и кормления. Для определения иммуногенности рекомбинантных белков кровь цыплят будет исследована с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора производства BioChek. В результате исследования будут определены титры антител, специфичных к белкам вируса ИББ. Также будет определена напряженность иммунитета в группах привитых кур, которая рассчитывается как отношение количества положительных проб к общему количеству исследованных сывороток, выраженное в процентах. Птицу считают вакцинированной при напряженности иммунитета 90 и более процентов (т.е. если в 90 и более процентах исследованных проб сывороток крови титр антител 1:380 и выше). Полученные данные позволят сравнить иммуногенность синтезированных белков и оценить эффективность их применения в качестве вакцин.
Для оценки возможности применения синтезированных белков в качестве компонентов тест-систем будет использована реакция диффузионной преципитации (РДП). Этот метод основан на способности к диффузии в гелях антител и растворимых антигенов. При их взаимодействии образуются комплексы, которые не обладают способностью диффундировать в толще агарового геля и выпадают в осадок в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если антитела не специфичны к диффундирующим антигенам, то полоса преципитации не образуется. Будут использованы наборы Биотест – РДП, в которых положительный антиген вируса ИББ будет заменен на синтезированные белки. Отдельно будет проведена оценка возможности использования синтезированных белков в качестве положительного контроля при проведении экспериментов с применением ИФА.
Основываясь на результатах, полученных для белков вируса ИББ, аналогичные исследования будут проведены для белков вирусов, вызывающих болезнь Ньюкасла и геморрагический энтерит индеек.
2)В ходе второй части проекта будет проведен синтез различных адъювантов и изучено их влияние на иммуногенность белков вирусов.
В качестве исследуемых адъювантов планируется использовать белки-иммуномодуляторы и бактериальные антигены. Коллективом авторов ранее получены штаммы дрожжей P. pastoris синтезирующие модифицированный куриный гамма интерферон. Также с помощью дрожжей P. pastoris будет проведен синтез других белков - иммуномодуляторов интерлейкинов 2 и 7 курицы (ИЛ-2 и ИЛ-7), а также бактериального антигена – флагеллина бактерий Salmonella typhimurium.
Сначала будет проведена оптимизация кодонов для повышения эффективности синтеза выбранных белков в дрожжах P. pastoris. Будет заказан и проведен искусственный синтез генов, кодирующих ИЛ-2 и ИЛ-7 курицы и флагеллин S. typhimurium. С использованием подходов, описанных ранее на примере синтеза фрагментов белков вируса ИББ, будут получены штаммы P. pastoris синтезирующие ИЛ-2, ИЛ-7 и флагеллин. Полученные белки будут очищены и использованы в качестве адъювантов при вакцинации куриц. С помощью метода ИФА будет определено влияние их добавления на иммуногенность белков, синтезированных на первом этапе.
Отдельно будет изучена возможность использования в качестве адъюванта плазмид, богатых CpG олигонуклеотидными последовательностями. Для этого будут сконструированы бактериальные плазмиды, содержащие ориджин репликации (pUC19), селективный маркер (ген бета-лактамазы) и последовательности из повторяющихся CpG нуклеотидов различной длины. Плазмиды будут размножены в бактериях Escherichia coli, выделены и использованы в качестве адъювантов при вакцинации куриц.
3)Основываясь на результатах первых этапов проекта, будет проведена оптимизация синтеза и очистки наиболее иммуногенных белков вирусов и адъювантов. При этом будет использован огромный потенциал дрожжей P. pastoris как системы синтеза рекомбинантных белков.
В составе векторов экспрессии на основе плазмиды рPICZalphaA в последовательность альфа-фактора, обеспечивающего секрецию, будет методом сайт-направленного мутагенеза внесена делеция (описанная в работе [7]), приводящая к повышению эффективности секреции рекомбинантных белков. Также с помощью методов направленного мутагенеза будут получены плазмиды, в которых последовательность, соответствующая альфа-фактору, будет заменена на сигнальную последовательность кислой фосфатазы (КФ). Ранее нами была продемонстрирована возможность эффективного использования сигнальной последовательности КФ Pho5 для обеспечения секреции рекомбинантных белков дрожжами P. pastoris [8]. С использованием этих плазмид будут получены штаммы P. pastoris. С помощью методов электрофореза в денатурирующих условиях, Вестерн-блот гибридизации и ИФА будет измерено содержание рекомбинантных белков в культуральной среде, что позволит сравнить и эффективность сигналов секреции.
Наиболее эффективные экспрессионные кассеты будут дополнительно клонированы в вектор экспрессии pPIC9 и полученный ранее коллективом авторов вектор pPICNeo. При работе с плазмидами, производными рPICZalphaA, в качестве селективного маркера используется ген устойчивости к антибиотику – зеоцину. Плазмиды на основе векторов pPIC9 и pPICNeo будут содержать другие маркеры – ген HIS4 и ген устойчивости к антибиотику генетицину. Их получение позволит интегрировать в геном штаммов P. pastoris сразу три экспрессионных кассеты, что существенно увеличит эффективность синтеза целевых белков.
Одновременно с этим будет получена плазмида, содержащая кодирующую последовательность гена MXR1 под контролем промотора гена АОХ2. В работе [9] было показано, что повышение уровня синтеза транскрипционного фактора Mxr1p, являющегося ключевым регулятором генов метаболизма метанола, приводит к значительному повышению активности промотора АОХ1. В качестве селективного маркера в данную плазмиду будет добавлен ген устойчивости к бластицидину. Поскольку используемые экспрессионные кассеты содержат промотор гена АОХ1, трансформация штаммов P. pastoris дополнительной конструкцией с геном MXR1 приведёт к увеличению уровней синтеза целевых белков.
Для полученных штаммов дрожжей P. pastoris, обеспечивающих эффективный синтез целевых белков, будет проведена оптимизация условий культивирования в больших объёмах. При этом будут использованы ферментеры Biostat В+ (Sartorius) объёмом 5 л. Также будут отработаны методики эффективного концентрирования и очистки больших количеств синтезируемых белков. Для этого буду использованы методы ультрафильтрации, осаждения белков и ионобменной хроматографии.
Если эксперименты покажут эффективность применения в качестве адъюванта плазмид, богатых CpG олигонуклеотидными последовательностями, будут оптимизированы методики синтеза и очистки этих плазмид в больших количествах. Ранее коллектив авторов заявки принимал участие в работе по получению и исследованию композитных сорбентов на основе оксометаллатов титана, содержащих разные биоактивные амины. Эти сорбенты способны необычайно эффективно сорбировать нуклеиновые кислоты независимо от присутствия белков, что будет использовано в предлагаемом проекте для очистки больших количеств целевых плазмид.
4)В ходе следующей части проекта будет впервые проведено исследование возможности применения методик дрожжевого дисплея при вакцинации птиц. Для этого в составе экспрессионных кассет в одну рамку считывания с последовательностями, кодирующими фрагменты белков вирусов, будут добавлены последовательности, которые обеспечат закрепление синтезируемых белков на клеточной стенке дрожжей. В качестве якоря в первую очередь будет использована последовательность альфа-агглютинина дрожжей S. cerevisiae. Промотор гена АОХ1 в составе кассет будет заменен на промотор гена GAP1. Это обеспечит конститутивный синтез рекомбинантных белков в дрожжах P. pastoris без необходимости использовать метанол при культивировании. Для того чтобы подтвердить закрепление целевых белков на поверхности клеток, будут использованы методики выделения белков стенок дрожжей, электрофореза в денатурирующих условиях и Вестерн-блот гибридизации.
После культивирования штаммов P. pastoris, экспонирующих вирусные белки на своей поверхности, их клетки будут собраны центрифугированием и подвергнуты температурной обработке. Инактивированные клетки будут использованы в экспериментах по иммунизации птиц. Биомасса клеток будет даваться курицам перорально, а также вводиться с помощью подкожной инъекции. В результате исследования будут определены титры антител, специфичных к белкам вирусов, что позволит исследовать иммуногенность препаратов штаммов P. pastoris, экспонирующих вирусные белки, и оценить возможность их применения в качестве вакцин.
5)Действие на птиц различных стрессовых факторов приводит к подавлению иммунной системы, снижению устойчивости птиц к заболеваниям. В ходе предлагаемого проекта в качестве средств поддержания и защиты иммунной системы птицы будут получены трансгенные растения, синтезирующие белки-иммуномодуляторы.
Ранее авторами заявки были получены трансгенные растения табака, синтезирующие бычий гамма-интерферон под контролем 35S промотора, который обладал биологической активностью [10]. Для гетерологичных белков, синтезируемых в организмах-продуцентах, важно сохранение функциональной активности, которая зависит от правильной укладки, посттрансляционных модификаций и стабильности. Гетерологичные белки могут расщепляться внутриклеточными протеазами, протеазами, участвующими в процессинге белков. В связи с этим остро стоит проблема повышения их протеолитической стабильности. Один из путей её повышения - удаление потенциальных сайтов протеолиза. Для этого нами ранее были получены модифицированные гены куриного гамма-интерферона с делецией в 3’конце, приводящей к отсутствию кластера основных аминокислот, узнаваемых протеазами [11]. В ходе выполнения проекта будут разработаны системы экспрессии нативного и модифицированных генов гамма-интерферона курицы на основе растений люцерны под контролем конститутивного (35S) промотора. Разработка системы экспрессии подразумевает конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих исследуемые гены под контролем конститутивного промотора, получение штаммов бактерий (Agrobacterium tumefaciens), используемых непосредственно для трансформации растений, дальнейшую селекцию трансгенных растений и идентификацию целевых генов и белков. Структура рекомбинантных плазмид будет проанализированы при помощи рестрикционного анализа, ПЦР и секвенирования. Способность трансформированных растений синтезировать целевые белки будет доказана при помощи электрофоретического и иммунохимического анализа.
Будут получены семена трансгенных растений, осуществлена проверка наследования гена куриного гамма-интерферона и отбор наиболее продуктивных форм с целью получения гомозиготных линий растений-продуцентов. Будут исследованы стабильность и биологическая активность рекомбинантного гамма-интерфероны курицы, выделенного как из сырой растительной массы, так и из подвергшейся высушиванию или замораживанию. Для оценки активности рекомбинантного интерферона будет использован метод ОТ-ПЦР в реальном времени. Культуры клеток первичных фибробластов курицы (КЭФ) будут культивированы в присутствии препаратов синтезированного рекомбинантного интерферона, после чего с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени будет исследована активность интерферонзависимых генов.
В качестве генов мишеней будут использованы гены, индуцируемые в ответ на интерфероны: ген дцРНК-зависимой протеинкиназы (PKR), ген 2'-5'-олигоаденилатсинтетазы (OASL) и ген MX1. дцРНК-зависимая протеинкиназа служит посредником при активации транскрипции интерферонзависимых генов [12], 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза осуществляет синтез олигоаденилатов с необычной 2'-5'-фосфодиэфирной связью, которые активируют латентную эндорибонуклеазу L, катализирующую деградацию как вирусной, так и клеточной РНК, что приводит к ингибированию белкового синтеза в зараженных вирусом клетках. Ген MX1 кодирует интерферон-индуцируемую ГТФ-азу. При заражении клетки белок Мх1 связывается с одной из субъединиц вирусной полимеразы, блокируя репликацию вируса. Оценка уровня экспрессии гена MX1 человека используется в клинических исследованиях в качестве маркера дифференциации вирусных и бактериальных инфекций [13]. Ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) будет использован в качестве референсного.
Исходя из полученных результатов, будет исследована возможность применения препаратов трансгенных растений для стимулирования иммунной системы куриц. Будут получены препараты растительной массы, а также очищенный из растений гамма-интерферон. Цыплята породы Lohmann brown будут получать эти препараты в качестве кормовой добавки. Далее с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени у цыплят будет исследована активность интерферонзависимых генов в клетках крови, тонкого кишечника и селезенки.

1.Alkie T.N., Rautenschlein S. Infectious bursal disease virus in poultry: current status and future prospects. Vet Med (Auckl). 2016 Jan 19;7:9-18. doi: 10.2147/VMRR.S68905. eCollection 2016.
2.Taghavian O, Spiegel H, Hauck R, Hafez HM, Fischer R, Schillberg S. Protective oral vaccination against infectious bursal disease virus using the major viral antigenic protein VP2 produced in Pichia pastoris. PLoS One. 2013 Dec 20;8(12):e83210. doi: 10.1371/journal.pone.0083210. eCollection 2013.
3.Ahmad M, Hirz M, Pichler H, Schwab H. Protein expression in Pichia pastoris: recent achievements and perspectives for heterologous protein production. Appl Microbiol Biotechnol. 2014 Jun;98(12):5301-17. doi: 10.1007/s00253-014-5732-5. Epub 2014 Apr 18.
4.Tsygankov M.A.; Zobnina A.E., Padkina M.V. Synthesis of recombinant gamma interferons resistant to proteolysis in the yeast Pichia pastoris //Applied Biochemistry and Microbiology.- 2014. – V. 50. – P. 279-285
5.Градобоева А.Е., Падкина М.В. Изучение влияния продукции гетерологичного белка на физиологическое состояние дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. // Вестн. С.-Петерб. Ун-та. - 2008. - Сер.3, Вып.2. - С.58-63.
6.М.В. Падкина, Л.В. Парфенова, А.Е. Градобоева, Е.В. Самбук. Синтез гетерологичных интерферонов в клетках дрожжей Pichia pastoris. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т.46. - №4. – С.448-455.
7.Lin-Cereghino GP, Stark CM, Kim D, Chang J, Shaheen N, Poerwanto H, Agari K, Moua P, Low LK, Tran N, Huang AD, Nattestad M, Oshiro KT, Chang JW, Chavan A, Tsai JW, Lin-Cereghino J. The effect of α-mating factor secretion signal mutations on recombinant protein expression in Pichia pastoris. Gene. 2013 May 1;519(2):311-7. doi: 10.1016/j.gene.2013.01.062. Epub 2013 Feb 21.
8.Rumiantsev A.M., Padkina M.V., Sambuk E.V., 2013. Effect of nitrogen source on gene expression of first steps of methanol utilization pathway in Pichia pastoris // Genetika. Vol. 49. P. 454–460.
9.Chang CH, Hsiung HA1, Hong KL1, Huang CT Enhancing the efficiency of the Pichia pastoris AOX1 promoter via the synthetic positive feedback circuit of transcription factor Mxr1. BMC Biotechnol. 2018 Dec 27;18(1):81. doi: 10.1186/s12896-018-0492
10. Burlakovskiy M.S., Saveleva N.V., Yemelyanov V.V., Padkina M.V., Lutova L.A. Production of bovine interferon-gamma in transgenic tobacco plants // J. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2015. V.122. Is.3. P.685-697. Q1.
11.Цыганков М.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Синтез модифицированных, устойчивых к протеолитической деградации интерферонов-гамма в дрожжах Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т.50. № 4. С.429-436
12. Okumura FI, Okumura AJ, Uematsu K et.al. // J Biol Chem. 2013. 288(4). P. 2839-2847.
13. Verhelst J, Hulpiau P, Saelens X. // Microbiol Mol Biol Rev. 2013. 77(4). P.551-66.

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту

Коллективом авторов уже получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие полноразмерный секреторный белок VP2 вируса ИББ, и показана возможность его применения для вакцинации птиц. Для этого из вирусных частиц ИББ была выделена РНК, проведен синтез кДНК, после чего была амплифицирована и клонирована последовательность, кодирующая белок VP2. Полученная последовательность была встроена в плазмиду рPICZalphaA. При этом в рамку считывания были добавлены последовательность альфа-фактора, обеспечивающего секрецию, а также последовательности c-myc эпитопа и 6xHis-метки. Плазмидой был трансформирован штамм GS115 дрожжей P. pastoris.
Синтез и секреция целевых белков у полученных трансформантов были подтверждены с помощью методов электрофореза в денатурирующих условиях и Вестерн-блот гибридизации с антителами, специфичными к c-myc эпитопу. Среду после культивирования, содержащую рекомбинантный белок концентрировали, стерилизовали фильтрованием и использовали для иммунизации цыплят породы Lohmann brown. Через 30 дней определяли иммуногенность рекомбинантных белков для чего кровь цыплят исследовали с помощью набора ИФА производства BioChek.
Было показано, что в опытной группе, иммунизованой концентратом среды, содержащим рекомбинантный белок VP2, титры антител были в среднем 1:500, что говорит о том, что цыплята иммунны к вирусу инфекционной бурсальной болезни. В контрольной группе антител к белку VP2 не выявили.
Ранее кДНК структурного гена куриного интерферона-гамма (ИФН-γ) была клонирована в составе вектора, обеспечивающего продукцию и секрецию рекомбинантного белка клетками дрожжей P. pastoris. Однако полученный интерферон был подвержен протеолитической деградации, возможно, обусловленной наличием нескольких потенциальных сайтов узнавания трипсиноподобными протеазами [1]. Для предотвращения деградации авторами заявки были синтезированы модифицированные варианты ИФН-γ, менее подверженные протеолизу [2]. В экспериментах, проведённых на культурах клеток первичных фибробластов курицы (КЭФ), с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени была исследована экспрессия интерферонзависимых генов при добавлении модифицированных рекомбинантных интерферонов в среду. Было показано, что активность модифицированных вариантов ИФН-γ не отличается от таковой у нативного белка. При этом полученные варианты ИФН-γ были гораздо более стабильны.
Выявленные модифицированные варианты ИФН-γ будут использованы для получения трансгенные растения, синтезирующие белки-иммуномодуляторы. Авторы заявки имеют большой опыт подобных работ - ранее были получены трансгенные растения табака, синтезирующие бычий гамма-интерферон под контролем 35S промотора, который обладал биологической активностью [3].
Для проведения дрожжевого дисплея авторами заявки была амплифицирована и клонирована последовательность альфа-агглютинина дрожжей S. cerevisiae.
Таким образом, коллектив авторов заявки имеет большой опыт применения дрожжей и растений для синтеза различных рекомбинантных белков. Авторами уже получены штаммы дрожжей, синтезирующие иммуногенный рекомбинантный белок VP2 и стабильные варианты куриного ИФН-γ. С их использованием были освоены основные методики анализа активности рекомбинантных антигенов и белков иммуномодуляторов, которые будут применены в данном проекте.

1.М.В. Падкина, Л.В. Парфенова, А.Е. Градобоева, Е.В. Самбук. Синтез гетерологичных интерферонов в клетках дрожжей Pichia pastoris. // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т.46. - №4. – С.448-455.
2.Цыганков М.А., Зобнина А.Е., Падкина М.В. Синтез модифицированных, устойчивых к протеолитической деградации интерферонов-гамма в дрожжах Pichia pastoris // Прикладная биохимия и микробиология. 2014. Т.50. № 4. С.429-436
3.Burlakovskiy M.S., Saveleva N.V., Yemelyanov V.V., Padkina M.V., Lutova L.A. Production of bovine interferon-gamma in transgenic tobacco plants // J. Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC). 2015. V.122. Is.3. P.685-697. Q1.

Детальный план работы на первый год выполнения проекта

1.Будет проведен подробный биоинформатический анализ последовательностей и доступных структур белков VP2 и VP3 вируса ИББ. Будут определены консервативные и вариабельные элементы их поверхностей.
2.Выбранные фрагменты белков вируса VP2 и VP3 вируса ИББ будут синтезированы с использованием дрожжей P. pastoris.
3.Эквивалентными количествами синтезированных белков будет проведено вакцинирование птиц. С помощью метода ИФА будут определены титры антител, специфичных к белкам вируса ИББ и определена напряженность иммунитета в группах привитых кур.
4.Для эффективного синтеза наиболее иммуногенных фрагментов белков VP2 и VP3 будут получены модифицированные штаммы дрожжей P. pastoris. Будет проведена оптимизация условий синтеза и очистки белков в больших объёмах.
5.С использованием реакции диффузионной преципитации будет оценена возможность применения синтезированных белков в качестве компонентов тест-систем.
6.С использованием методик дрожжевого дисплея будут получены штаммы дрожжей P. pastoris, экспонирующие на поверхности иммуногенные фрагменты белков VP2 и VP3.
7.С использованием этих штаммов будет проведено вакцинирование птиц. С помощью метода ИФА будут определены титры антител, специфичных к белкам вируса ИББ и определена напряженность иммунитета в группах привитых кур.
8.Будут получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие ИЛ-2 и ИЛ-7 курицы и флагеллин S. typhimurium
9.Будут получены вектора для трансформации растений с использованием генетических последовательностей птичьего гамма-интерферона, измененных для повышения устойчивости к протеолитической деградации.
10.Будут созданы штаммы Agrobacterium tumefaciens,несущие указанные плазмиды.
11. Будет проведена агробактериальная трансформация растений люцерны.

Ожидаемые научные и научно-технические результаты

В предлагаемом проекте будут получены штаммы дрожжей P. pastoris, синтезирующие высокоиммуногенные рекомбинантные антигены вирусов ИББ, НБ курицы и ГЭ индеек. В отличие от предшествующих работ в данном проекте будет использован весь огромный потенциал дрожжей P. pastoris как системы синтеза рекомбинантных белков. Полученные штаммы будут содержать несколько экспрессионных кассет, оптимальные сигнальные последовательности и промоторы. Такой подход обеспечит высокую эффективность синтеза целевых белков. С использованием ферментеров в данном проекте будут отработаны условия синтеза рекомбинантных антигенов в больших объёмах, что необходимо для их последующего промышленного производства.
Промышленное использование штаммов, которые будут получены в данном проекте, перспективно ещё и в связи с тем, что синтезируемые рекомбинантные антигены можно использовать в качестве компонентов тест-систем. Также будут получены штаммы, синтезирующие ИЛ-2 и ИЛ-7 курицы и флагеллин S. typhimurium, которые можно будет использовать в качестве адъювантов.
В предлагаемом проекте будут впервые использованы методы дрожжевого дисплея для получения вакцин против вирусов ИББ, НБ и ГЭИ. В случае эффективности такого подхода, получаемые вакцины будут необычайно дёшевы и просты в производстве. Для их получения потребуется только культивировать клетки штаммов P. pastoris, собрать их центрифугированием, инактивировать и лиофилизовать.
Впервые будут получены трансгенные растения люцерны, синтезирующие рекомбинантный птичий гамма-интерферон, устойчивый к протеолизу. Эти растения можно будет использовать в качестве иммунопробиотической кормовой добавки.

Планируемый объем дополнительно привлеченных средств из внешних по отношению к СПбГУ источников за весь период выполнения проекта
Планируется привлечение из внешних источников в объёме 100% (2 млн. руб., гранты РНФ, РФФИ).