[1] Научная проблема, на решение которой направлен проект:
Основной задачей (проблемой) является создание и исследование наноразмерных (2-10нм) объектов на основе комплексов и коньюгатов пептидных дендримеров с фуллеренами и их производными, которые будут обладать улучшенными биомедицинскими свойствами по сравнению с пептидными дендримерами и фуллеренами.
Также в рамках проекта будет исследована фундаментальная проблема построения теории деинкапсуляции полезного вещества из дендримера, которая в настоящее время отсутствует.
Решение поставленных задач откроет новые перспективы создания лекарственных средств, в том числе противоопухолевых, и более широкого применения дендримеров для их доставки.

[2] Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов:
Научная новизна основной поставленной задачи состоит в синтезе (или создании) и исследовании новых структур, состоящих из лизинсодержащих дендримеров и производных фуллерена, представляющих интерес для биомедицинских приложений. В настоящее время древовидные макромолекулы практически не используются для модификации фуллеренов, а пептидные дендримеры не использовались совсем. Однако это наиболее эффективный способ получить водорастворимую монодисперсную производную фуллерена, которая будет лишена ряда недостатков, присущих фуллеренам и его наиболее распространенным производным (например, карбоскифуллеренам и фуллеренолам): (i) отсутствие агрегации, (ii) малый размер (2-10 нм), (iii) улучшенная проникающая способность через клеточную мембрану. Более того, в некоторых случаях можно ожидать синергетического эффекта от воздействия фуллереновой наночастицы и пептидного дендримера (например, на раковые клетки).
Важно отметить, что к научной новизне стоит отнести использование комплексного подхода, который подразумевает тесную кооперацию между учеными из различных областей науки.
Обоснование достижимости решения поставленной задачи (задач) и возможности получения запланированных результатов:
В данном проекте планируется использовать ранее изученные нами лизинсодержащие дендримеры, подходящие для решения поставленной задачи. Участники коллектива имеют большой опыт синтеза фуллеренов. Для методик синтеза коньюгатов и создания комплексов, была проведена предварительная проверка. Также коллектив имеет большой опыт экспериментальных и теоретических исследований многокомпонентных полимерных систем (в том числе с включением наночастиц). Это позволяет утверждать, что запланированные ЯМР и МУРР исследования будут выполнены в полном объеме и предоставят необходимые данные. С учетом предыдущего опыта, синтез, экспериментальные, теоретические исследования методом атомистического молекулярно-динамического моделирования коньюгатов и комплексов дендримеров с фуллернами и их производными не вызовут проблем для коллектива Проекта. Цитологические исследования этих коньюгатов и комплексов будут проведены с привлечением Ресурсного центра ОМРБ (НИЦ “КИ” – ПИЯФ), сотрудники которого имеют богатый опыт исследований действия лекарственных препаратов на различные линии раковых клеток.
Таким образом, участники коллектива обладают достаточным опытом проведения совместных научных исследований по всем указанным областям и публикации результатов в высокорейтинговых журналах, например, в рамках предыдущего РНФ проекта (2019-2021) под руководством руководителя данного Проекта.

[3] Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
I. Дендримеры
Дендримеры являются новым классом регулярно ветвящихся полимерных молекул, имеющих сферически симметричную структуру и большое количество концевых групп доступных для функционализации. Дендримерные молекулы обладают высокой способностью проникать сквозь клеточные мембраны и транспортировать лекарственные препараты, которые могут быть физически адсорбированы на дендримере или химически пришиты к нему (обычно к его терминальным группам или центру). Дендримеры принадлежат к группе наноносителей, которые обладают улучшенной растворимостью в воде, фармакодинамикой (сила и длительность воздействия), фармакокинетикой (время циркуляции, всасывание, распределение в тканях и органах) и биодоступностью препаратов [1–5].
Еще в конце 1970-х - начале 1980-х годов, с момента синтеза первых дендримеров было предсказано их биомедицинское использование (см., например, Denkewalter для полилизиновых дендримеров [6] и Tomalia для полиамидоаминных (ПАМАМ) дендримеров [7]). В начале 1990-х годов открылись перспективы использования дендримеров в качестве лекарственных препаратов. В середине 1990-х было показано, что дендримеры могут быть использованы в качестве имитации антител и сенсорных функциональных агентов, а также для выявления и количественного определения вируса СПИД [8]. В настоящее время дендримеры имеют множество применений благодаря своей функциональной и структурной универсальности. Дендримеры подвергаются модифицированию для обеспечения транспортировки и целенаправленной доставки лекарств. Также они могут быть использованы в биомедицине для фотодинамической терапии, доставки генов и ми-РНК, конъюгации олигонуклеотидов, и контрастной визуализация, а также в фармацевтике, биофармации, иммунологии и т.д. (например, см. обзоры [1,9–34]).
Однако, токсичность различных дендримеров, ограничивающая их применение в биомедицине, привела к разработке различных стратегий по ее снижению [24]. Например, положительный заряд периферии ПАМАМ дендримера отвечает за его цитотоксичность, которую можно понизить нейтрализацией заряда путем пегилирования, ацетилирования, а также с помощью модификации пептидами [25].
Среди биологически совместимых дендримеров важным классом являются пептидные дендримеры, состоящие из аминокислотных остатков, соединенных амидными связями, и содержащих как α-пептиды, так и ε-пептиды. Наиболее известными представителями этого класса являются лизиновые дендримеры (в состав которых входят только аминокислотные остатки лизина) и лизинсодержащие дендримеры (у которых сегмент между точками ветвления содержит два или более линейных аминокислотных остатка, но древовидное ветвление происходит только на лизине).
Создание лекарств на основе лизиновых дендримеров подтверждается фармакологическими исследованиями [35–39], в которых отмечается, что преимуществом пептидных дендримеров является их безопасность в следствие биоразлагаемости, низкой цитотоксичности и синергетического эффекта, обусловленного действием самого дендримера, поскольку пептидная дендримерная матрица обладает противомикробной [40–44] и антиангиогенной активностью [35,45–48]. Дендримерные лизиновые носители могут быть полезны в области лечения раковых заболеваний, заболеваний сердечно-сосудистой и опорно-двигательной системы, воспалений, диабета, слабоумия, отравления фосфорорганическими веществами, а также могут применяться в качестве вакцин [49]. Недавно был одобрен медицинский препарат VivaGel BV производимый компанией Starpharma против бактериального вагиноза на основе модифицированного лизинового дендримера. Также появились первые работы, в которых представлены перспективы применения комплексов пептидных дендримеров с миРНК-пептидами в качестве антивирусных препаратов, предназначенных для ингаляционного лечения пациентов с COVID-19 [27]. Кроме того, эффективность дендримеров в сочетании с другими передовыми методологиями и технологиями показала, что такие проблемы, как масштабное производство и высокие затраты, не будут препятствовать перспективному будущему использованию дендримеров на основе лизина [50]. Отметим, что другие пептидные древовидные макромолекулы, такие как дендриграфты и гиперразветвленные полимеры, также имеют хорошие перспективы для создания антивирусных и антибактериальных препаратов [51].
Дендримеры, возможно, являются одними из наиболее перспективных наноструктур для лечения нарушений центральной нервной системы благодаря своим структурным особенностям [52]. При лечении рака мозга с помощью химиотерапии большой проблемой является наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), который существенно осложняет доставку лекарственных препаратов в мозг. Инкапсуляция химиотерапевтических агентов и активных терапевтических генов в различные дендримеры (ПАМАМ, пропилениминных (ППИ) и лизиновых дендримеров) позволяет эффективно доставлять лекарства через ГЭБ [47]. Однако, токсикологические аспекты доставки требуют тщательной клинической оценки. Менее токсичные лизиновые дендримеры обладают в этом плане неоспоримым преимуществом.
Пептидные дендримеры используются для создания противораковых препаратов. Результаты последних исследований и клинических испытаний комплексов пептидных дендримеров с лекарственными противораковыми препаратами представлены в недавнем обзоре [48]. Здесь важно отметить участие коллектива Проекта в цитологических исследованиях пептидных дендримеров [53,54]. Было продемонстрировано, что пептидные лизинсодержащие дендримеры имеют высокую избирательную токсичность по отношению к раковым клеткам, являясь малотоксичными по отношению к нормальным клеткам [53]. Было показано, что пептидные дендримеры могут служить перспективными наноносителями для лекарств противоопухолевой терапии, обеспечивая синергетический эффект действия самого дендримера и переносимого им лекарственного препарата или генетического материала по отношению к раковым клеткам и снижая взаимодействие носителя и переносимых им препаратов со здоровыми тканями [54].

II. Фуллерены и фуллереновые производные для биомедицинских приложений
С момента своего открытия фуллерены стали одними из самых узнаваемых молекул. “Прекрасная молекула”, описанная Харольдом У. Крото, украсила обложки многих учебников и даже появилась на киноэкране. Физические и химические свойства фуллеренов вызвали большой интерес в научном сообществе в связи с обширными возможностями для разработки новых направлений научных исследований. Трудности использования фуллеренов для биомедицинских приложений, как правило, вызваны проблемами, связанными с их растворимостью и/или агрегацией. Для решения этих проблем использовались различные производные фуллерена.
Вскоре после открытия фуллеренов начались исследования возможности их применения в разработке лекарственных препаратов [55,56]. Так, 4,4’-бис{[2-(2-карбоксиэтилукарбониламиноэтилфенил}-(3’Н-циклопропа[1,9(1,-Сво)[5,6 фуллерен] способен блокировать гидрофобную полость протеазы ВИЧ. С тех пор число работ, посвященных изучению биологической активности фуллерена, выросло многократно: в настоящее время ежегодно публикуются тысячи статей по этой тематике.
Биологическая активность фуллеренов, как и соединений любого другого класса, определяется физическими, химическими и топологическими свойствами молекул. Одним из наиболее важных физических свойств молекул фуллерена является их способность превращать молекулы триплетного кислорода в различные активные формы кислорода. К основным химическим свойствам относятся ненасыщенная природа молекул фуллерена, что делает их активными ловушками свободных радикалов. Кроме того, молекулы фуллерена могут образовывать ковалентные связи и супрамолекулярные конъюгаты с молекулами разных типов, в том числе с полимерами. Еще одним критически важным свойством молекулы фуллерена, отличающим ее от большинства других органических соединений, является наличие внутренней полости, в которую можно поместить отдельные атомы или группы атомов. Эндоэдральные фуллерены могут оказаться очень полезными при разработке контрастных агентов для различных видов томографии.
Учитывая огромное количество работ, посвященных фуллеренам и их производным, мы сфокусируемся на свойствах фуллеренов и их производных, которые, по нашему мнению, могу быть улучшены с помощью дендримерного наноконтейнера или давать синергетический эффект.
Свойства фуллеренового каркаса (например, липофильность) могут играть решающую роль во взаимодействии фуллерена и его производных с биологическими объектами in vitro и in vivo (например, см. обзор [57]). Производные фуллеренов обладают антивирусными [58–60], антимикробными и бактерицидными действиями [61,62]. Например, карбоксифуллерен - в концентрации 10 мкмоль/л ингибирует вирус Dengue-2 при освещении, т.е. по фотохимическому механизму, включающему образование синглетного кислорода или других активных форм кислорода. Более того, соединение обладает и темновым противовирусным действием – в концентрации 40 мкмоль/л оно практически полностью подавляет репликацию [59]. Однако, важно отметить, что мембранотропные свойства молекул фуллерена проявляются только при низкой степени их агрегации.
Фотодинамическая терапия является одной из возможных областей использования фуллеренов. Преимуществами данного метода терапии являются нехирургический и минимально инвазивный подход, который используется при лечении доброкачественных и злокачественных опухолей [63]. Фуллерены С60 и С70, а также их производные способствуют увеличению концентрации активных форм кислорода в клетках. В биологических системах эти вещества являются окислителями [64] и индуцируют апоптоз [65]. Поэтому они могут быть использованы в качестве соединений-лидеров при разработке противовирусных и противоопухолевых лекарственных препаратов [66–68].
Достаточно широко исследовались и фотодинамические свойства фуллерена С70. Сравнение фотодинамической активности фуллеренов С60 и С70, инкапсулированных в липосомы, которые были приготовлены из димиристоилфосфатидилхолина, в отношении клеток HeLa показало, что активность С70 в пять раз превышала активность С60. Это различие было объяснено улучшенным спектром поглощения первого [69].
Важно отметить, что исследованный нами ранее лизиновый дендример Lys-2Lys показал высокую селективную активность в отношении клеток HeLa [53]. Активность коньюгатов данного дендримера с фуллеренами С60 и С70 и их производными может существенно увеличиться за счет их совместного действия, что может привести к появлению синергетического эффекта. Поэтому синтез и исследование данных макромолекул является одной из важнейших задач данного Проекта.
Известно, что агрегация фуллеренов/фуллеренолов приводит к ослаблению их фотосенсибилизирующих свойств. Однако, только агрегация, экранирующая сам фуллереновый каркас приводит к ослаблению этих свойств. Агрегация же всей сополимерной субъединицы может и не сказываться на фотосенсибилизирующей способности данного соединения при условии, что вблизи фуллеренового каркаса имеется достаточное количество кислорода, а сам фуллерен доступен для квантов света.
Например, показано, [70] что сополимер фуллерена и акриламида может образовывать частицы со средним диаметром порядка 46 нм. Образование “наношаров” не влияет на фотодинамическую активность фуллерена, указывая на то, что агрегация не вызывает экранирования фуллеренового каркаса и связана с полимерной системой. Модификация фуллерена С60 полисахаридом пуллулан приводит к образованию эффективного фотодинамического противоопухолевого средства [71,72].
Еще одним перспективным направлением использования производных фуллерена является разработка противоопухолевого средства для химиотерапии на основе фуллеренола, содержащего внутри атом гадолиния (т.е. эндометаллофуллеренол (ЭМФ) с атомом Gd). Так, в экспериментах на мышах показана высокая противоопухолевая активность Gd@C82(OH)22 в дозе 10-7 моль/кг [73]. Частицы [Gd@C82(OH)22]n имели диаметр ~ 22 нм в физиологическом растворе. При проведении тестов in vitro и in vivo установлено, что, будучи практически нетоксичными, эти частицы подавляют рост опухоли, препятствуя инвазии опухоли в нормальную мышечную ткань. Иными словами, наночастицы Gd@C82(OH)22 не убивают клетки опухоли непосредственно; это резко контрастирует с действием обычных противоопухолевых препаратов. Механизм противоопухолевого действия в настоящее время неясен. Согласно результатам недавно проведенных исследований, фактическое действие наночастиц Gd@C82(OH)22 может включать повышение иммунитета (подробнее см. в работе [74]). Ряд других интересных свойств наночастиц Gd@C82(OH)22 описан в работе [75]. Высказано также предположение, что, если бы в руках онкологов были производные фуллерена с подходящим образом модифицированной поверхностью, их мечта разработать сильнодействующее малотоксичное противораковое средство могла бы стать явью [73].
Производные ЭМФ, например, с атомом Gd являются, также перспективными макромолекулярными контрастными агентами для магнитно-резонансной томографии (МРТ) [76,77]. Другими славами, на основе Gd@C82(OH)n могут быть созданы тераностические препараты, которые будут обладать как диагностическими, так и терапевтическими свойствами. Углеродный каркас этих молекул защищает атом металла (или группу атомов) от внешнего окружения. Поэтому инкапсулированные атомы металла не взаимодействуют с биологическим окружением, не участвуют в биохимических реакциях в организме и, следовательно, не проявляют токсичность [78].
Как уже отмечалось выше, изучение биологической активности фуллеренов и их производных осложняется их высокой склонностью к ассоциации, образованию агрегатов даже для водорастворимых производных фуллеренов за счет гидрофобных частей молекулы. В то же время хорошо известно, что как физико-химические, так и биологические свойства фуллеренов могут существенно влиять на развитие и выраженность биологического ответа [79]. Одним из следствий агрегации является принципиально разное взаимодействие с биологическими структурами отдельных молекул и образованных из них наночастиц вследствие не только различия в свойствах, но и просто вследствие разных размеров. Молекулярные размеры фуллерена вполне биологичны. Например, молекула фуллерена С60 имеет размер 1 нм, что весьма привлекательно с точки зрения биологии. Но это справедливо лишь для отдельных молекул, поскольку в агрегированном состоянии они представляют собой уже наночастицы. Так, небольшие размеры молекулы фуллерена позволяют ей встроиться в молекулу сывороточного альбумина человека (HSA), имеющую размер 8.0 х 3.8 нм [80,81]. Однако совершенно иначе ведут себя наночастицы – наночастицы С60 (nano- С60), которые в водной суспензии адсорбируют молекулы НSА на своей поверхности, при этом молекула белка меняет свою конформацию [82]. Это вызвано тем, что размеры агрегатов намного больше размеров отдельного фуллерена: в частицах фуллерита (кристаллическое состояние фуллерена) от 200 до 1000 нм и более [83] и от 50 до 600 нм в коллоидных дисперсиях [84].
Настоящий Проект направлен на решение проблемы агрегации фуллеренов: планируется использовать дендримерную капсулу (наноконтейнер), которая будет препятствовать образованию фуллереновых агрегатов.
Для того чтобы достичь приемлемой для биологических исследований растворимости производных фуллерена в воде, необходимо ввести в него как минимум три ионогенные группы [85]. Одним из возможных решений является синтез производных фуллерена дендримерного типа [86] – соединений, содержащих один (или несколько) разветвленных аддендов, включающих в себя, в свою очередь, несколько полярных групп. При этом увеличение числа полярных групп достигается не столько увеличением количества введенных аддендов, сколько количеством полярных групп в каждом из них.
Производные фуллерена, не обладающие цитотоксичностью и поглощающиеся клетками, были применены в качестве носителя для противоракового средства паклитаксела и подавляли рост клеток линии MCF-7 рака молочной железы человека [87]. Для обеспечения целенаправленной доставки противоопухолевого препарата доцетаксела (DTX) был создан дендримероподобный переносчик на основе фуллерена С60-PEI-FAc, представлявший собой дендример с внешним слоем из молекул фолиевой кислоты (FAc). Система доставки лекарства была получена введением в корону молекулы доцетаксела. На культивированных раковых клетках РС3 in vitro была показана высокая эффективность проникновения этой системы через клеточные мембраны, усиление апоптоза и повышение противоопухолевого действия. Аналогичное повышение активности по сравнению с немодифицированным DTX было показано в экспериментах in vivo [88].
В исследовании конъюгатов пептидных дендримеров с фуллереном, которое запланировано в данном Проекте, ожидается образование кластеров меньшего размера вплоть до отдельных макромолекул. Это связано с тем, что в водном растворе используемые нами лизиновые и лизинсодержащие дендримеры являются положительно заряженными макроионами, поэтому их электростатическое взаимодействие будет препятствовать агрегации фуллеренов и фуллеренолов.
Также планируется исследование возможности создания комплексов, состоящих из сополимерного пептидного дендримера, в котором внутренняя часть менее гидрофильна за счет использования незаряженных аминокислотных вставок (например, аминокислотных остатков глицина), чем последние генерации (например, с лизиновыми аминокислотными вставками). Тогда внутренняя область дендримера будет являться ловушкой для фуллеренов или фуллеренолов. Отметим, что даже у фуллеренолов с 24-40 гидроксилированными группами имеются гидрофобные поверхности, которые приводят к их агрегации. Дендримерные конъюгаты и их комплексы с фуллереном или его производными будут обладать размерами 3-10 нм в диаметре, что сохранит их биологическую привлекательность, в том числе высокую проникающую способность через клеточную мембрану.
Важно отметить, что исследования коньюгатов и/или комплексов дендримеров с фуллеренами (или фуллереновыми производными) для биомедицинских приложений практически отсутствуют.

III. Трансляционная подвижность дендримера и процесс деинкапсуляции
Трансляционная подвижность макромолекул играет важную роль для практических приложений, и фундаментальные представления развиты довольно хорошо. Согласно этим представления, среднеквадратичное смещение (MSD) макромолекулы на достаточно больших временах описывается диффузионным уравнением Эйнштейна:
MSD = <(r(t0-t)-r(t0))^2>=6Dt (1)
Это связано тем, что на больших временах трансляционную подвижность макромолекулы в растворе (или в расплаве) можно рассматривать как случайный Марковский процесс (т.е. MSD не зависит от t0) блуждания броуновской частицы.
В случае дендримера, естественно ожидать, что трансляционная подвижность также будет являться Марковским процессом и описываться уравнением (1), так как структурные свойства (сферическая форма и повышенная плотность внутри макромолекулы) дендримера делают его более “похожим” на броуновскую частицу, чем классический полимерный клубок. Однако, традиционный метод расчета коэффициентов диффузии из данных моделирования указывает на обратную ситуацию.
Одним из основных методов теоретического исследования трансляционной подвижности дендримеров является МД моделирование. Более того диффузию макромолекул используют для калибровки модели макромолекул по экспериментальным данным, тем самым подтверждают правильность (легитимность) выбранной модели для моделирования. Так как дендример имеет практически сферическую форму в большинстве работ, посвященных исследованию диффузионных свойств с помощью МД моделирования, использовали стандартный подход: визуально находился линейный участок роста MSD от времени. По этому участку вычислялся коэффициент диффузии и оценивался размер дендримера. Однако дополнительный анализ данных, приведенных в работах [89–99], указывает на то, что этот подход не всегда дает правильный результат (т.к., на самом деле, надо использовать область линейности первой производной), а дополнительная калибровка под экспериментальные данные (если такая проводится) приводит к артефактам моделирования. Основная ошибка заключалась в том, что зависимость MSD(t) не выходит на линейный наклон (т.е. MSD~t) несмотря на то, что визуально зависимость кажется линейной.
В рамках предыдущего проекта РНФ № 19-13-00087 на примере наиболее удобной модельной системы (карбосилановые дендримеры в растворе) нами были проанализированы необходимые параметры и критерии для расчета коэффициента диффузии. Данные моделирования и ЯМР эксперимента позволили установить, что необходимые условия для достижения диффузионного режима (т.е. MSD~t) в МД моделировании значительно превосходят условия для макромолекул аналогичной молекулярной массы и размера. А именно, не более 5% временной зависимости MSD(t) имеет достоверную статистику. Также показано, что необходимый размер ячейки для получения достоверного (экспериментального) коэффициента диффузии должен быть более 2-3 размеров дендримера. Также установлено, что это не связано с наличием субдиффузионных режимов.
Таким образом, можно утверждать, что в довольно большом промежутке времен трансляционная подвижность дендримера является не-Марковским процессом. Причем, учитывая недостаточно большие размеры ячейки моделирования, движение дендримера приводит к гидродинамическому возмущению молекул растворителя, которое задаёт неслучайное направление движения растворителя. По всей видимости, это связано с наличием у дендримера уникального типа пульсационных движений, которые отсутствуют у неразветвленных макромолекул [100].
С другой стороны, наличие не-Марковского процесса должно сказываться на процессе деинкапсуляции в дендримере. Процесс деинкапсуляции – это высвобождение полезного вещества из контейнера. В частности, данный процесс играет важную роль в конечной стадии доставки лекарственных препаратов с помощью дендримерных наноконтейнеров [101]. Несмотря на то, что существует огромное количество работ по доставке лекарственных препаратов с помощью дендримеров, динамические и кинетические свойства процесса деинкапсуляции для дендримеров до настоящего времени в принципе не исследовались.
Итак, исследования аномальной диффузии дендримера и процесса де-инкапсуляции частицы из него являются важными фундаментальными и практическими задачами. С другой стороны, оба эти процесса, по всей видимости, будут являться сходными не-Марковскими процессами. В настоящем Проекте планируется построение теории для процесса деинкапсуляции на основе подхода, разработанного в работах [102,103].


Список литературы
1. Allen, T.M.; Cullis, P.R. Drug Delivery Systems: Entering the Mainstream. Science (80-. ). 2004, 303, 1818–1822.
2. Polymeric Nanocarriers: New Endeavors for the Optimization of the Technological Aspects of Drugs. Recent Pat. Biomed. Eng. 2008, 1.
3. Tyshenko, M.G. Medical nanotechnology using genetic material and the need for precaution in design and risk assessments. Int. J. Nanotechnol. 2008, 5, 116–123.
4. Veldhoen, S.; Laufer, S.; Restle, T. Recent Developments in Peptide-Based Nucleic Acid Delivery. Int. J. Mol. Sci. 2008, 9, 1276–1320.
5. Cheng, Y.; Xu, T. The effect of dendrimers on the pharmacodynamic and pharmacokinetic behaviors of non-covalently or covalently attached drugs. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 2291–2297.
6. Denkewalter, R. G.; Kolc, J.; Lukasavage, W.J. Macromolecular Highly Branched Homogeneous Compound Based on Lysine Units 1981.
7. Tomalia, D.A.; Baker, H.; Dewald, J.; Hall, M.; Kallos, G.; Martin, S.; Roeck, J.; Ryder, J.; Smith, P. A New Class of Polymers: Starburst-Dendritic Macromolecules. Polym J 1985, 17, 117–132.
8. Astruc, D. Dendrimers and nanosciences. Comptes Rendus Chim. 2003, 6, 709–711.
9. Liu, M.; Fréchet, J.M.J. Designing dendrimers for drug delivery. Pharm. Sci. Technolo. Today 1999, 2, 393–401.
10. Khan, M.K.; Nigavekar, S.S.; Minc, L.D.; Kariapper, M.S.T.; Nair, B.M.; Lesniak, W.G.; Balogh, L.P. In Vivo Biodistribution of Dendrimers and Dendrimer Nanocomposites — Implications for Cancer Imaging and Therapy. Technol. Cancer Res. Treat. 2005, 4, 603–613.
11. Lee, C.C.; MacKay, J.A.; Frechet, J.M.J.; Szoka, F.C. Designing dendrimers for biological applications. Nat Biotech 2005, 23, 1517–1526.
12. Boas, U.; Christensen, J.B.; Heegaard, P.M.H.; Peng, L. Dendrimers in Medicine and Biotechnology; The Royal Society of Chemistry, 2006; ISBN 978-0-85404-852-6.
13. Svenson, S.; Chauhan, A.S. Dendrimers for enhanced drug solubilization. Nanomedicine 2008, 3, 679–702.
14. Dendrimer-Based Nanomedicine; Majoros, I.J., Baker, J.R., Eds.; Pan Stanford Publishing, 2008; ISBN 9789814241045.
15. Jang, W.-D.; Kamruzzaman Selim, K.M.; Lee, C.-H.; Kang, I.-K. Bioinspired application of dendrimers: From bio-mimicry to biomedical applications. Prog. Polym. Sci. 2009, 34, 1–23.
16. Duncan, R.; Izzo, L. Dendrimer biocompatibility and toxicity. Adv. Drug Deliv. Rev. 2005, 57, 2215–2237.
17. Grinstaff, M.W. Dendritic macromers for hydrogel formation: Tailored materials for ophthalmic, orthopedic, and biotech applications. J. Polym. Sci. Part A Polym. Chem. 2008, 46, 383–400.
18. WOLINSKY, J.; GRINSTAFF, M. Therapeutic and diagnostic applications of dendrimers for cancer treatment☆. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008, 60, 1037–1055.
19. Ely, T.O.; Sharma, M.; Lesniak, W.; Klippenstein, D.L.; Foster, B.A.; Balogh, L.P. Dendrimer Nanocomposites as Multifunctional X-ray Contrast Agents. MRS Proc. 2007, 1064, 1018–1064.
20. Esfand, R.; Tomalia, D.A. Poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers: from biomimicry to drug delivery and biomedical applications. Drug Discov. Today 2001, 6, 427–436.
21. Agarwal, A.; Saraf, S.; Asthana, A.; Gupta, U.; Gajbhiye, V.; Jain, N.K. Ligand based dendritic systems for tumor targeting. Int. J. Pharm. 2008, 350, 3–13.
22. Tekade, R.K.; Kumar, P.V.; Jain, N.K. Dendrimers in Oncology: An Expanding Horizon. Chem. Rev. 2009, 109, 49–87.
23. Yellepeddi, V.K.; Kumar, A.; Palakurthi, S. Surface modified poly(amido)amine dendrimers as diverse nanomolecules for biomedical applications. Expert Opin. Drug Deliv. 2009, 6, 835–850.
24. Chis, A.A.; Dobrea, C.; Morgovan, C.; Arseniu, A.M.; Rus, L.L.; Butuca, A.; Juncan, A.M.; Totan, M.; Vonica-Tincu, A.L.; Cormos, G.; et al. Applications and Limitations of Dendrimers in Biomedicine. Molecules 2020, 25, 3982.
25. Kharwade, R.; More, S.; Warokar, A.; Agrawal, P.; Mahajan, N. Starburst pamam dendrimers: Synthetic approaches, surface modifications, and biomedical applications. Arab. J. Chem. 2020, 13, 6009–6039.
26. Santos, A.; Veiga, F.; Figueiras, A. Dendrimers as Pharmaceutical Excipients: Synthesis, Properties, Toxicity and Biomedical Applications. Mater. 2020, 13.
27. Filipczak, N.; Yalamarty, S.S.K.; Li, X.; Parveen, F.; Torchilin, V. Developments in Treatment Methodologies Using Dendrimers for Infectious Diseases. Molecules 2021, 26, 3304.
28. Stiriba, S.-E.; Frey, H.; Haag, R. Dendritic Polymers in Biomedical Applications: From Potential to Clinical Use in Diagnostics and Therapy. Angew. Chemie Int. Ed. 2002, 41, 1329–1334.
29. Boas, U.; Heegaard, P.M.H. Dendrimers in drug research. Chem. Soc. Rev. 2004, 33, 43–63.
30. Choi, Y.; Thomas, T.; Kotlyar, A.; Islam, M.T.; Baker, J.R. Synthesis and Functional Evaluation of DNA-Assembled Polyamidoamine Dendrimer Clusters for Cancer Cell-Specific Targeting. Chem. Biol. 2005, 12, 35–43.
31. Svenson, S.; Tomalia, D.A. Dendrimers in biomedical applications—reflections on the field. Adv. Drug Deliv. Rev. 2012, 64, 102–115.
32. Tomalia, D.A.; Reyna, L.A.; Svenson, S. Dendrimers as multi-purpose nanodevices for oncology drug delivery and diagnostic imaging. Biochem. Soc. Trans. 2007, 35, 61–67.
33. Svenson, S. Dendrimers as versatile platform in drug delivery applications. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2009, 71, 445–462.
34. Gillies, E.R.; Fréchet, J.M.J. pH-Responsive Copolymer Assemblies for Controlled Release of Doxorubicin. Bioconjug. Chem. 2005, 16, 361–368.
35. Kristen Sadler; Tam, J.P.; K. Sadler; Tam, J.P. Peptide dendrimers: applications and synthesis. Rev. Mol. Biotechnol. 2002, 90, 195–229.
36. Singh, S.K.; Sharma, V.K. Dendrimers: A Class of Polymer in the Nanotechnology for Drug Delivery. Nanomedicine Drug Deliv. Ther. 2009, 373–409.
37. Martinho, N.; Silva, L.C.; Florindo, H.F.; Brocchini, S.; Zloh, M.; Barata, T.S. Rational design of novel, fluorescent, tagged glutamic acid dendrimers with different terminal groups and in silico analysis of their properties. Int. J. Nanomedicine 2017, 12, 7053–7073.
38. Hsu, H.J.; Bugno, J.; Lee, S.R.; Hong, S. Dendrimer-based nanocarriers: a versatile platform for drug delivery. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomedicine Nanobiotechnology 2017, 9, 1–21.
39. Palmerston Mendes, L.; Pan, J.; Torchilin, V. Dendrimers as Nanocarriers for Nucleic Acid and Drug Delivery in Cancer Therapy. Molecules 2017, 22, 1401.
40. Kuanga, T.; Fub, D.; Changb, L.; Yangb, Z.; Chenc, Z.; Jine, L.; Chenb, F.; Peng, X. Recent Progress in Dendrimer-based Gene Delivery Systems. Curr. Org. Chem. 2016, 20, 1820–1826.
41. Pompilio, A.; Geminiani, C.; Mantini, P.; Siriwardena, T.N.; Di Bonaventura, I.; Reymond, J.L.; Di Bonaventura, G. Peptide dendrimers as “lead compounds” for the treatment of chronic lung infections by Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis patients: in vitro and in vivo studies. Infect. Drug Resist. 2018, Volume 11, 1767–1782.
42. Ben Jeddou, F.; Falconnet, L.; Luscher, A.; Siriwardena, T.; Reymond, J.-L.; van Delden, C.; Köhler, T. Adaptive and Mutational Responses to Peptide Dendrimer Antimicrobials in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 2020, 64.
43. Kawano, Y.; Jordan, O.; Hanawa, T.; Borchard, G.; Patrulea, V. Are Antimicrobial Peptide Dendrimers an Escape from ESKAPE? Adv. Wound Care 2020, 9, 378–395.
44. Cañas-Arranz, R.; de León, P.; Forner, M.; Defaus, S.; Bustos, M.J.; Torres, E.; Andreu, D.; Blanco, E.; Sobrino, F. Immunogenicity of a Dendrimer B2T Peptide Harboring a T-Cell Epitope From FMDV Non-structural Protein 3D. Front. Vet. Sci. 2020, 7.
45. Crespo, L.; Sanclimens, G.; Pons, M.; Giralt, E.; Royo, M.; Albericio, F. Peptide and amide bond-containing dendrimers. Chem. Rev. 2005, 105, 1663–1681.
46. Johansson, E.M.V.; Crusz, S.A.; Kolomiets, E.; Buts, L.; Kadam, R.U.; Cacciarini, M.; Bartels, K.-M.; Diggle, S.P.; Cámara, M.; Williams, P.; et al. Inhibition and Dispersion of Pseudomonas aeruginosa Biofilms by Glycopeptide Dendrimers Targeting the Fucose-Specific Lectin LecB. Chem. Biol. 2008, 15, 1249–1257.
47. Gorain, B.; Choudhury, H.; Pandey, M.; Mohd Amin, M.C.I.; Singh, B.; Gupta, U.; Kesharwani, P. Dendrimers as Effective Carriers for the Treatment of Brain Tumor. In Nanotechnology-Based Targeted Drug Delivery Systems for Brain Tumors; Elsevier, 2018; pp. 267–305.
48. Cooper, B.M.; Iegre, J.; O’ Donovan, D.H.; Ölwegård Halvarsson, M.; Spring, D.R. Peptides as a platform for targeted therapeutics for cancer: peptide–drug conjugates (PDCs). Chem. Soc. Rev. 2021, 50, 1480–1494.
49. Hegde, N.; Velingkar, V.; Prabhakar, B. An Update on Design and Pharmacology of Dendritic Poly(l-lysine). Int. J. Pept. Res. Ther. 2019, 25, 1539–1562.
50. Chen, S.; Huang, S.; Li, Y.; Zhou, C. Recent Advances in Epsilon-Poly-L-Lysine and L-Lysine-Based Dendrimer Synthesis, Modification, and Biomedical Applications. Front. Chem. 2021, 9.
51. Thompson, M.; Scholz, C. Highly Branched Polymers Based on Poly(amino acid)s for Biomedical Application. Nanomaterials 2021, 11, 1119.
52. Maysinger, D.; Zhang, Q.; Kakkar, A. Dendrimers as Modulators of Brain Cells. Molecules 2020, 25, 4489.
53. Gorzkiewicz, M.; Konopka, M.; Janaszewska, A.; Tarasenko, I.I.; Sheveleva, N.N.; Gajek, A.; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Application of new lysine-based peptide dendrimers D3K2 and D3G2 for gene delivery: Specific cytotoxicity to cancer cells and transfection in vitro. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103504.
54. Gorzkiewicz, M.; Kopeć, O.; Janaszewska, A.; Konopka, M.; Pędziwiatr-Werbicka, E.; Tarasenko, I.I.; Bezrodnyi, V. V; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Poly(lysine) Dendrimers Form Complexes with siRNA and Provide Its Efficient Uptake by Myeloid Cells: Model Studies for Therapeutic Nucleic Acid Delivery. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 3138.
55. Friedman, S.H.; DeCamp, D.L.; Sijbesma, R.P.; Srdanov, G.; Wudl, F.; Kenyon, G.L. Inhibition of the HIV-1 protease by fullerene derivatives: model building studies and experimental verification. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6506–6509.
56. Sijbesma, R.; Srdanov, G.; Wudl, F.; Castoro, J.A.; Wilkins, C.; Friedman, S.H.; DeCamp, D.L.; Kenyon, G.L. Synthesis of a fullerene derivative for the inhibition of HIV enzymes. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115, 6510–6512.
57. Penkova, A. V; Acquah, S.F.; Piotrovskiy, L.B.; Markelov, D.A.; Semisalova, A.S.; Kroto, H.W. Fullerene derivatives as nano-additives in polymer composites. Russ. Chem. Rev. 2017, 86, 530–566.
58. Dugan, L.L.; Turetsky, D.M.; Du, C.; Lobner, D.; Wheeler, M.; Almli, C.R.; Shen, C.K.-F.; Luh, T.-Y.; Choi, D.W.; Lin, T.-S. Carboxyfullerenes as neuroprotective agents. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 9434–9439.
59. Lin, Y.-L.; Lei, H.-Y.; Wen, Y.-Y.; Luh, T.-Y.; Chou, C.-K.; Liu, H.-S. Light-Independent Inactivation of Dengue-2 Virus by Carboxyfullerene C3 Isomer. Virology 2000, 275, 258–262.
60. Piotrovsky, L.B.; Kiselev, O.I. Fullerenes and Viruses. Fullerenes, Nanotub. Carbon Nanostructures 2005, 12, 397–403.
61. Bosi, S.; Da Ros, T.; Spalluto, G.; Prato, M. Fullerene derivatives: an attractive tool for biological applications. Eur. J. Med. Chem. 2003, 38, 913–923.
62. Tsao, N.; Luh, T.-Y.; Chou, C.-K.; Chang, T.-Y.; Wu, J.-J.; Liu, C.-C.; Lei, H.-Y. In vitro action of carboxyfullerene. J. Antimicrob. Chemother. 2002, 49, 641–649.
63. Mroz, P.; Tegos, G.P.; Gali, H.; Wharton, T.; Sarna, T.; Hamblin, M.R. Photodynamic therapy with fullerenes. Photochem. Photobiol. Sci. 2007, 6, 1139.
64. Horie, M.; Nishio, K.; Kato, H.; Shinohara, N.; Nakamura, A.; Fujita, K.; Kinugasa, S.; Endoh, S.; Yoshida, Y.; Hagihara, Y.; et al. In vitro evaluation of cellular influences induced by stable fullerene C70 medium dispersion: Induction of cellular oxidative stress. Chemosphere 2013, 93, 1182–1188.
65. Nishizawa, C.; Hashimoto, N.; Yokoo, S.; Funakoshi-Tago, M.; Kasahara, T.; Takahashi, K.; Nakamura, S.; Mashino, T. Pyrrolidinium-type fullerene derivative-induced apoptosis by the generation of reactive oxygen species in HL-60 cells. Free Radic. Res. 2009, 43, 1240–1247.
66. Chen, Z.; Mao, R.; Liu, Y. Fullerenes for Cancer Diagnosis and Therapy: Preparation, Biological and Clinical Perspectives. Curr. Drug Metab. 2012, 13, 1035–1045.
67. Dou, Z.; Xu, Y.; Sun, H.; Liu, Y. Synthesis of PEGylated fullerene–5-fluorouracil conjugates to enhance the antitumor effect of 5-fluorouracil. Nanoscale 2012, 4, 4624.
68. Cheng, L.; Wang, C.; Feng, L.; Yang, K.; Liu, Z. Functional Nanomaterials for Phototherapies of Cancer. Chem. Rev. 2014, 114, 10869–10939.
69. Doi, Y.; Ikeda, A.; Akiyama, M.; Nagano, M.; Shigematsu, T.; Ogawa, T.; Takeya, T.; Nagasaki, T. Intracellular Uptake and Photodynamic Activity of Water‐Soluble [60]‐ and [70]Fullerenes Incorporated in Liposomes. Chem. – A Eur. J. 2008, 14, 8892–8897.
70. Jiang, G.; Zheng, Q.; Yang, D. Synthesis of a water-soluble fullerene derivative nanoball and its biological activity. J. Appl. Polym. Sci. 2006, 99, 2874–2877.
71. Liu, J.; Tabata, Y. Photodynamic therapy of fullerene modified with pullulan on hepatoma cells. J. Drug Target. 2010, 18, 602–610.
72. Liu, J.; Tabata, Y. Photodynamic Antitumor Activity of Fullerene Modified with Poly(ethylene glycol) with Different Molecular Weights and Terminal Structures. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2011, 22, 297–312.
73. Chen, C.; Xing, G.; Wang, J.; Zhao, Y.; Li, B.; Tang, J.; Jia, G.; Wang, T.; Sun, J.; Xing, L.; et al. Multihydroxylated [Gd@C 82 (OH) 22 ] n Nanoparticles: Antineoplastic Activity of High Efficiency and Low Toxicity. Nano Lett. 2005, 5, 2050–2057.
74. Meng, J.; Liang, X.; Chen, X.; Zhao, Y. Biological characterizations of [Gd@C82(OH)22] n nanoparticles as fullerene derivatives for cancer therapy. Integr. Biol. 2013, 5, 43–47.
75. Liu, Y.; Jiao, F.; Qiu, Y.; Li, W.; Lao, F.; Zhou, G.; Sun, B.; Xing, G.; Dong, J.; Zhao, Y.; et al. The effect of Gd@C82(OH)22 nanoparticles on the release of Th1/Th2 cytokines and induction of TNF-α mediated cellular immunity. Biomaterials 2009, 30, 3934–3945.
76. Shu, C.-Y.; Ma, X.-Y.; Zhang, J.-F.; Corwin, F.D.; Sim, J.H.; Zhang, E.-Y.; Dorn, H.C.; Gibson, H.W.; Fatouros, P.P.; Wang, C.-R.; et al. Conjugation of a Water-Soluble Gadolinium Endohedral Fulleride with an Antibody as a Magnetic Resonance Imaging Contrast Agent. Bioconjug. Chem. 2008, 19, 651–655.
77. Zhen, M.; Zheng, J.; Ye, L.; Li, S.; Jin, C.; Li, K.; Qiu, D.; Han, H.; Shu, C.; Yang, Y.; et al. Maximizing the Relaxivity of Gd-Complex by Synergistic Effect of HSA and Carboxylfullerene. ACS Appl. Mater. Interfaces 2012, 4, 3724–3729.
78. Injac, R.; Prijatelj, M.; Strukelj, B. Fullerenol Nanoparticles: Toxicity and Antioxidant Activity. In; 2013; pp. 75–100.
79. Rebecca, M.; Hsing-Lin, W.; Jun, G.; Srinivas, I.; Gabriel, M.A.; Jennifer, M.; Andrew, S.P.; Yuping, B.; Chun-Chih, W.; Zhong, C.; et al. Impact of physicochemical properties of engineered fullerenes on key biological responses. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2009, 234, 58–67.
80. Belgorodsky, B.; Fadeev, L.; Kolsenik, J.; Gozin, M. Formation of a Soluble Stable Complex between Pristine C60-Fullerene and a Native Blood Protein. ChemBioChem 2006, 7, 1783–1789.
81. Li, S.; Zhao, X.; Mo, Y.; Cummings, P.T.; Heller, W.T. Human serum albumin interactions with C60 fullerene studied by spectroscopy, small-angle neutron scattering, and molecular dynamics simulations. J. Nanoparticle Res. 2013, 15, 1769.
82. Deguchi, S.; Yamazaki, T.; Mukai, S.; Usami, R.; Horikoshi, K. Stabilization of C 60 Nanoparticles by Protein Adsorption and Its Implications for Toxicity Studies. Chem. Res. Toxicol. 2007, 20, 854–858.
83. Gharbi, N.; Pressac, M.; Hadchouel, M.; Szwarc, H.; Wilson, S.R.; Moussa, F. [60]Fullerene is a Powerful Antioxidant in Vivo with No Acute or Subacute Toxicity. Nano Lett. 2005, 5, 2578–2585.
84. Brant, J.A.; Labille, J.; Bottero, J.-Y.; Wiesner, M.R. Characterizing the Impact of Preparation Method on Fullerene Cluster Structure and Chemistry. Langmuir 2006, 22, 3878–3885.
85. Witte, P.; Beuerle, F.; Hartnagel, U.; Lebovitz, R.; Savouchkina, A.; Sali, S.; Guldi, D.; Chronakis, N.; Hirsch, A. Water solubility, antioxidant activity and cytochrome C binding of four families of exohedral adducts of C60 and C70. Org. Biomol. Chem. 2007, 5, 3599.
86. Dumpis, M.A.; Nikolayev, D.N.; Litasova, E. V; Iljin, V. V; Brusina, M.A.; Piotrovsky, L.B. Biological activity of fullerenes - reality and prospects. Rev. Clin. Pharmacol. Drug Ther. 2018, 16, 4–20.
87. Partha, R.; Mitchell, L.R.; Lyon, J.L.; Joshi, P.P.; Conyers, J.L. Buckysomes: Fullerene-Based Nanocarriers for Hydrophobic Molecule Delivery. ACS Nano 2008, 2, 1950–1958.
88. Shi, J.; Zhang, H.; Wang, L.; Li, L.; Wang, H.; Wang, Z.; Li, Z.; Chen, C.; Hou, L.; Zhang, C.; et al. PEI-derivatized fullerene drug delivery using folate as a homing device targeting to tumor. Biomaterials 2013, 34, 251–261.
89. Molina, N.; Martin-Serrano, A.; Fernandez, T.D.; Tesfaye, A.; Najera, F.; Torres, M.J.; Mayorga, C.; Vida, Y.; Monta ez, M.I.; Perez-Inestrosa, E. Dendrimeric antigens for drug allergy diagnosis: A new approach for basophil activation tests. Molecules 2018.
90. Barra, P.A.; Barraza, L.F.; Jiménez, V.A.; Gavin, J.A.; Alderete, J.B. Drug-dendrimer supramolecular complexation studied from molecular dynamics simulations and NMR spectroscopy. Struct. Chem. 2014.
91. Maiti, P.K.; Bagchi, B. Structure and dynamics of DNA-dendrimer complexation: Role of counterions, water, and base pair sequence. Nano Lett. 2006, 6, 2478–2485.
92. Lin, S.T.; Maiti, P.K.; Goddard, W.A. Dynamics and thermodynamics of water in PAMAM dendrimers at subnanosecond time scales. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 8663–8672.
93. Carrasco-Sánchez, V.; Vergara-Jaque, A.; Zuñiga, M.; Comer, J.; John, A.; Nachtigall, F.M.; Valdes, O.; Duran-Lara, E.F.; Sandoval, C.; Santos, L.S. In situ and in silico evaluation of amine- and folate-terminated dendrimers as nanocarriers of anesthetics. Eur. J. Med. Chem. 2014, 73, 250–257.
94. Balabaev, N.K.; Mazo, M.A.; Kramarenko, E.Y. Insight into the Structure of Polybutylcarbosilane Dendrimer Melts via Extensive Molecular Dynamics Simulations. Macromolecules 2017, 50, 432–445.
95. Ortiz, A.M.; Sánchez-Méndez, A.; De Jesús, E.; Flores, J.C.; Gómez-Sal, P.; Mendicuti, F. Poly(benzyl ether) Dendrimers Functionalized at the Core with Palladium Bis(N-Heterocyclic Carbene) Complexes as Catalysts for the Heck Coupling Reaction. Inorg. Chem. 2016, 55, 1304–1314.
96. Barra, P.A.; Barraza, L.; Jiménez, V.A.; Gavín, J.A.; Alderete, J.B. Complexation of Mefenamic Acid by Low-Generation PAMAM Dendrimers: Insight from NMR Spectroscopy Studies and Molecular Dynamics Simulations. Macromol. Chem. Phys. 2014, 215, 372–383.
97. Jang, S.S.; Lin, S.T.; Çaǧin, T.; Molinero, V.; Goddard, W.A. Nanophase segregation and water dynamics in the dendrion diblock copolymer formed from the Fréchet polyaryl ethereal dendrimer and linear PTFE. J. Phys. Chem. B 2005, 109, 10154–10167.
98. Jang, S.S.; Goddard, W.A. Hydrated water-soluble dendrimer-grafted polymer membranes for application to polymer electrolyte membrane fuel cells. ACS Natl. Meet. B. Abstr. 2007, 2759–2769.
99. Maiti, P.K.; Bagchi, B. Diffusion of flexible, charged, nanoscopic molecules in solution: Size and pH dependence for PAMAM dendrimer. J. Chem. Phys. 2009, 131.
100. Gotlib, Y.Y.; Markelov, D.A. Theory of the Relaxation Spectrum of a Dendrimer Macromolecule. Polym. Sci. Ser. A 2002, 44, 1341–1350.
101. Singh, J.; Jain, K.; Mehra, N.K.; Jain, N.K. Dendrimers in anticancer drug delivery: mechanism of interaction of drug and dendrimers. Artif. Cells, Nanomedicine, Biotechnol. 2016, 44, 1626–1634.
102. Guérin, T.; Bénichou, O.; Voituriez, R. Non-Markovian polymer reaction kinetics. Nat. Chem. 2012, 4, 568–573.
103. Guérin, T.; Levernier, N.; Bénichou, O.; Voituriez, R. Mean first-passage times of non-Markovian random walkers in confinement. Nature 2016, 534, 356.

[4] Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта:
Структуры и комплексы, которые планируется исследовать
1) Комплексы пептидных амфифильных дендримеров с повторяющимися элементами Lys, Lys-2Gly, Lys-2His (т.е лизиновый дендример без и с дипептидными вставками 2Gly и 2His) с нерастворимыми или слаборастворимыми в воде фуллеренами и их производными.
1.1) Лизиновый (Lys) дендример различных генераций (G=2-4) с фуллереном (С60 и/или С70), с фуллеренолами С60(OH)x, С70(OH)x и/или эндофуллеренолами Gd@C2n(OH)x (где x = 20÷40, n = 30÷50).
1.2) Лизиновый дендример с дипептидными 2Gly вставками и гидрофобным ядром (например, Lys-2Gly) с фуллереном (С60 и/или С70) и/или с фуллеренолом.
1.3) Лизиновый дендример с pH-чувствительными дипептидными Lys-2His вставками с фуллереном (С60 и/или С70) и/или с фуллеренолом С60(OH)x (где x = 20÷40).

2) Конъюгаты сильнозаряженных лизиновых дендримеров (например, Lys-2Lys с 2Lys дипептидными вставками) со слаборастворимыми фуллеренами и их производными (С60, С70, Gd@C2n и/или, Gd@C2n(OH)x, где x = 20÷40, n = 30÷50)

Предлагаемые методы и подходы

1. Синтез
1.1. Синтез пептидных дендримеров
Дендримерные макромолекулы на основе L-лизина будут получены методом контролируемого многоступенчатого пептидного синтеза, применяя дивергентную стратегию, согласно которой макромолекулы дендримера формируются путем последовательного наращивания сферических слоев. В этом проекте данная схема позволит осуществить модификацию как внутренних сегментов пептидными вставками, так и поверхностную функционализацию групп дендритных структур. Синтез будет осуществлен с помощью твердофазной методики синтеза пептидов, на полимерной матрице с использованием BOC-стратегии, основного ветвящего компонента N, N–ди(трет-бутилоксикарбонил)-лизина и конденсирующих агентов. В рамках этой методики можно использовать большой избыток реагентов, что позволит подтвердить эффективность сцепления реагирующих групп с помощью тестовой системы, тем самым обеспечивая полноту прохождения реакции, и позволит избежать дефектов в регулярной структуре дендримеров. Выделение и очистка полученных дендримеров после кислотного отщепления (TFMSA/TFA) целевой молекулы с полимерного носителя будет проводиться с помощью метода гель-проникающей хроматографии и метода диализа с использованием мембраны с отсекаемой массой. Структура дендримерных макромолекул будет подтверждена с помощью аминокислотного анализа, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и ЯМР спектроскопии.

1.2. Синтез фуллеренов и их производных
Высокочистый фуллерен С60 предлагается получать по способу [Грушко Ю.С., Седов В.П., Колесник С.Г. Способ получения фуллерена С60: патент РФ № 2224714, заяв. 06.12.2001. Опубл. 27.02.2004], включающему обогащение исходного экстракта смеси фуллеренов фракционным концентрированием до 96±2% по фуллерену C60, хроматографическую очистку раствора полученного концентрата в ароматическом растворителе на активированном угле. Высокочистый фуллерен С70 предполагается получать по способу, включающему обогащение исходного экстракта по фуллерену C70, хроматографическую очистку активированным углем раствора полученного концентрата в ароматическом растворителе, выделение фуллерена C70 фракционной кристаллизацией и проведение вакуумной сублимационной термообработки [Седов В. П., Колесник С. Г. Способ получения фуллерена С70: патент РФ № 2455230, заяв. 13.08.2010. Опубл. 10.07.2012].
Для получения водорастворимых фуллеренолов С60(ОН)х и С70(ОН)х (где х = 20 ÷ 40) будет применен новый оригинальный двухстадийный способ [патент РФ №2558121, заяв. 04.04.2014. Опубл. 27.07.2015. Бюл. № 21]. На первой стадии будут получены низкогидроксилированные нерастворимые фуллеренолы путем взаимодействия концентрированного раствора фуллерена в о-ксилоле с водным раствором аммиака в присутствии катализатора межфазового переноса тетрабутиламмониевого гидроксида. На второй стадии полученные низкогидроксилированные нерастворимые фуллеренолы будут переведены в высокогидроксилированные фуллерены посредством смешивания с 6-15%-ным водным раствором пероксида водорода и нагревании в течение 4-5 часов при температуре 65°C. Разработанный способ показал свою эффективность при получения высокочистых, не содержащих примесей щелочного характера, и высоко водорастворимых гидроксилированных фуллеренолов.
Фуллеренсодержащую сажу с эндометаллофуллеренами предлагается получать с использованием оригинальных методик [Патент на изобретение RU 2664133 C1, 15.08.2018. Заявка № 2017108883 от 16.03.2017.; Патент на изобретение RU 2659972 C1, 04.07.2018. Заявка № 2016151106 от 23.12.2016.]. Из фуллеренсодержащей сажи смесь фуллеренов и эндометаллофуллеренов будет извлекаться путем сублимации или с помощью экстракции органическими растворителями. Разделение пустотелых и эндометаллофуллеренов будет осуществляться посредством использования растворителей с различной полярностью. Для более полного извлечения эндофуллеренов будет использован оригинальный способ, благодаря которому степень извлечения достигает 86% от массы фуллеренсодержащей сажи [Sedov V.P., Borisenkova A.A., Suyasova M.V., Orlova D.N., Krivorotov A.S., Ivanov A.V., Fomin S.V.Deep extraction of fullerene-containing carbon black with a polar solvent: analysis of products // Russian Journal of Applied Chemistry, 2020, 93, 4, 527-539.].
Карбоксилированные фуллерены могут быть получены с использованием отработанной и общепринятой методики в две стадии: циклопропанирование фуллерена (или реакция Бингеля) и гидрогенолиз эфиров фуллеренов. Циклопропанирование фуллеренов в возможно проводить присутствии оснований (например, NaH, DBU, пиридин, трет-бутилат калия, NaH, триметиламин, K2CO3).
В качестве альтернативы могут использоваться способы с применением илидов или путем твердофазного синтеза, а также с помощью гидролиза различных циклопропил-фуллерен-3'-карбоксилатов в кислой среде.
Также возможна модификация и усовершенствование указанных способов с разработкой новой лабораторной методики.
Состав полученных экстрактов фуллеренов и эндофуллеренов будет контролироваться с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и элементного анализа. Идентификация веществ будет осуществлена с применением комплекса физико-химических методов. Наличие характерных химических связей будет подтверждено методами ИК- и КР-спектроскопии (по наличию и смещению полос пропускания, характерных для фуллерена). Анализ числа гидроксильных групп будет производиться с помощью общепринятой методики [Goswami, Thako Hari, et al. “Thermal analysis: a unique method to estimate the number of substituents in fullerene derivatives.” Thermochimica Acta , 2004, 419,1-2, 97-104].

1.3. Синтез коньюгатов пептидных дендримеров с фуллереновыми производными
Для создания гибридных макромолекул на основе симметричного лизинового дендримера и карбоксифуллерена будут применены две основные синтетические стратегии: дивергентный и конвергентный подходы. В дивергентном подходе, синтез будет осуществлен путем последовательного наращивания сферических слоев дендримера и введения фуллеренового фрагмента при начальном росте дендримерной молекулы. В образовании фуллеренсодержащего дендримера будет применена контролируемая твердофазная методика синтеза пептидов (SPPS) на полимерной матрице, с использованием комбинации BOC/Bzl и Fmoc/But стратегии, основного ветвящегося компонента N,N-ди(трет-бутилоксикарбонил)-лизина и конденсирующих агентов. Так, один из вариантов конъюгации в синтезе, основан на использовании ε-аминогруппы остатка L-лизина в пептидной последовательности, расширяя возможности модификации. Использование техники твердофазного синтеза позволит ввести дополнительную функциональную группу в ядро дендримерного каркаса (С-конец молекулы) и провести фрагментную конденсацию активированной производной карбоксифуллерена.
Другой способ синтеза в данном проекте предполагает комбинацию дивергентного и конвергентного подходов. Когда осуществлен раздельный синтез отдельных молекул: дендримерной по дивергентной схеме и окончательная сборка целевого конъюгата с карбоксифуллереном по конвергентной схеме. Данная схема синтеза будет заключаться в функционализации карбоксифуллерена предварительно сформированным лизиновым дендримером, посредством сайта связывания на поверхности фуллеренового каркаса.
Наличие на поверхности фуллеренового кора различного количества функциональных карбоксильных групп позволит получить ряд гибридных структур с разной степенью насыщения дендримерными молекулами. После всех завершающих стадий синтеза целевые продукты будут очищены методом колоночной эксклюзионной хроматографии и диализа, с помощью мембран с отсекаемой молекулярной массой. Степень очистки продуктов будет проанализирована с помощью обращённо-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Характеристики и структура дендритных соединений будут подтверждены с помощью ЯМР-спектроскопии.
Для синтеза коньюгатов пептидных дендримеров с производными фуллерена, содержащих атом Gd будет использоваться аналогичная стратегия.

1.4. Создания комплексов пептидных дендримеров с фуллеренами и фуллеренолами
Комплексы дендример-фуллерен будут получены путем смешения растворов компонент, приготовленных в одном органическом растворителе, и дальнейшего изменения термодинамического качества среды путем добавления воды (улучшая, таким образом, термодинамическое качество итогового смешанного растворителя для лизинового дендримера и ухудшая таковое для фуллерена). Возможность комплексообразования при использовании этой процедуры была предварительно подтверждена до подачи проекта и будет более детально изучена при вариации соотношений дендример/фуллерен, при использовании дендримеров различных генераций и видов фуллерена (С60, С70) и при различной доле воды в смешанном растворителе, что позволит получить информацию о влиянии этих факторов на комплексообразование и разработать стратегию получения комплекса с наилучшими характеристиками. Растворы отдельных компонент и комплексов будут изучены методами динамического рассеяния света, спектроскопии поглощения и ЯМР (путем лиофилизации и перерастворения в дейтерированном растворителе).
Создание комплексов дендример-фуллеренол будет проводится аналогичным методом.

2. Экспериментальные исследования
2.1 ЯМР
Дендримерые комплексы и коньюгаты будут исследованы методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Спектроскопия ЯМР является хорошо известным аналитическим методом для определения и подтверждения молекулярной структуры. Будут использованы одномерные и двумерные техники на ядрах 1Н и 13C.
Для получения одномерного протонного (углеродного) спектра будет использована последовательность, состоящая из одного 90°-импульса. Протонный 1H ЯМР спектр с химическими сдвигами и константами взаимодействия дает информацию о количестве протонов (интенсивность сигнала), типах химических групп, и о взаимодействии между группами (спин-спиновые мультиплеты). 13С ЯМР спектр несёт в себе информацию о количестве химически неэквивалентных атомов углерода, содержащихся в молекуле, и типе химических групп, к которой эти углероды принадлежат.
Поскольку дендримеры имеют сложную древовидную структуру, для их анализа необходимо использовать методы двумерной ЯМР гомоядерной (COSY, NOESY), так и гетероядерной (HSQC и HMBC) корреляционной спектроскопии. Методы COSY и NOESY широко используются для получения информации о внутримолекулярном взаимодействии протонов внутри молекулы через химические связи (COSY) и через пространство (NOESY). Это позволяет уточнить химическое строение исследуемой молекулы и ее конформации. Методики гетероядерной 1Н-13C спектроскопии позволяют установить взаимодействие протонов и углеродов, принадлежащих одной группе, (HSQC) и взаимодействующих через 2-4 связи (HMBC). Полученные данные ЯМР спектроскопии позволят получить детальную информацию о структуре исследуемых дендримеров и их комплексов.
Экспериментальные исследования ЯМР релаксации позволяют получить информацию о локальной ориентационной подвижности внутри макромолекулы и дают возможность количественно сравнить ее с данными моделирования. Значения T1 могут быть получены разными методами. Для измерения времени спин-решеточной релаксации будет применяться последовательность “инверсия-восстановление”, которая позволяет получать более точное значение.
Диффузионные ЯМР эксперименты позволяют спектроскопически разрешать различные соединения в смеси на основе их различных коэффициентов диффузии в зависимости от размера и формы молекул или их комплексов. Для измерения поступательной диффузии молекул будут использованы методики ЯМР спектроскопии с импульсным градиентом магнитного поля, в частности последовательность “спиновое эхо с градиентом”. Результаты диффузионных экспериментов позволят оценить размеры рассматриваемых систем и предположить их транспортные свойства.

2.2. Малоугловое рентгеновское рассеяние
Малоугловое рентгеновское рассеяние (МУРР) представляет собой метод исследования строения частично разупорядоченных систем. В частности, МУРР применим к исследованиям макромолекул в растворе и дает информацию об их четвертичной структуре и структурных переходах при изменении физико-химических условий. МУРР позволяет исследовать широкий диапазон размеров и форм частиц, от отдельных макромолекул до многодоменных белков и больших макромолекулярных комплексов. Разработанные в последние десятилетия новые алгоритмы анализа данных МУРР позволили значительно улучшить надежность восстанавливаемых моделей. Например, в случае МУРР с использованием синхротронного излучения данные собираются за секунды/минуты и анализ проводится в режиме реального времени. Кроме того, МУРР очень полезен в сочетании с другими структурными методами (такими как ЯМР и крио-электронная микроскопия), что обеспечивает взаимодополняемую информацию высокого и низкого разрешения, соответственно.
Спектр исследуемых наноматериалов в последние годы значительно расширился: это растворы белков, комплексов белок-РНК и белок-ДНК, липидные и белок-липидные системы, полимерные композиты с наночастицами различной природы, гели, нанокатализаторы, нанодисперсные проводящие полимеры и многое другое.
Характерные размеры, доступные для исследования методом МУРР, лежат в интервале от 1 нм до 100-200 нм. Определение размеров комплексов и коньюгатов пептидных дендримеров с фуллеренами будет проведено методом МУРР с использованием станции “БиоМУР” Курчатовского синхротрона. Применение высокоинтенсивного синхротронного излучения позволит проводить измерения в том числе и для низких концентраций частиц. Метод МУРР также позволяет определять размеры ассоциатов частиц и относительные объемные доли компонент при наличии смесей частиц. Важно отметить, что диффузионных измерений методом ЯМР позволяет оценить только средние размеры по всем ассоциатам, в отличие от данного метода.

2.3. Цитологических исследований на линиях раковых клеток
Цитологические исследования запланированы на 3-ий год проекта и будут проведены с привлечением Ресурсного центра ОМРБ (НИК “Курчатовский Институт” - ПИЯФ) и его вспомогательного персонала.
Данные исследования будут проведены на клеточных линиях из НИЦ “КИ” - ПИЯФ. Будут выбраны клетки, наиболее подходящие для анализа токсичности, такие как HeLa (карциномы шейки матки человека), А549 (карциномы легкого человека), Ecv (эндотелиоциты пуповинной вены человека) и другие.
Оценка безопасности приготовленных в рамках Проекта коньюгатов и/или комплексов дендримеров с фуллеренами будет проведена с помощью метода определения дегидрогеназной активности митохондрий (МТТ-тест). МТТ-тест позволит проанализировать жизнедеятельность клеток, после воздействия на них дендримерных комплексов. В основе метода лежит способность живых клеток восстанавливать желтый бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-тетразолия в пурпурно-синие внутриклеточные кристаллы МТТ-формазана, растворимые в ДМСО. Уменьшение оптической плотности опытных проб по сравнению с контрольными, должно быть статистически значимым для заключения о цитотоксическом действии вещества на клетки.
Методом проточной цитометрии будет проанализировано влияние комплекса на клеточный цикл, что позволит сделать вывод о наличии или отсутствии у них цитостатического эффекта. Данный метод дает возможность исследовать одиночные клетки в потоке и отличается высокой производительностью и точностью. В ходе анализа регистрируются сигналы светорассеяния и флуоресценции от каждой клетки, учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клетки (аутофлуоресценция) и внесённых в образец.

3. Компьютерное моделирование
3.1. Молекулярно-динамическое моделирование комплексов и коньюгатов пептидных дендримеров с фуллеренами и их производными
Для решения поставленных задач по моделированию комплексов и коньюгатов пептидных дендримеров с фуллеренами и их производными будут применены методы молекулярно-динамического (МД) моделирования c использованием полноатомных моделей. Применение метода МД и полноатомных моделей необходимо для детального описания специфических взаимодействий различных групп дендримерных структур. При приготовлении начальных координат для моделирования комплексов и коньюгатов дендримеров методом молекулярной динамики будет использована методика многостадийной релаксации дендримера и всей системы, разработанная участниками Проекта. Согласно данной методике, модельный дендример собирается из дендримеров предыдущих поколений дивергентным методом с минимизацией энергии и расчетом последующих коротких траекторий методом МД на каждой стадии сборки. При этом минимизация на начальных стадиях моделирования ведется с наложенными дополнительными связями, препятствующими переходу каждой из пептидных связей из низкоэнергетической транс-конформации в долгоживущую метастабильную цис-конформацию.
Моделирование будет проводиться методом молекулярной динамики с использованием пакета GROMACS (пакет открытого доступа), показавшего высокую эффективность при работе в многопроцессорных средах (в т.ч. на GPU кластерах). Это позволит детально разобраться в структурных и динамических свойствах системы на атомарном уровне, позволит объяснить наблюдаемые в эксперименте эффекты и предсказать новые свойства. Важно отметить, что участники проекта имеют богатый опыт использования данного пакета для моделирования различных дендримерных систем, в том числе пептидных дендримеров.

3.2. Моделирование и теоретическое описание процесса деинкапсуляции фуллерена из дендримера
В настоящем Проекте будут сделаны первые шаги для фундаментального исследования процесса деинкапсуляции. Для этого будет исследоваться модельная система “карбосилановый дендример с инкапсулированным фуллереном в растворе”, которая позволит на этом этапе избежать влияния дополнительных факторов (например, водородных связей или других электростатических взаимодействий ионизированных атомов в системе). В начальный момент времени фуллерен будет помещен вблизи центра ветвления дендримера. Эта конфигурация будет использоваться для всех используемых реплик, которых планируется сделать не менее 10000. Моделирование от начальной конфигурации будет продолжаться до времени, когда расстояние между центрами масс дендримера и фуллерена не будет больше размеров ячейки моделирования. Причем размер ячейки моделирования будет не менее 4Rg дендримера, где Rg – радиус инерции дендримера. Для проведения необходимого числа реплик (не менее 10000) будут оптимизироваться значения температуры и размеров дендримера.
Мы полагаем, что после того как частица выходит за пределы дендримера ее трансляционное движение не будет являться Марковским процессом. Другими словами, у деинкапсулированной частицы будет наблюдаться эффект памяти, связанный со способом высвобождения частицы из дендримера. Поэтому для исследования данного процесса нами будут использоваться подходы разработанные ранее в работах Guerin et al. [Nature 2016, 534, 356–359; Nature Chem. 2012, 4, 568–573]. Если адаптировать данный подход к описанию деинкапсуляции частицы из дендримера, то подтвердить не-Марковское поведение частицы и описать его можно с помощью анализа двух основных параметров: среднего времени первого выхода (T, т.е. когда частица достигает поверхности дендримера) и функции памяти μ(t), указывающей на наличие выделенного направления в движении частицы.
В Марковской теории (Wilemski-Fixman) это время можно описать при помощи равновесных автокорреляционных функций. Однако, согласно теории Guérin, в случае не-Марковских процессов, для его описания требуется функция памяти μ(t) (Eq. (3) в [Guérin et al. Nature. 534 (2016) 356]). μ(t) позволит определить признаки не-Марковского процесса и охарактеризовать его, т.к. в случае Марковского процесса эта функция пропорциональна равновесной автокорреляционной функции для выбранного вектора.
Важно отметить, что наличие не-Марковского процесса косвенно подтверждается исследованиями диффузионных свойств дендримерных макромолекул с помощью молекулярно-динамического моделирования, которые указывают на необходимость использования аномально длинной траектории для выхода на диффузионный режим. Причем наши исследования указывают на отсутствие дополнительного классического сабдиффузионного режима (т.е. наличие фиксированного наклона функции ln(MSD(ln(t)), но отличного от 1).


План работ по годам
Первый год
1.1.1) Синтез фуллеренов (С60 и С70) и фуллеренолов (С60(OH)x, С70(OH)x, где x = 20÷40) в количестве, необходимом для проведения экспериментов в п. 1.2.1).
1.1.2) Синтез пептидных дендримеров (Lys, Lys-2Gly и Lys-2His) в количестве, необходимом для проведения экспериментов в п. 1.2.1) и 1.2.2).
1.1.3) Разработка метода синтеза коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксифуллеренами (С60 и С70).

1.2.1) Подготовка комплексов пептидных дендримеров и экспериментальные исследования методом ЯМР (Lys, Lys-Gly, Lys-2His) с фуллеренами (и производными (С60, С70, С60(OH)x, С70(OH)x, где x = 20÷40). Анализ равновесных и динамических свойств.
1.2.2) Экспериментальные исследования методом МУРР комплексов пептидных дендримеров (Lys, Lys-Gly, Lys-2His) с фуллеренами и производными (С60, С70, С60(OH)x, С70(OH)x, где x = 20÷40).

1.3.1) Моделирование комплексов пептидных дендримеров (Lys, Lys-Gly, Lys-2His) с фуллеренами и производными (С60 и/или С70, С60(OH)x и/или С70(OH)x, где x = 20÷40). Сборка системы и исследование равновесных свойств.
1.3.2) Исследование влияния релаксации ветвей на диффузионные свойства карбосилановых дендримеров в растворе с помощью молекулярно-динамического моделирования.
1.3.3) Подготовка системы и параметров моделирования для исследования процесса деинкапсуляции фуллерена из карбосиланового дендримера в растворе.

Второй год
2.1.1) Синтез карбоксилированных производных фуллеренов (С60, С70), необходимыми для проведения синтеза в п. 2.1.2).
2.1.2) Синтез коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксилированными производными фуллеренов, необходимыми для проведения эксперимента в п. 2.2.1) и 2.2.2).
2.1.3) Разработка методики синтеза коньюгатов пептидных дендримеров с эндофуллеренами с атомом Gd и их прозводными.

2.2.1) Экспериментальные исследования методом ЯМР коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксилированными производными фуллеренов.
2.2.2) Экспериментальные исследования методом МУРР коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксилированными производными фуллеренов.

2.3.1) Моделирование коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксилированными производными фуллеренов. Сборка системы и исследование свойств.
2.3.2) Моделирование комплексов пептидных дендримеров (Lys, Lys-Gly, Lys-2His) с фуллеренами и их производными. Расчет ЯМР релаксации.
2.3.3) Моделирование данных для исследования процесса деинкапсуляции фуллерена из карбосиланового дендримера в растворе.

Третий год
3.1.1) Синтез гидрокси- и/или карбокси-производных эндофуллерена с атомом Gd (Gd@C2n, n = 30÷50), необходимых для проведения синтеза в п. 3.1.2). Синтез коньюгатов пептидных дендримеров с производными эндофуллеренов из п. 3.1.1).

3.2.1) Исследования методом ЯМР коньюгатов пептидных дендримеров с производными эндофуллеренов из п. 3.1.1).
3.2.2) Исследования методом МУРР коньюгатов пептидных дендримеров с производными эндофуллеренов из п. 3.1.1).
3.2.3) Проведение цитологических исследований на линиях раковых клеток для наиболее перспективных систем, исследованных ранее в проекте.

3.3.1) Моделирование коньюгатов пептидных дендримеров с карбоксилированными производными фуллеренов при различных температурах. Расчет ЯМР релаксации.
3.3.2) Обработка и аналитический анализ данных моделирования процесса деинкапсуляции фуллерена из карбосиланового дендримера в растворе.

[5] Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (указываются основные ранее полученные результаты

частники Проекта имеют уникальный опыт теоретического и экспериментального исследования дендримеров [1–45] в том числе и пептидных дендримеров [6–8,10,14,23,25–27,29,30,32,33,35,36,38–40].
Опыт исследования пептидных дендримеров, который был накоплен в ходе работы над предыдущим гранте РНФ № 19-13-00087, будет использован для реализации данного Проекта. Этот опыт заключается в одновременном экспериментальном и теоретическом изучении новых пептидных дендримерных структур: от синтеза и физико-химических исследований до молекулярно-динамического моделирования с использованием детальной атомистической модели. Далее, подробно описывается опыт синтеза, экспериментальных исследований и компьютерного моделирования пептидных дендримеров, так как он является необходимым пререквизитом для реализации данного Проекта.

Компьютерное моделирование

Коллектив Проекта обладает большим опытом атомистического моделирования дендримеров [6,7,10,14,19,25,27,28,36,38–40], большая часть которого посвящена исследованию пептидных дендримеров [6,7,10,14,25,27,36,38–40].
Предложены и апробированы полноатомные модели новых типов модифицированных лизиновых дендримеров с повторяющейся единицей Lys-2Lys [25], Lys-2Gly [25], Lys-2Arg [36] и Lys-2His [38], спейсеры которых (2Lys, 2Gly, 2Arg и 2His, соответственно) содержат дополнительные включения двойных аминокислотных остатков.
Для Lys-2Lys и Lys-2Gly дендримеров, 2Gly) нами впервые было проведено полноатомное молекулярно-динамическое моделирование [25]. Было установлено, что Lys-2Gly дендример имеет довольно компактную конформацию сходную с конформацией обычного Lys дендримера, но с большими флуктуациями размеров.
В отличие от этих дендримеров, у которых заряжены только концевые группы, Lys-2Lys дендример с заряженными спейсерами имеет большие размеры и обладает существенно большим свободным объемом внутри макромолекулы. Этот факт, позволяет утверждать, что новый Lys-2Lys дендример имеет хорошие перспективы для использования в качестве наноконтейнера для доставки лекарственных препаратов.
Нами были предложены и апробированы полноатомные модели еще двух новых типов лизинсодержащих дендримеров второго поколения с повторяющимися фрагментами Lys-2Arg и Lys-2His. Lys-2Arg дендример имеет сходное распределение заряженных групп с Lys-2Lys дендримером. У Lys-2His дендримера аминокислотные остатки гистидина могут быть незаряженными (нейтральный His, при нормальном pH) или заряженными (протонированный Hisp, при пониженных pH). Установлено, что размеры (гидродинамический радиус) и флуктуации размеров у сильнозаряженных дендримеров Lys-2Arg, Lys-2Hisp и Lys-2Lys (у которых заряжены не только концевые лизиновые сегменты, но и все аминокислотные остатки (2Arg, 2Hisp и 2Lys во внутренних спейсерах)) близки друг к другу и больше, чем у слабозаряженного Lys-2His дендримера с незаряженными 2His вставками и заряженными концевыми лизинами. Сопоставление этих данных с экспериментом, проведенным в рамках данного Проекта, дало хорошее качественное согласие. Также нами показано, что все рассмотренные сильнозаряженные дендримеры сильно растянуты. В случае Lys-2His дендримера с незаряженным 2His боковыми сегментами (т.е. при нормальном pH) плотность во внутренней области намного выше, чем для остальных рассмотренных дендримеров даже по сравнению с Lys-2Gly. Таким образом, при нормальном pH дендример переходит в коллапсированное состояние. Нами также было показано, что эффект спаривания боковых имидазольных групп намного сильнее в дендримере с нейтральными гистидинами (2His), чем в дендримере с протонированными гистидинами (2Hisp). С помощью дополнительного моделирования нами было установлено, что емкость наноконтейнера на основе этого дендримера с протонированными гистидинами значительно больше, чем у наноконтейнера с нейтральными гистидинами.

Из данных моделирования были получены температурные зависимости ЯМР релаксации для всех исследуемых дендримеров и было показано, что они находятся в хорошем согласии с экспериментальными данными по ЯМР релаксации.


Синтез

- пептидные дендримеры

Коллектив Проекта имеет уникальный опыт синтеза пептидных дендримеров, начиная с пионерских работ Г.П. Власова и участницы нашего прошлого и данного РНФ проекта И.И. Тарасенко с сотрудниками Института высокомолекулярных соединений РАН [35]. За последнее время в методике синтеза новых пептидных дендримеров участниками коллектива достигнут большой успех. А именно, проведен синтез новых пептидных дендримеров спейсеры, которых содержат дополнительные включения одинаковых двойных аминокислотных остатков: лизина (Lys-2Lys) [26], глицина (Lys-2Gly) [26], аргинина (Lys-2Arg) [29], гистидина (Lys-2His) [30]. Также в настоящее время синтезированы дендимеры со смешанными дипептидными спейсерами: Lys-Arg-His и Lys-His-Arg (публикации по этим дендримерам в настоящее время готовятся к печати). Для иллюстрации все упомянутые структуры дендримеров приведены в Приложенном файле на рис. 4-7. Разработанные нами методики синтеза дендримеров с различными аминокислотными остатками открывают практически неограниченные возможности для “конструирования” дендримеров c требуемыми свойствами.

- фуллерены и их производные

Участники проекта (М.В. Суясова, И.С. Рябоконь) имеют значительный опыт в области получения и исследования фуллеренов, эндометаллофуллеренов и их производных. Получены патенты на способ получения водорастворимых гидроксилированных производных эндометаллофуллеренов лантаноидов и способ получения эндофуллеренов 3d-металлов [Патент на изобретение RU 2664133 C1, 15.08.2018. Заявка № 2017108883 от 16.03.2017.; Патент на изобретение RU 2659972 C1, 04.07.2018. Заявка № 2016151106 от 23.12.2016.].
Ими впервые были получены с высоким выходом смесевые водорастворимые металлоуглеродные наноструктуры с инкапсулированными атомами железа 3d-металлов [46].
Водорастворимые производные эндофуллеренов с инкапсулированным атомом металла (эндометаллофуллеренолов (ЭМФ)), железа или гадолиния, являются перспективными агентами для улучшения изображений в магнитно-резонансной томографии [47]. Также были проведены исследования по глубокому экстрагированию фуллеренов из электродуговой сажи [48].
При использовании огромного потенциала имеющегося оборудования в НИЦ “Курчатовский институт” - ПИЯФ (ядерный реактор ВВР-М, протонный ускоритель СЦ-1000) были получены радиометаллофуллерены на основе ЭМФ, включающие перспективные изотопы для биомедицинских применений, изучена радиационная стойкость фуллеренов, ЭМФ и их водорастворимых производных при реакторном облучении [49–53]
При исследовании и практическом применении эндометаллофуллеренолов возникает задача приготовления их растворов заданного состава с регулируемыми свойствами при обеспечении стабильности структуры и физико-химических свойств, что является общей проблемой динамической устойчивости систем с самоорганизацией. В этой связи в целях эффективного применения фуллеренов и их производных в медицине были проведены систематические исследования условий и механизмов их агрегации в водных растворах методами малоуглового рассеяния нейтронов (МУРН) и рассеяния поляризованных нейтронов [51,54,55].
Суясова М.В. участвовала в реализации гранта РФФИ 19-03-00249 А “Разработка, исследования структуры, проводящих и физико-химических свойств протонопроводящих мембран с наноалмазами”, в ходе которого получен опыт в создании нового композита “полимер-наноалмаз” с протонной проводимостью при сохранении прочности и температурной стабильности полимерной матрицы; при реализации гранта РФФИ 18-29-19008 мк “Металлоуглеродные наноструктурированные материалы для биомедицины” ею был получен опыт в области синтеза, анализа свойств полученных объектов физико-химическими и ядерно-физическими методами; при реализации гранта РФФИ 15-04-99647 А “Фуллерены в терапии нейродегенеративных заболеваний”, в ходе которого получен опыт получения высокочистых фуллеренов и их гидроксипроизводных, а также установления токсичности полученных объектов.


Эксперимент

- ЯМР спектроскопия и ЯМР релаксация

Экспериментальные исследования методом ЯМР являются, пожалуй, наиболее эффективным методом исследования биологических систем (пептидов, протеинов, ДНК и т. д, например см. обзоры [56,57]). Развитие технологии ЯМР релаксации для медицины привело к созданию уникального метода диагностики (магнитно-резонансной томографии), который в настоящее время доступен практически каждому пациенту (интересно, что слово ядерная было исключено из названия медицинского метода, чтобы не запугивать пациентов и врачей, которые могли подумать, что этот безвредный метод как-то связан с радиацией). Участники Проекта имеют большой опыт применения метода ЯМР для исследования дендримеров. Использование методов одномерной и двумерной ЯМР спектроскопии (1Н, 13С, COSY, HMBC, HSQC) позволило не только независимо подтвердить структуры синтезированных дендримеров, но и получить информацию об их равновесных свойствах [29,30]. В частности, обнаружена возможность стабильного дейтерирования С2 атома углерода имидазольного кольца гистидина в Lys-2His дендримере до 70%. Возможность прямого дейтерирования расширяет спектр потенциальных биологических и медицинских применений меченых His-модифицированных пептидных дендримеров. Экспериментальное исследование диффузионных свойств позволило судить о размерах исследуемых дендримеров [30].

Важно отметить, что теория ЯМР релаксации в дендримерах была построена участниками Проекта [1,11,13,14,16,17,19–21,31,44] и экспериментально проверена, в том числе для пептидных дендримеров [26,29]. С помощью развитой теории были проанализированы экспериментальные данные, и проведено сопоставление теории с результатами компьютерного моделирования. Эти исследования позволили фактически развить теорию ЯМР релаксации для групп, находящихся в боковых сегментах спейсеров пептидных дендримеров [25,36]. С помощью ЯМР релаксации в Lys-2His дендримере было обнаружено замедление ориентационной подвижности внутренних СН2 групп при увеличении pH c 1.1 до 7. Как показали результаты моделирования (см. ниже) это связано с изменением глобальной конформации дендримера с набухшей (при pH=1.1) на коллапсированную (при pH=7).


- Малоугловое рентгеновское рассеяние

Участник Проекта П.В. Конарев имеет большой опыт работы на малоугловых станциях различных синхротронов с последующим анализом полученных данных. Он длительное время успешно сотрудничает с группой Д.И. Свергуна (EMBL, Гамбург, Германия), являющейся одним из лидеров в области структурного исследования растворов макромолекул методом малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР). П.В. Конарев принимал непосредственное участие в разработке программного пакета ATSAS [https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/software.html], который в настоящее время насчиывает более 10000 пользователей из более чем 2000 лабораторий по всему миру. Использование данного пакета применительно к настоящему Проекту позволит получить важную структурную информацию об исследуемых соединениях, включая определение таких структурных параметров, как радиус инерции и максимальный размер частиц.
Можно выделить следующие возможности пакета ATSAS:
- предварительная обработка экспериментальных данных МУРР с привлечением методов сингулярного анализа и непараметрической статистики;
- уникальные методы интерпретации данных рассеяния монодисперсными растворами биологических макромолекул (ab initio определение формы и структуры частиц низкого разрешения, позиционирование доменов в комплексах белков и молекул ДНК/РНК, достройка неполных кристаллических структур молекул и т.д.);
- метод восстановления трехмерной формы промежуточных состояний в динамических биологических системах по данным малоуглового рассеяния [58];
- обработка данных рассеяния регуляризационными методами, позволяющая рассчитывать размерные распределения наночастиц в изотропных дисперсных системах [59,60];
- методы восстановления структурных параметров липидных везикул и профиля электронной плотности липидного бислоя, анализ липидно-белковых взаимодействий [61];
- алгоритмы выделения интенсивности рассеяния от индивидуальных компонент белковых смесей в малоугловых экспериментах с использованием хроматографической колонки [62].
Таким образом, наличие пакета ATSAS, возможность быстрой адаптации входящих в него программ под конкретные задачи Проекта, имеющийся опыт работы исполнителей Проекта в области развития методов анализа данных МУРР и исследований биологических макромолекул в растворе безусловно поможет успешно решить поставленные в Проекте задачи.


- Биологические исследования

Совместно с группой профессора B. Klajnert-Maculewicz (Университет г. Лодз, Польша) участниками Проекта были впервые проведены цитологические исследования in vitro для пептидных дендримеров Lys-2Lys, Lys-2Gly, Lys-2Arg, Lys-2His [32,33].
Исследование Lys-2Lys и Lys-2Gly показало, что эти дендримеры токсичны для раковых клеток и мало токсичны для нормальных клеток [32]. Также было установлено, что эффективность нового Lys-2Lys дендримера для доставки генетического материала в раковые клетки сравнима с эффективностью коммерческого липофектамина (при меньшей токсичности Lys-2Lys для нормальных клеток) и превышает эффективность Lys-2Gly. Таким образом, Lys-2Lys является перспективным носителем для доставки ДНК и РНК.
Было проведено экспериментальное исследование возможности применения новых Lys-2Arg и Lys-2His дендримеров для доставки малой информационной РНК в клетки. Измеренный зета-потенциал Lys-2Arg дендримера в воде оказался в два раза выше, чем зета-потенциал Lys-2His дендримера (величина зета-потенциала равна 23,9 и 10,4 соответственно), а в фосфатном буфере (PBC) это различие даже больше и составляет два с половиной раза (величина зета-потенциала равна 14,0 и 6,1, соответственно). Также были получены зависимости зета-потенциалов комплексов этих дендримеров с ми-РНК от доли дендримеров в комплексе и показано, что потенциалы комплексов с обоими дендримерами быстро выходят на насыщение. Цитотоксичность Lys-2Arg и Lys-2His дендримеров определенная по стандартному показателю IC50 (значению концентрации, вызывающему 50% ингибирование роста популяции клеток) для Lys-2Arg дендримера оказалась ниже, а для Lys-2His существенно ниже, чем для широко используемых ПАМАМ и ППИ дендримеров, а также ниже, чем для стандартного коммерческого агента трансфекции липофектамина 2000.
Эффективность поглощения двумя линиями (THP-1 и U937) клеток ми-РНК, переносимой этими дендримерами, была исследована с помощью проточной цитометрии. Для меченных флуоресцеином ми-РНК молекул (siRNA-FITC) для обоих исследованных дендримеров и обеих линий клеток оказалось, что процент FITC-положительных клеток обеих клеточных линий всегда был выше 94% независимо от времени инкубации. Это существенно больше, чем для липофектамина 2000, который дает поглощение ми-РНК молекул равное 49%, 64% и 79% (для линии клеток THP-1, при 24, 48 и 72 ч инкубации, соответственно) и 61%, 72% и 77% 0,5% (для линий клеток U937, при 24, 48 и 72 часа инкубации соответственно). Проведенные эксперименты показали, что Lys-2Arg и Lys-2His дендримеры способны образовывать комплексы с ми-РНК, и полученные дендриплексы отличаются сильным взаимодействием обоих дендримеров с ми-РНК. Использование новых пептидных дендримеров позволило получить нетоксичные и высокоэффективные системы доставки ми-РНК in vitro, увеличивающие клеточное поглощение молекул нуклеиновой кислоты по сравнению с коммерчески доступным агентом трансфекции.
Цитологические исследования, запланированные в данном Проекте будут проводиться в Ресурсном центре ОМРБ (НИК “КИ” - ПИЯФ). Здесь важно отметить, что И.С. Рябоконь уже имеет опыт исследований в данном Ресурсном центре [63,64], а также выполняет исследования производных фуллерена для кандидатской диссертации.
В дополнение, к разделу экспериментальные исследования хотелось бы отметить опыт сотрудничества участников Проекта с различными ведущими мировыми группами. Например, были опубликованы результаты успешного сотрудничества участников Проекта с нобелевским лауреатом H.W Kroto (нобелевская премия за открытие фуллеренов) [65,66], в том числе при участии руководителя Проекта [65].


Список литературы

1. Gotlib, Y.Y.; Markelov, D.A. Theory of the Relaxation Spectrum of a Dendrimer Macromolecule. Polym. Sci. Ser. A 2002, 44, 1341–1350.
2. Neelov, I.; B. Adolf, D. Brownian Dynamics Simulation of Hyperbranched Polymers under Elongational Flow: Bead-Rod Model with Hydrodynamic Interactions. Macromolecules 2003, 36, 6914–6924.
3. Markelov, D.A.; Lähderanta, E.; Gotlib, Y.Y. Influence of Modified Terminal Segments on Dynamic Modulus and Viscosity of Dendrimer. Macromol. Theory Simulations 2010, 19, 158–169.
4. Markelov, D.A.; Matveev, V. V; Ingman, P.; Lahderanta, E.; Boiko, N.I. Average relaxation time of internal spectrum for carbosilane dendrimers: Nuclear magnetic resonance studies. J. Chem. Phys. 2011, 135, 124901.
5. Markelov, D.A.; Mazo, M.A.; Balabaev, N.K.; Gotlib, Y.Y. Temperature dependence of the structure of a carbosilane dendrimer with terminal cyanobiphenyl groups: Molecular-dynamics simulation. Polym. Sci. Ser. a 2013, 55, 53–60.
6. Neelov, I.M.; Markelov, D.A.; Falkovich, S.G.; Ilyash, M.Y.; Okrugin, B.M.; Darinskii, A.A. Mathematical simulation of lysine dendrimers: Temperature dependences. Polym. Sci. Ser. C 2013, 55, 154–161.
7. Falkovich, S.; Markelov, D.; Neelov, I.; Darinskii, A. Are structural properties of dendrimers sensitive to the symmetry of branching? Computer simulation of lysine dendrimers. J. Chem. Phys. 2013, 139, 064903.
8. Neelov, I.M.; Janaszewska, A.; Klajnert, B.; Bryszewska, M.; Makova, N.Z.; Hicks, D.; Pearson, H.A.; Vlasov, G.P.; Ilyash, M.Y.; Vasilev, D.S.; et al. Molecular Properties of Lysine Dendrimers and their Interactions with aβ-peptides and Neuronal Cells. Curr. Med. Chem. 2013, 20, 134–143.
9. Markelov, D.A.; Popova, M. V.; Matveev, V. V. Some structural characteristics of self-associates in the system hydrophobic dendrimer-sodium octanoate-water based on 13C NMR data. Russ. Chem. Bull. 2013, 62, 2116–2121.
10. Neelov, I.M.; Falkovich, S.; Markelov, D.; Paci, E.; Darinskii, A.; Tenhu, H. Molecular Dynamics of Lysine Dendrimers. Computer Simulation and NMR. In Dendrimers in Biomedical Applications; Royal Society of Chemistry: Cambridge, 2013; pp. 99–114 ISBN 978-1-84973-611-4.
11. Markelov, D.A.; Dolgushev, M.; Gotlib, Y.Y.; Blumen, A. NMR relaxation of the orientation of single segments in semiflexible dendrimers. J. Chem. Phys. 2014, 140, 244904.
12. Markelov, D.A.; Polotsky, A.A.; Birshtein, T.M. Formation of a “Hollow” interior in the fourth-generation dendrimer with attached oligomeric terminal segments. J. Phys. Chem. B 2014, 118, 14961–14971.
13. Gurtovenko, A.A.; Markelov, D.A.; Gotlib, Y.Y.; Blumen, A. Dynamics of dendrimer-based polymer networks. J. Chem. Phys. 2003, 119, 7579–7590.
14. Markelov, D.A.; Falkovich, S.G.; Neelov, I.M.; Ilyash, M.Y.; Matveev, V. V.; Lähderanta, E.; Ingman, P.; Darinskii, A.A. Molecular dynamics simulation of spin–lattice NMR relaxation in poly-L-lysine dendrimers: manifestation of the semiflexibility effect. Phys. Chem. Chem. Phys. 2015, 17, 3214–3226.
15. Markelov, D.A.; Matveev, V. V; Ingman, P.; Nikolaeva, M.N.; Penkova, A. V; Lahderanta, E.; Boiko, N.I.; Chizhik, V.I. Unexpected Temperature Behavior of Polyethylene Glycol Spacers in Copolymer Dendrimers in Chloroform. Sci. Rep. 2016, 6, 24270.
16. Shavykin, O. V; Neelov, I.M.; Darinskii, A.A. Is the manifestation of the local dynamics in the spinlattice NMR relaxation in dendrimers sensitive to excluded volume interactions? Phys. Chem. Chem. Phys. 2016, 18, 24307–24317.
17. Dolgushev, M.; Markelov, D.A.; Fürstenberg, F.; Guérin, T. Local orientational mobility in regular hyperbranched polymers. Phys. Rev. E 2016, 94, 012502.
18. Shishkin, A.N.; Markelov, D.A.; Matveev, V. V. Molecular dynamics simulation of poly(butyl)carbosilane dendrimer melts at 600 K. Russ. Chem. Bull. 2016, 65, 67–74.
19. Markelov, D.A.; Shishkin, A.N.; Matveev, V. V; Penkova, A. V; Lähderanta, E.; Chizhik, V.I. Orientational Mobility in Dendrimer Melts: Molecular Dynamics Simulations. Macromolecules 2016, 49, 9247–9257.
20. Markelov, D.A.; Dolgushev, M.; Lähderanta, E. NMR Relaxation in Dendrimers. In Annual Reports on NMR Spectroscopy; Webb, G.A., Ed.; Academic Press, 2017; Vol. 91, pp. 1–66 ISBN 0066-4103.
21. Dolgushev, M.; Schnell, S.; Markelov, D.A. Local NMR Relaxation of Dendrimers in the Presence of Hydrodynamic Interactions. Appl. Magn. Reson. 2017, 48, 657–671.
22. Matveev, V. V; Markelov, D.A.; Dvinskikh, S. V; Shishkin, A.N.; Tyutyukin, K. V; Penkova, A. V; Tatarinova, E.A.; Ignat’eva, G.M.; Milenin, S.A. Investigation of Melts of Polybutylcarbosilane Dendrimers by 1H NMR Spectroscopy. Sci. Rep. 2017, 7, 13710.
23. Okrugin, B.M.; Neelov, I.M.; Leermakers, F.A.M.; Borisov, O. V Structure of asymmetrical peptide dendrimers: Insights given by self-consistent field theory. Polymer (Guildf). 2017, 125, 292–302.
24. Gotlib, Y.Y.; Markelov, D.A. Permittivity of a dendrimer containing polar groups. Polym. Sci. Ser. A 2004, 46, 815–832.
25. Mikhtaniuk, S.; Bezrodnyi, V.; Shavykin, O.; Neelov, I.; Sheveleva, N.; Penkova, A.; Markelov, D. Comparison of Structure and Local Dynamics of Two Peptide Dendrimers with the Same Backbone but with Different Side Groups in Their Spacers. Polymers (Basel). 2020, 12, 1657.
26. Sheveleva, N.N.; Markelov, D.A.; Vovk, M.A.; Mikhailova, M.E.; Tarasenko, I.I.; Neelov, I.M.; Lähderanta, E. NMR studies of excluded volume interactions in peptide dendrimers. Sci. Rep. 2018, 8, 8916.
27. Okrugin, B.; Ilyash, M.; Markelov, D.; Neelov, I. Lysine Dendrigraft Nanocontainers. Influence of Topology on Their Size and Internal Structure. Pharmaceutics 2018, 10, 129.
28. Dolgushev, M.; Markelov, D.A.; Lähderanta, E. Linear Viscoelasticity of Carbosilane Dendrimer Melts. Macromolecules 2019, 52, 2542–2547.
29. Sheveleva, N.N.; Markelov, D.A.; Vovk, M.A.; Mikhailova, M.E.; Tarasenko, I.I.; Tolstoy, P.M.; Neelov, I.M.; Lähderanta, E. Lysine-based dendrimer with double arginine residues. RSC Adv. 2019, 9, 18018–18026.
30. Sheveleva, N.N.; Markelov, D.A.; Vovk, M.A.; Tarasenko, I.I.; Mikhailova, M.E.; Ilyash, M.Y.; Neelov, I.M.; Lahderanta, E. Stable Deuterium Labeling of Histidine-Rich Lysine-Based Dendrimers. Molecules 2019, 24, 2481.
31. Sheveleva, N.N.; Dolgushev, M.; Lähderanta, E.; Markelov, D.A. NMR Relaxation of Functionalized Dendrimers. Macromolecules 2019, 52, 9766–9772.
32. Gorzkiewicz, M.; Konopka, M.; Janaszewska, A.; Tarasenko, I.I.; Sheveleva, N.N.; Gajek, A.; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Application of new lysine-based peptide dendrimers D3K2 and D3G2 for gene delivery: Specific cytotoxicity to cancer cells and transfection in vitro. Bioorg. Chem. 2020, 95, 103504.
33. Gorzkiewicz, M.; Kopeć, O.; Janaszewska, A.; Konopka, M.; Pędziwiatr-Werbicka, E.; Tarasenko, I.I.; Bezrodnyi, V. V; Neelov, I.M.; Klajnert-Maculewicz, B. Poly(lysine) Dendrimers Form Complexes with siRNA and Provide Its Efficient Uptake by Myeloid Cells: Model Studies for Therapeutic Nucleic Acid Delivery. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 3138.
34. Shavykin, O. V.; Neelov, I.M.; Borisov, O. V.; Darinskii, A.A.; Leermakers, F.A.M. SCF Theory of Uniformly Charged Dendrimers: Impact of Asymmetry of Branching, Generation Number, and Salt Concentration. Macromolecules 2020, 53, 7298–7311.
35. Vlasov, G.P.; Korol’kov, V.I.; Pankova, G.A.; Tarasenko, I.I.; Baranov, A.N.; Glazkov, P.B.; Kiselev, A. V.; Ostapenko, O. V.; Lesina, E.A.; Baranov, V.S. Lysine Dendrimers and Their Starburst Polymer Derivatives: Possible Application for DNA Compaction and in vitro Delivery of Genetic Constructs. Russ. J. Bioorganic Chem. 2004, 30, 12–20.
36. Bezrodnyi, V. V.; Shavykin, O. V.; Mikhtaniuk, S.E.; Neelov, I.M.; Sheveleva, N.N.; Markelov, D.A. Why the Orientational Mobility in Arginine and Lysine Spacers of Peptide Dendrimers Designed for Gene Delivery Is Different? Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 9749.
37. Markelov, D.A.; Semisalova, A.S.; Mazo, M.A. Formation of a Hollow Core in Dendrimers in Solvents. Macromol. Chem. Phys. 2021, 222, 2100085.
38. Bezrodnyi, V. V.; Mikhtaniuk, S.E.; Shavykin, O. V.; Neelov, I.M.; Sheveleva, N.N.; Markelov, D.A. Size and Structure of Empty and Filled Nanocontainer Based on Peptide Dendrimer with Histidine Spacers at Different pH. Molecules 2021, 26, 6552.
39. Neelov, I.; Popova, E.; Khamidova, D.; Tarasenko, I. Interaction of lysine dendrimers with therapeutic peptides. Molecular dynamics simulation. Int. J. Biol. Biomed. Eng. 2017, 11, 194–203.
40. Khamidova, D.N.; Bezrodnyi, V. V.; Popova, A. V.; Mikhtaniuk, S.E.; Neelov, I.M.; Popova, E. V. Molecular dynamics simulation of complexes of lysine dendrimer and dendrigraft with AENG tetrapeptide. Int. J. Biol. Biomed. Eng. 2018, 12, 45–58.
41. Mazo, M.A.; Shamaev, M.Y.Y.; Balabaev, N.K.; Darinskii, A.A.; Neelov, I.M. Conformational mobility of carbosilane dendrimer: Molecular dynamics simulation. Phys. Chem. Chem. Phys. 2004, 6, 1285–1289.
42. Gotlib, Y.Y.; Markelov, D.A. Theory of orientational relaxation of individual specified units in a dendrimer. Polym. Sci. Ser. A 2007, 49, 1137–1154.
43. Markelov, D.A.; Gotlib, Y.Y.; Darinskii, A.A.; Lyulin, A. V; Lyulin, S. V Local orientational mobility in dendrimers. Theory and computer-aided simulation. Polym. Sci. Ser. A 2009, 51, 331–339.
44. Markelov, D.A.; Lyulin, S. V.; Gotlib, Y.Y.; Lyulin, A. V.; Matveev, V. V.; Lahderanta, E.; Darinskii, A.A. Orientational mobility and relaxation spectra of dendrimers: Theory and computer simulation. J. Chem. Phys. 2009, 130, 1–9.
45. Markelov, D.A.; Matveev, V. V.; Ingman, P.; Nikolaeva, M.N.; Lähderanta, E.; Shevelev, V.A.; Boiko, N.I. NMR Studies of Carbosilane Dendrimer with Terminal Mesogenic Groups. J. Phys. Chem. B 2010, 114, 4159–4165.
46. Седов В.П.; Борисенкова А.А.; Фомин С.В.; Суясова М.В.; Орлова Д.Н.; Фокин Н.С.; А.С., К. Переработка металлсодержащих гальванических шламов в смесевые водорастворимые металлоуглеродные структуры. Журнал прикладной химии 2021, 94.
47. Suyasova, M. V.; Lebedev, V.T.; Sedov, V.P.; Kulvelis, Y. V.; Ievlev, A. V.; Chizhik, V.I.; Artemiev, A.N.; Belyaev, A.D. Proton Spin Relaxation in Aqueous Solutions of Self-assembling Gadolinium Endofullerenols. Appl. Magn. Reson. 2019, 50, 1163–1175.
48. Sedov, V.P.; Borisenkova, A.A.; Suyasova, M. V.; Orlova, D.N.; Ivanov, A. V.; Fomin, S. V.; Krivorotov, A.S. Deep Extraction of Fullerene-Containing Carbon Black with a Polar Solvent: Analysis of Products. Russ. J. Appl. Chem. 2020, 93, 527–539.
49. Suyasova, M.V.; Borisenkova, A.A.; Shilin, V.A.; Sedov, V.P.; Orlova, D.N. Investigation of physicochemical properties and radiation resistance of fullerene and endohedral metallofullerene derivatives under the ionizing radiation influence. Nanosyst. Physics, Chem. Math. 2019, 10, 447–455.
50. Dubovskii, I.M.; Lebedev, V.T.; Shilin, V.A.; Szhogina, A.A.; Suyasova, M. V.; Sedov, V.P. Study of the Radiation Resistance of Endohedral Fullerenes of Rare-Earth Elements and Their Water-Soluble Derivatives. Crystallogr. Reports 2018, 63, 132–138.
51. Szhogina, A.A.; Shilin, V.A.; Sedov, V.P.; Lebedev, V.T. Radiation resistance of endohedral metallofullerenols under neutron irradiation. Crystallogr. Reports 2016, 61, 666–669.
52. Shilin, V.A.; Lebedev, V.T.; Sedov, V.P.; Szhogina, A.A. Synthesis and radiation resistance of fullerenes and fullerene derivatives. Crystallogr. Reports 2016, 61, 670–674.
53. Shilin, V.A.; Szhogina, A.A.; Suyasova, M.V.; Sedov, V.P.; Lebedev, V.T.; Kozlov, V.S. Fullerenes and fullerenols survival under irradiation. Nanosyst. Physics, Chem. Math. 2016, 146–152.
54. Lebedev, V.T.; Szhogina, A.A.; Suyasova, M. V Neutron studies of paramagnetic fullerenols’ assembly in aqueous solutions. J. Phys. Conf. Ser. 2018, 994, 012005.
55. Szhogina, A.A.; Kul’velis, Y. V.; Lebedev, V.T.; Sedov, V.P. Aggregation of iron-containing fullerenols in aqueous solutions. Russ. J. Appl. Chem. 2015, 88, 2009–2014.
56. Foster, M.P.; McElroy, C.A.; Amero, C.D. Solution NMR of Large Molecules and Assemblies. Biochemistry 2007, 46, 331–340.
57. Mittermaier, A.; Kay, L.E. New Tools Provide New Insights in NMR Studies of Protein Dynamics. Science (80-. ). 2006, 312, 224–228.
58. Konarev, P. V.; Svergun, D.I. Direct shape determination of intermediates in evolving macromolecular solutions from small-angle scattering data. IUCrJ 2018, 5, 402–409.
59. Kryukova, A.E.; Konarev, P.V.; Volkov, V.V.; Asadchikov, V.E. Restoring silicasol structural parameters using gradient and simulation annealing optimization schemes from small-angle X-ray scattering data. J. Mol. Liq. 2019, 283, 221–224.
60. Волков, В.В.; Конарев, П.В.; Крюкова, А.Е. Комбинированная схема восстановления функции распределения частиц по размерам с использованием данных малоуглового рассеяния. Письма в журнал экспериментальной и теоретической физики 2020, 112, 632–636.
61. Konarev, P. V.; Gruzinov, A.Y.; Mertens, H.D.T.; Svergun, D.I. Restoring structural parameters of lipid mixtures from small-angle X-ray scattering data. J. Appl. Crystallogr. 2021, 54, 169–179.
62. Konarev, P. V.; Graewert, M.A.; Jeffries, C.M.; Fukuda, M.; Cheremnykh, T.A.; Volkov, V. V.; Svergun, D.I. EFAMIX, a tool to decompose inline chromatography SAXS data from partially overlapping components. Protein Sci. 2022, 31, 269–282.
63. Большакова, О.И., Рябоконь, И.С., Борисенкова, А.А., Саранцева, С.В. Токсичность и биологические свойства комплексов, содержащих фуллерены. In Proceedings of the Сборник трудов XVI международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии»; 2020; pp. 105–106.
64. Рябоконь, И. С., Большакова, О.И., Борисенкова, А.А., Саранцева, С.В. Анализ токсичности и антиоксидантных свойств комплексов фуллерена С60 с фолиевой кислотой. In Proceedings of the Сборник тезисов VIII Всероссийского молодёжного научного форума «OpenScience 2021; 2022; p. 174.
65. Penkova, A. V; Acquah, S.F.; Piotrovskiy, L.B.; Markelov, D.A.; Semisalova, A.S.; Kroto, H.W. Fullerene derivatives as nano-additives in polymer composites. Russ. Chem. Rev. 2017, 86, 530–566.
66. Penkova, A. V.; Acquah, S.F.A.; Dmitrenko, M.E.; Chen, B.; Semenov, K.N.; Kroto, H.W. Transport properties of cross-linked fullerenol–PVA membranes. Carbon N. Y. 2014, 76, 446–450.