Задача 1. Верификация процедур выделения белка и метаболитов из корней растений Arabidopsis thaliana L. Heynh. (Сol-0) для анализа редокс-протеома и полномасштабного анализа первичного и вторичного метаболома (с использованием тестовых образцов, полученных из БГУ). Верификация воспроиводимости протеомного и метаболомного анализа на качественном и количественном уровне. Стажировка сотрудников БГУ – обучение методам выделения белка и метаболитов (Гришина Т.В., Вихнина М.В, Соболева А.В.).
Выделение белка и протеомный анализ
Первичная верификация процедур выделения белка из корней растений арабидопсиса была проведена белорусской группой. Однако, поскольку во время выполнения проекта ранее используемый нами и партнерами кислотолабильный анионный детергент (Anionic Acid-labile Surfactant, AALSII), был снят с продажи (что, скорее всего, связано с пандемией COVID19), нами было принято решение перейти на использование принципиально иного подхода, а именно подготовки протеомных образцов на центрифужных фильтрах (Filter-Assisted Sample Preparation, FASP). Этот метод удобен тем, что не требует дорогостоящих импортных реагентов и может использоваться вне зависимости от ограничения их поставок. Однако, с другой стороны, не смотря на сравнительно долгое его использование в протеомике человека и клеточных культур [1], этот подход до сих пор не валидирован для растительных тканей, которые, с точки зрения протеомики, являются наиболее сложными матрицами. Очевидно, что без понимания области линейности данного метода, адекватный анализ растительных образцов может иметь только качественный характер, что недостаточно для выполнения задач данного проекта.
В этой связи, на первом этапе выполнения проекта была проведена валидация метода FASP для тканей арабидопсиса с использованием клеточных лизатов (для которых линейность метода FASP хорошо известна) в качестве референсных образцов. При этом, был принят во внимание тот факт, что для выделения белка может использоваться как традиционно используемый нами метод фенольной экстракции (детально описанный в отчете белорусского партнера) [2], так и альтернативный ему подход, подразумевающий обработку раствором, содержащим детергент, с последующей инкубацией при 95°C [3]. На первом этапе оптимизации было принято решение использовать листья арабидопсиса, как орган, характеризующийся большим диапазоном содержания индивидуальных белков. Таким образом, получение результата в этой более сложной системе будет залогом достижения успеха в работе с корнями. Для симуляции сильных эффектов матрицы, материал растений арабидопсиса смешивался с материалом семян гороха, которые содержат большое количество глобулярных белков, в протеолитических гидролизатах подавляющих ионизацию минорных компонентов [4]. Таким образом, замороженные перемолотые семена гороха и материал листьев арабидопсиса были использованы в различных весовых соотношениях (9:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:9, 0:1) для ко-экстракции белка с помощью фенольной экстракции или обработки детергент-содержащим раствором (4% SDS, w/v). Эффективность триптического протеолиза проверяли с помощью электрофореза в присутствии SDS (Рис. 1).
Поскольку выход белка из семян гороха был в 8 раз выше по сравнению с материалом листьев арабидопсиса (5.4 и 42.2 мг/г исходного материала, соответственно), даже наиболее распространенные белки арабидопсиса выступали в качестве минорных компонентов смешанных белковых изолятов. Поэтому мы оценивали содержание двух белков, характерных для листьев арабидопсиса – большой субъединицы хлоропластной рибулозо-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO, наиболее обильный полипептид листьев, Рис. 2A) и менее обильной активазы RuBisCO (Рис. 2B). Количественное содержание первого белка определяли по сумме интегральных площадей пиков, полученных для m/z 511.2693 ± 0.02, 614.8302 ± 0.02 и 704.3376 ± 0.02 при tR 60.0, 49.4 и 44.6, соответствующих [M+H]2+ ионам протеотипических пептидов DTDILAAFR, DLAVEGNEIIR и LTYYTPEYETK, соответственно, тогда как содержание второго белка – для m/z 504.2741 ± 0.02, 849.3843 ± 0.02 и 576.8606 ± 0.02 при tR 42.2, 40.9 и 67.9, соответствущих ионам [M+2H]2+ протеотипических пептидов FVESLGVEK, GLAYDTSDDQQDITR и VPLILGIWGGK, соответственно.
Как видно из Рис.2, экстракция белка SDS-содержащим раствором обеспечила лучшую линейную корреляцию содержания белков арабидопсиса относительно содержания материала листьев арабидопсиса в исходной смеси материала. Так, использование SDS обеспечило хорошую линейность (значения R2 выше 0.95) вплоть до вклада материала арабидопсиса в 90%, тогда как для фенольной экстракции значения R2 обычно составляли 0.85 или ниже. Однако, когда материал арабидопсиса составлял 50% от общего веса, оба метода экстракции – детергентный и фенольный – обеспечили сходную линейность (значения R2 составили 0.99 и 0.97, соответственно). Скорее всего, наблюдаемые различия объясняются более сильными матричными эффектами, которые могут сопровождать экстракцию с использованием детергентов. Действительно, вторичные метаболиты, которые в данном случае экстрагируются совместно с белками, не могут быть удалены только с помощью ультрафильтрации и могут вызвать ингибирование активности трипсина и подавление ионов. С другой стороны, фенольные изоляты свободны от небелковых загрязнений, и протеолитические пептиды гороха представляли собой единственный фактор подавления ионов в нашей экспериментальной системе. Соответственно, интенсивность сигнала триптических пептидов арабидопсиса увеличивалась, когда вклад белка из семян гороха в общем изоляте уменьшался.
Таким образом, было выявлено, что протокол выделения белка влияет на линейный динамический диапазон методов количественной протеомики на основе FASP. Однако это различие может быть учтено при интерпретации данных и соответствующим образом скорректировано при планировании эксперимента. Поэтому, с учетом полученных данных и имеющегося в группе опыта, было принято решение использовать метод FASP в сочетании с фенольной экстракцией. Результаты этой работы были направлены для публикации в журнал Journal of Proteome Research (IF = 4,1, Q1) и опубликованы как пре-принт на платформе СhemRxiv (doi: 10.26434/chemrxiv.14663448).
На следующем этапе из лаборатории проф. В.В. Демидчика (БГУ) был получен набор образцов корней арабидопсиса, выращенных на гелевой среде. Замороженные корни были перемолоты в барабанно-шаровой мельнице и тотальная фракция белка была выделена из корней с помощью метода фенольной экстракции по стандартному протоколу, рутинно используемому в группе [2]. После определения содержания белка, аликвоты были подвергнуты триптическому протеолизу с помощью метода FASP как описано выше. Образцы были успешно и количественно переварены и, после очистки с помощью твердофазной экстракции, проанализированы с помощью нанопоточной обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией высокого разрешения в режиме онлайн (nanoHPLC-HR-MS). В результате было аннотировано около 1500 уникальных белков, что находится в соответствии, как с возможностями использованного оборудования, так и с современным уровнем развития протеомики [5, 6]. При этом, результат был воспроизводимым как на качественном, так и на количественном уровне. Таким образом, FASP может считаться адекватной альтернативой использованию кислотолабильных детергентов, в связи с чем было принято решение использовать этот метод на последующих этапах проекта, связанных с изучением влияния активных форм кислорода (АФК) на изменение протеома растений арабидопсиса.
Выделение метаболитов и метаболомный анализ
Задачей метаболомных эксперименотов на данном этапе исследования была оценка влияние стандартизированных обработок корней растений смесями, генерирующими активные формы кислорода (АФК), на их метаболизм. Эти данные, в дальнейшем, будут критически важны для понимания механизмов, лежащих в основе изменений редокс протеома корней арабидопсиса в ответ на внесение экзогенных АФК. Для этого был разработана и верифицирована интегрированная платформа пробоподготовки, анализа, процессинга и пост-процессинга метаболомных данных, подразумевающая использование газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС) для анализа термостабильных первичных метаболитов, жидкостной хромато-масс-спектрометрии (УВЭЖХ-МС) семи-полярных вторичных и карбонильных метаболитов. В рамках данного проекта предполагалось получение экстрактов корней A. thaliana, обработанных Н2О2 и смесями (а также отдельными компонентами этих смесей), генерирующими АФК. В эксперименте были использованы корни растений A. thaliana контрольных и обработанных концентрациями 30 или 100 мкмоль/л Cu2+, Н2О2 и аскорбиновой кислотой (в присутствии и отсутствии ионов меди) [7]. C учетом требований данного эксперимента в исходный протокол был внесен и верифицирован ряд изменений, представленных на Рис. 3.
Согласно окончательной оптимизированной и верифицированной схеме, корни, после отделения от побегов, мгновенно замораживались в жидком азоте и были гомогенизированы (до состояния муки) на вибрационной шаровой мельнице в течение 1 мин (скорость вибрации 30 м/с) в предварительно замороженной в жидком азоте металлической размольной камере с металлическим шаром диаметром 15 мм. Для метаболомного анализа были взяты следующие навески замороженного размолотого материала: 1) две навески по 20±2 мг для анализа термостабильных первичных метаболитов газовой хромато-масс-спектрометрией (ГХ-МС) и реактивных карбонильных соединений обращённо-фазовой (ОФ) ультравысокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрией (УВЭЖХ-МС); 2) 25±5 мг для анализа вторичных семи-полярных метаболитов методом ОФ-УВЭЖХ-МС. Все инструменты, которые использовали для взвешивания замороженного материала, предварительно замораживали на сухом льду или в жидком азоте. Пробы хранили при -80оС.

Задача 2. Протеомное исследование образцов корней, обработанных Н2О2 (после выделения белка в БГУ): хромато-масс-спектрометрический анализ (nanoRP-HPLC-MS/MS), первичный процессинг данных, выявление паттернов дифференциальной экспрессии, связанных с действием Н2О2 на корни растений (Цветкова Е.В., Царев А.А., Горбач Д.П.).
Обработки корней растений в рамках данной задачи проводились в БГУ. При этом, использовалась техника замены среды (Рис. 4), детально описанная в отчете зарубежных партнеров - группы проф. В.В. Демидчика (БГУ). После окончания выращивания, растения собирались, мгновенно замораживались в жидком азоте и последовательно перемалывались в ступке и барабанно-шаровой мельнице. Из полученного замороженного материала корней экстрагировалась тотальная фракция белка (работы выполнялись в БГУ в соответствии с предоставленным нами протоколом). Согласно результатам определения белка с помощью коммерческого набора 2D-Quant (основанного на восстановлении ионов Cu(II) до Cu(I) в водном растворе), концентрации белка находились в диапазоне 1,35 – 4,76 мг/мл, а выход экстракции 0,58 – 2,27 мг/г сырого веса ткани. Точность определения белка была оценена в ходе кросс-валидационного эксперимента. Для этого, после рассчета концентраций белка по данным определения с помощью набора 2D-Quant, по 5 мкг белка наносилось на каждую дорожку полиакриламидного геля и проводилось электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях. Полученные электрофореграммы (в качестве примера см. Рис. 5А) регистрировались с помощью системы документации гелей и считывалась тотальная оптическая плотность дорожек. Полученное значение плотности 2,52E+04 ± 3,36E+03 АU и соответствующее значение относительного стандартного отклонения (relative standard deviation, RSD), равное 13,3%, позволяют оценить качество нормализации по весу белка как достаточное для относительного количественого анализа. Электрофоретический анализ триптических гидролизатов показал отсутствие непереваренного белка (Рис. 5Б). Таким образом, качество пробоподготовки можно было оценить как высокое.
Часть материала (тестовые образцы) были использованы для освоения методов выделения белка белорусской группой в БГУ, в то время как остальные образцы были отправлены в СПбГУ на сухом льду. По прибытии в Санкт-Петербург образцы были последовательно растворены в водных растворах 0.1% (v/v) муравьиной кислоты с уменьшающимся содержанием ацетонитрила (конечное содержание ацетонитрила 3%) и проанализированы с помощью нанопоточной хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения. Для обеспечения достаточной глубины анализа протеома было принято решение использовать гибридный масс-спектрометр, основанный на сочетании линейной электродинамической и электростатической (орбитальной) ионных ловушек, соединенный в режиме онлайн с нанопоточной обратнофазной высокоэффективной хроматографией через интерфейс, основанный на электрораспылении (nanoRP-HPLC-ESI-LIT-Orbitrap-MS).
Полученные первичные данные хромато-масс-спектрометрического анализа обрабатывались по схеме, представленной на Рис. 6, ранее разработанной в группе руководителя [4]. С помощью подхода количественного анализа без использования метки (label-free quantification) были выявлены паттерны дифференциальной экспрессии, которые были вовлечены в детальный биоинформатический анализ – аннотацию биологических функций и процессов, предсказание локализации, а также анализ белок-белковых взаимодействий.
Количественное сравнение паттернов экспрессии корней десятидневных растений арабидопсиса, в течение пяти дней выращиваемых на среде, содержащей 1 ммоль/л Н2О2 с таковыми корней контрольных растений (обработанных водой) выявило 44 белков статистически достоверно (р ≤ 0.05) увеличивших и 145 уменьшивших свое содержание, соответственно, в ответ на внесение 1 ммоль/л перекиси водорода в среду (из числа идентифицированных с помощью тандемной масс-спектрометрии, а также по соответствию индивидуальных значений времен удерживания и соотношения массы к заряду (m/z) образцам других экспериментальных групп, проанализированных одновременно с обсуждаемыми в данном разделе. Такой анализ для всего массива данных, включающего в общей сложности 30 образцов, был проведен с помощью программного обеспечения MaxQuant (Институт Биохимии им. Макса Планка, Германия) и позволил идентифицировать в общей сложности около 1500 белков.
Анализ главных компонент, выполненный для 189 дифференциально экспрессиро-ванных белков, показал четкое разделение двух групп уже по первой компоненте на графике счета (Рис. 7А). График нагрузок показал широкий спектр различий во вкладе индивидуальных белков в наблюдаемые различия, причем для всех белков, увеличивших свое содержание после обработки раствором пероксида водорода (правая часть графика нагрузок), этот вклад был высоким (Рис. 7Б). Анализ нагрузок, характеризующихся наиболее высоким вкладом (по 25 из положительной и отрицательной областей графика), показал характеристический спектр эффектов (Таб. 1). Так, среди белков, увеличивших уровень экспрессии в ответ на действие перекиси, доминировали белки редокс метаболизма и ответа на стресс, в том числе, аскорбат пероксидаза, перроксидазы 32 и 34, глутатион-S-трансфераза и метакаспаза-4. Также увеличивалась экспрессия белков, связанных с метаболизмом митохондрий, в частности – вовлеченных в образование железо-серных центров (тиосульфат сульфотрансфераза и NADH-дегидрогеназа белок AT5G37510) и других элементов цепи переноса электронов (цитохром С и комплекс I). Также, в ответ на действие перекиси водорода увеличивалось содержание ферментов, вовлеченных в метаболизм нуклеотидов (АДФ-синтаза, аденилосукцинатсинтаза, фактор АДФ рибозилирования А1В).
Среди белков, снизивших свое содержание под действием пероксида, доминировали белки синтеза (рибосомальные) и фолдинга белков – протеиндисульфидизомеразы, белок теплового шока 60 и α-субъединица коатомерного комплекса. Также наблюдалось подавление энергетического обмена, в первую очередь гликолиза и реакций, непосредственно связанных с ним. Так, наблюдалось снижение экспрессии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, енолазы и β1 субъединицы пирофосфат-фруктозо-6-фосфат 1-фосфотрансферазы. Необходимо также отметить подавление ростовых процессов, выражающиеся в снижении ферментов, вовлеченных в рост клеток растяжением – субъединицы β1 протонной АТФазы V-типа и α-L-арабинофуранозидазы 1 (Таб. 1).
Кластерный анализ (Рис. 7В) подтвердил наличие четких различий между контрольной и экспериментальной группами, которые образовывали два независимых кластера. Необходимо отметить меньшую гетерогенность экспериментальной группы по сравнению с контрольной, что указывает на консолидированную реакцию отдельных растений на обработку этой активной формой кислорода (АФК).
Функциональная аннотация дифференциально экспрессированных белков выявила белки белкового синтеза и редокс метаболизма как наиболее многочисленные группы полипептидов, увеличивавших свое содержание в ответ на обработку Н2О2 (Рис. 8), что согласовалось с данными анализа методом главных компонент.
Интересно отметить, что увеличение экспрессии практически всех белков, представленных функциональными группами (бинами) 8, 9, 11 и 21, согласно графику нагрузок (Рис. 7Б и Таб. 1) являлось фактором, вносящим наиболее существенный вклад в наблюдаемые различие между группами экспериментальных и контрольных растений. Это находится в соответствии с известной ролью цепи переноса митохондрий в генерации АФК и активации этих механизмов в ответ на действие перекисей. [8] Среди белков, снижавших свое содержание в экспериментальных условиях доминировала группа полипептидов, вовлеченных в белковый синтез – в общей сложности 43 белка, представляющие белки субъединиц рибосом (27), протеасомного комплекса деградации белков (6), тРНК-лигазы (4), ферменты, вовлеченные в фолдинг и/или пост-трансляционные модификации (3) и фактор инициации трансляции 3. Необходимо отметить, что согласно результатам анализа методом главных компонент, только несколько белков этой группы оказалиись существенными контрибьютерами наблюдаемых различий. Важным эффектом воздействия перекиси на растения было подавление экспрессии белков, вовлеченных в ответ на стресс – преимущественно шаперонов, а также протеаз, изомераз, вовлеченных в поддержание структуры белка. В соответствии со снижением экспрессии тРНК-лигаз, наблюдалось уменьшение содержание ферментогв синтеза аминокислот – в общей сложности 10 белков специфических путей и ферментов, сопрягающих центральный метаболизм с биосинтезом аминокислот (например, аспартат аминотрансфераза).
Предсказание клеточной локализации (Рис. 9) дифференциально экспрес-сированных белков выявило цитозоль, рибосомы, митохондрии, пластиды и ядро как основные внутриклеточные компартменты, чувствительные к обработке перекисью водорода.
Задача 3 Протеомное исследование образцов корней, обработанных смесями, генерирующими супероксид-радикалы (после выделения белка в БГУ): хромато-масс-спектрометрический анализ (nanoRP-HPLC-MS/MS), первичный процессинг данных, выявление паттернов дифференциальной экспрессии, связанных с действием супероксид- и гидроксид-радикалов на корни растений (Цветкова Е.В., Царев А.А., Горбач Д.П.).
Гидроксид-радикал представляет собой интереснейшую активную форму кислорода (АФК). Он активно образуется в реакции Фентона в присутствии ионов переходных металлов, находящихся в водных растворах в восстановленном состоянии (источником перекиси при этом служит реакция компропорционирования атмосферного кислорода и воды) [10]. Реакция Фентона, таким образом, затухает при достижении всеми ионами металлов в смеси высшей степени окисления. Внесение аскорбиновой кислоты в реакционную смесь позволяет поддерживать ионы переходных металлов в восстановленном состоянии, значительно усиливая генерацию гидроксил-радикала.
Известно, что АФК обладают двойственным физиологическим эффектом в растительных организмах. Так, с одной стороны, в малых концентрациях они являются сигнальными молекулами, с другой – высокие концентрации АФК сопровождают развитие окислительного стресса и являются фактором окислительного повреждения белков [11]. Поэтому, в рамках данного проекта мы рассмотрели эффекты двух концентраций ионов Сu(II) и аскорбиновой кислоты в составе нашей Фентон-подобной экспериментальной системы – 0,1 и 1,0 ммоль/л. Мы предположили, что смесь 0,1 ммоль/л ионов Сu(II) и 0,1 ммоль/л аскорбиновой кислоты будет являться относительно слабым источником гидроксил-радикалов, в то время как внесение смеси 1 ммоль/л ионов Сu(II) и 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты в ростовую среду однозначно вызовет окислительный стресс в растениях и значительную модификацию белков гидроксил- радикалами.
Количественное сравнение паттернов экспрессии корней десятидневных растений арабидопсиса, в течение пяти дней обработанных смесью 0,1 ммоль/л Сu(II) и 0,1 ммоль/л аскорбиновой кислоты с таковыми корней контрольных растений (обработанных водой) выявило 26 белков статистически достоверно (р ≤ 0.05) увеличивших и 251 уменьшивших свое содержание, соответственно, в ответ на внесение фентон-подобной гидроксил-продуцирующей системы в среду (из числа идентифицированных с помощью тандемной масс-спектрометрии, а также по соответствию индивидуальных значений времен удерживания и соотношения массы к заряду (m/z) образцам других экспериментальных групп, проанализированных одновременно с обсуждаемыми в данном разделе. Подобное сравнение для обработки смесью 1 ммоль/л Сu(II) и 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты выявило 35 и 242 белков увеличивших и уменьшивших свое содержание, соответственно.
Анализ главных компонент, выполненный для 333 дифференциально экспрессированных белков, показал частичное разделение групп по первой компоненте на графике счета (Рис. 10А). В то время, как между контрольными группами разделения не наблюдалось, группа растений, подвергнутых воздействию смеси 0,1 ммоль/л ионов Cu(II) и аскорбиновой кислоты была отделена от котрольной (хотя один из образцов характеризовался несколько отличным паттерном экспрессии). Из этих наблюдений можно сделать предварительный вывод о незначительном характере воздействия 0,1 ммоль/л аскорбиновой кислоты, которое не сопровождается значительным изменением профиля экспрессии белков корней.
Как и в случае обработки Н2О2, график нагрузок имел выраженно ассиметричный характер и характеризовался значительным вкладом всех белков, увеличивающих свое содержание в корнях в ответ на обработку АФК (Рис. 10Б, Таб. 2). Анализ 25 максимальных индивидуальных нагрузок, соответствующих этим белкам показал значительную роль белков центрального и энергетического метаболизма, а также полипептидов вовлеченных в ответ на действие стрессоров и участвующих в белковом метаболизме. Так, была увеличена экспрессия цитратсинтазы 4, GDSL эстеразы/липазы 22, а также центральных ферментов аминокислотного метаболизма – глутаматдегидрогеназы 2 и аминометилтрансферазы. Важную группу составляли также белки связанные с цепями переноса – цитохром b1-c комплекс, АТФ-синтаза, малатдегидрогеназа. Среди белков ответа на стресс, демонстрирующих увеличение экспрессии, необходимо упомянуть глутатион-S-трансферазу U13, пероксиредоксин 2В, аннексин 2, а также антигликирующий фермент с глиоксалазной активностью – белок DJ-1 гомолог A. Из шести участников белкового метаболизма, демонстрирующих увеличение относительного содержания в ответ на обработку фентон-подобной смесью, два белка (прохибитин 1 и шаперонин 10) являлись шаперонами, в то время как остальные были представлены структурными белками рибосом. Среди белков, снижающих свое содержание в экспериментальных условиях, необходимо отметить участников белкового метаболизма, преимущественно представленных белками рибосомальных субъединиц, и участников путей деградации белка (белок 1-А α-суъединицы протеосомы). Обращает также на себя внимание снижение экспрессии сукцинатдегидрогеназы, а также угнетение С1-метаболизма, выражающееся в снижении содержания метилентетрагидрофолат редуктазы 1 и саркозиноксидазы.
Важно отметить также, что три из четырех образцов корней, подвергнутых действию гидроксил-радикалов демонстрировало весьма схожие паттерны дифференциальной экспрессии (Рис. 10В), что указывает на возможный общий характер наблюдаемых метаболических и регуляторных ответов. Полученные данные находятся в соответствии с представлениями о том, что в малых концентрациях гидроксил- радикал может опосредовать регуляторные эффекты. В то же время, 0,1 ммоль/л аскорбиновая кислота, скорее всего этими эффектами не обладает (или эти эффекты не выявляются на уровне шотган эксперимента).
В отличие от обработки растений низкими концентрациями Cu(II) и аскорбиновой кислоты, в случае обработки 1 ммоль/л Cu(II) в сочетании с 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты, анализ главных компонент, выполненный для всей совокупности дифференциально экспрессиро-ванных белков, не выявил разделения групп по первой компоненте на графике счета при сравнении с двумя соответствующими контролями (вода и 1 ммоль/л раствор аскорбиновой кислоты, Рис. 11А). С другой стороны, группа контрольных растений, обработанных высокими концентрациями про-оксидантов четко отделялась от обеих обработок аскорбиновой кислотой, как в присутствии, так и в отсутствии ионов меди, уже в первой главной компоненте. Таким образом, про-оксидантный эффект 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты сопоставим с таковым фентон-подобной реакции, компоненты которой взяты в тех же количествах. Еще одним важным отличием внесения высоких концентраций реагентов Фентона в ростовую среду (по сравнению с эффектом внесения малых концентраций), является большая сбалансированность графика нагрузок (Рис. 11Б): белки, увеличивающие и уменьшающие свое относительное содержание в ответ на внесение экзогенных АФК в ростовую среду, вносят сопоставимый вклад в наблюдаемые различия между контролем 1 (обработка водой) и обоими аскорбат-содержащими растворами.
Анализ отдельных нагрузок, соответствующих индивидуальным белкам (По 25 для левой и правой частей графика, Таб. 3) показал развитие стрессового ответа в ответ на внесение 1 ммоль/л аскорбиновой кислоты (как в присутствии, так и в отсутствии ионов меди) в ростовую среду. Так, основная часть белков, увеличивающих свое относительное содержание, была представлена редокс молекулами (пероксидаза 22, пероксиредоксин-2С, USP17 и глутамат дегидрогеназа 2) и, даже в большей степени, характерными акторами ответа растений на стресс – кунитц ингибитор трипсина 5, потенциал-зависимый анионный канал 2, белок DJ-1 гомолог A, метакаспаза 4, оксалат-КоА-лигаза, поликетид циклаза, ацетил-КоА-оксидаза и гермин-подобный белок субсемейства Т (член семейства 2). Их активация в значительной степени объясняется усилением экспрессии белков, входящих в состав внутриклеточных АФК-продуцирующих систем – цепей переносов электронов (цитохром С1) и фотодыхания (NADH-убихинон-оксидоредуктаза), а так-же связанных с ними метаболических путей – циклов Кребса (цитрат синтаза) и Кальвина (фосфоенолпируват карбоксилаза 3).
С другой стороны, наблюдалось снижение экспрессии белков, которое проявлялось в виде характеристического паттерна, объяснимого в рамках понимания ответа растений на стресс. Так, во-первых наблюдалось снижение экспрессии протекторных шаперонов (в частности белки теплового шока 70, белки семейства TCP-1/cpn60, шапероны семейства htpG и дегидрины). Во вторых, наблюдалось подавление ряда гормональных ответов, выражающееся в снижении экспрессии ряда белков, таких как пателлины 2 и 3, а также арабиногалактановый белок 31. Также отмечалось подавление метаболизма аминокислот и молекулярной машины деградации белка. Важно отметить, что контрольные образцы (полученные из корней растений, обработанных водой) демонстрировали практически идентичные друг другу профили экспрессии, в то время как контроль 2 (1 ммоль/л аскорбиновой кислоты) и экспериментальная группа (1 ммоль/л аскорбиновой кислоты в присутствии 1 ммоль/л ионов меди) отличались высокой гетерогенностью и не выявляли группоспецифических особенностей в профилях экспрессии (Рис. 11В).
Функциональная аннотация белков, дифференциально экспрессированных в присутствии фентон-подобных систем выявила, на первый взгляд, схожие профили (Рис. 12). Однако более детальный анализ выявил ряд небольших качественных различий в паттернах дифференциальной экспрессии. Так, не смотря на схожее количество белков стрессового ответа, снижающих относительное содержание в ответ на обработку гидроксид радикал-генерирующими системами, при действии более высокой концентрации агентов дополнительно активируется экспрессионный регулятор РНК-связывающий белок В, содержащий RGG повторы. С другой стороны, высокие концентрации прооксидантов в меньшей степени супрессируют экспрессию шаперонов и транспортных белков, вовлеченных в ответ на стресс (родственный MD-2 липид-распознающий белок 3 и аквапорин TIP1-2). Надо отметить, что эти качественные различия менее заметны, нежели количественные. Так, снижение экспрессии белков стрессового ответа и белкового синтеза в присутствии более высоких концентраций прооксидантов было более значительным. С другой стороны, внесение в среду более высоких концентраций реагентов фентона приводило к более выраженной (до двухкратной) активации редокс белков, как по белковому составу, так и по величине изменений.
Данные предсказания внутриклеточной локализации дифференциально экспрессированных белков (Рис. 13) подтверждали наблюдения о качественном (но не количественном!) сходстве клеточных ответов на смесь АФК. Тем не менее, вышеупомянутые относительно небольшие различия в качественном составе белков заметны и в данном случае и выражаются в большем проценте цитоплазматических, ядерных и рибосомальных белков и в меньшем относительном количестве митохондриальных белков при обработке более высокими концентрациями прооксидантов.

Задача 4 Анализ термостабильных первичных метаболитов методом газовой хромато-масс-спектрометрии (GC-MS) в экстрактах корней A. thaliana, обработанных Н2О2 и смесями, генерирующими супероксид-радикалы. (Фролов А.А., Шумилина Ю.С.)
4.1 Описание паттерна термостабильных первичных метаболитов корней арабидопсиса и его качественные изменения в ответ на воздействие реагентами, генерирующими АФК
В целом, в экстрактах корней арабидопсиса всех экспериментальных групп анализируемых методом ГХ-МС выявлено 258 аналитов, из которых 141 было идентифицировано (Табл. 4). Поскольку некоторые соединения представлены несколькими изомерами или могут содержать разное количество дериватизированных групп, общее число идентифицированных метаболитов было 111. Эти метаболиты были представлены органическими кислотами (щавелевая, глицериновая, молочная, β-молочная, α-гидроксиглутаровая кислота и бензойная кислоты, участники цикла Кребса, альдоновые и уроновые кислоты и др.), жирными кислотами (С8:0 – С10:0, С12:0, С14:0, С16:0, С17:0, С18:0,1,2,3), аминокислотами (Гли, Ала, Вал, Иле, Лей, Про, Сер, Тре, Цис, Мет, Асп, Асн, Глу, Глн, Лиз, Арг, Трп, Тир), в том числе и непротеиногенными аминокислотами (β-аланин, орнитин, α- и γ-аминомасляные кислоты, α-аминоадипиновая кислота), полиаминами, моно-, ди- и трисахаридами, сахароспиртами, 2- и 3-фосфоглицеролами, миоинозитол фосфатом, лизолипидами, стеролами и др. Идентифицировать не удалось 51 аналит. Для других 63 аналитов, по наличию в спектрах характерных m/z значений, удалось установить их принадлежность к классам определенных химических веществ. Эти метаболиты были веществами, содержащими аминогруппы (m/z 174, 100); С5- и С6-моносахариды (m/z 103, 160, 217, 319), их производные спирты (m/z 319 и 204), в том числе стереоизомеры инозитола (m/z 318, 319), и кислоты (m/z 333 и 292, 319), ди- и олигосахариды (m/z 361, 437, 451), фосфат-содержащие вещества, имеющие характерные m/z 299, 315, 357 и 387, фенольные соединения (m/z 297, 338). Большинство этих веществ были обнаружены во всех 8 анализируемых вариантах корней. Единственным качественным изменением в паттерне термостабильных метаболитов было исчезновение вещества стерольной природы (Стерол (RI3839) в экстрактах корней растений обработанных Cu2+ в концентрации как 30 мкмоль/л, так и 100 мкмоль/л.
Таким образом, обработка аскорбатом, проявляющим антиокислительное действие, воздействие H2O2 и ионами меди Cu2+, которые способствуют генерации гидроксил-радикалов (ОН•) (реакция Фентона), а также воздействие смесью (H2O2, Cu2+, аскорбат), инициирующей развитие спонтанного циклического образования АФК таких, как ОН•, О2•- и Н2О2, известное как реакция Хабера-Вайса, в тестируемых концентрациях 30 и 100 мкмоль/л практически (за исключением исчезновения одного вещества стерольной природы в ответ на действие ионов меди) не изменяли качественный состав термостабильных метаболитов корней арабидопсиса.
4.2 Относительные количественные изменения в паттернах первичных термостабильных метаболитов корней арабидопсиса в ответ на воздействие реагентами, генерирующими АФК
4.2.1. Метаболитный ответ на воздействие смесью H2O2, Cu2+, аскорбата в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
Воздействие смесью, инициирующей развитие реакции Хабера-Вайса, приводило к значительным метаболитным сдвигам в тканях корней арабидопсиса. Анализ методом главных компонент (МГК) и кластерный анализ с построением тепловых карт уровней содержания первичных термостабильных метаболитов показали присутствие, наряду с высокой внутригрупповой биологической вариабельностью контрольного варианта, значительную межгрупповую вариабельность метаболомов корней, связанную с воздействием двух концентраций АФК-генерирующей смеси (Рис. 14,А). Характер расположения групп метаболомов в плоскости 1 и 2 главных компонент свидетельствует о значительных количественных различиях метаболомов контрольных и обработанных смесью корней, тогда как метаболитная реакция обработанных корней на различие в применяемых концентрациях смеси была выражена слабее.
Дисперсионный анализ паттерна термостабильных метаболитов выявил 186 веществ, уровни содержания которых изменялись на воздействие смеси, генерирующей АФК (Рис 14,Г). Основным ответом на генерацию АФК было резкое падение содержания метаболитов. Так, уровни 57 метаболитов значительно снижались (кратные изменения по сравнению с контрольным вариантом ≥1.5 при р-значении (Т-тест с FDR-поправкой) ≤0.05) на применение концентраций смеси 30 и 100 мкмоль/л. Среди этих веществ преобладали аминокислоты и сахара. Уровень многих аминокислот снижался в более, чем 20 раз. Наибольшее снижение содержания среди аминокислот отмечалось у аспарагина и аргинина (в 79 и 54 раза, соответственно), среди органических кислот у глюконовой кислот и 2-оксогулоновой (в 80 и 50 раз, соответственно) под действием концентрации смеси 100 мкмоль/л по сравнению с контролем. Содержание других 15 метаболитов, среди которых доминировали органические кислоты, снижалось только в ответ на 100 мкмоль/л. Содержание только одного метаболита - β-гидроксимасляной кислоты – снижалось в ответ на концентрацию смеси 30 мкмоль/л, а на воздействие более высокой концентрацией смеси уровень этого метаболита не отличался от контрольного. Значительно меньшее количество метаболитов возрастало в содержании в ответ на генерацию АФК (Таб. 5). Так, в ответ на концентрацию смеси 30 мкмоль/л возрастало содержание L-треоновой кислоты, мио-инозитол фосфата, инозитола, мальтозы, маннитола. Обе концентрации смеси вызывали значительное увеличение уровней лактата и лизолипида 1-стеарат глицерина. Концентрация 100 мкмоль/л приводила к накоплению пальмитиновой кислоты и глицерина. Накопление перечисленных веществ в условиях генерации АФК, по-видимому, отображают процессы АФК-зависимого распада аскорбиновой кислоты, фосфолипидов, крахмала, а также процессы переключения энергетического метаболизма клеток с окислительного фосфорилирования на брожение из-за падения уровней основных органических кислот - участников цикла Кребса. Анализ изменений метаболических путей выявил, по крайней мере, три основных события, происходящих в ответ на запуск генерации АФК смесями в концентрации как 30, так и 100 мкмоль/л: перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, снижение метаболизма глутатиона и резкое снижение многих аминокислот.
Таким образом, система (H2O2, Cu2+, аскорбат) запуска генерации АФК (в основном гидроксил- и супероксид анион радикалов) вызывает серьезные нарушения в метаболизме первичных веществ, что проявляется в падении уровней ключевых аминокислот, органических кислот и сахаров, а также в накоплении веществ, которые могут быть продуктами АФК-зависимого распада липидов, полиуглеводов и др. полимеров. Более того, из-за падения уровня аминокислот нарушается работа аскорбат-глутатионного цикла, важнейшего элемента антиокислительной защиты клеток.
Поскольку каждый из компонентов системы запуска АФК (Cu2+, H2O2 и аскорбат) при применении в отдельности потенциально способен влиять на редокс-статус клеток, на следующем этапе был изучен метаболитный ответ тканей корней на обработку растений каждым из этих реагентов.

4.2.2. Изменение уровней относительного содержания термостабильных полярных метаболитов на воздействие ионами меди Cu2+ в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
Из всех анализируемых компонентов системы запуска АФК, тестируемых по отдельности, обработка корней ионами меди вызывала наиболее схожий с действием АФК-генерирующей смеси метаболомный ответ (рис. 15). Было обнаружено 180 сигналов термостабильных полярных метаболитов, интенсивность сигналов которых значительно изменилась в пробах корней обработанных ионами меди. Преобладающей реакцией было уменьшение содержания этих соединений (Рис. 15, Таб. 6). Однако, в отличие от действия смеси, кратность выявленных изменений для многих соединений была ниже, также регистрировалось более четкое различие в метаболомных ответах корней на применяемые концентрации ионов меди - 30 мкмоль/л и 100 мкмоль/л (рис 15, А-Г). Так, были выявлены 9 метаболитов (сахароза, фруктоза, мио-инозитол и др.), уровень содержания которых падал в ответ на действие 30, но не 100 мкмоль/л Cu2+ (Таб. 6), и 20 метаболитов (Цис, Тир, урацил, аденин и др.), снижение содержания (от 2 до 10 раз) которых наблюдалось только в ответ на 100 мкмоль/л Cu2+.
Общим ответом на действие обеих концентраций было снижение содержания 42 метаболитов (Таб. 6). Интересно, этот паттерн изменения содержания метаболитов практически не отличался (за исключением глюкаровой кислоты и инозитола) от набора веществ, уровень которых падал в ответ на обработку смесью прооксидантов (Таб. 5 и 6). Как и в случае обработки смесью, в ответ на действие 100 мкмоль/л Сu2+ среди аминокислот наиболее сильно под по сравнению с контролем снижались уровни содержания аргинина и аспарагина (в 35 и 33 раза, соответственно), а в ряду органических кислот помимо глюконовой и 2-оксогулоновой кислот (в 17 и 14 раз соответственно), сильное снижение в 14 раз также отмечалось в содержании γ-аминомасляной кислоты.
Концентрации ионов меди Cu2+ 30 и 100 мкмоль/л вызывали накопление разных веществ. В первом случае возрастало содержание 5 метаболитов (мио-инозитол фосфата, мальтозы, α-гидроксиглутаровая кислота, β-молочная кислота и галактаровой кислоты. Во втором случае отмечалось возрастание уровня молочной кислоты, глицерина и пентадекановой кислоты, следует обратить внимание, что эти вещества также накапливались при действии системы запуска АФК.
Анализ метаболических путей выявил, что ионы меди в концентрации 30 и 100 мкмоль/л оказывают сходное действие с влиянием системы запуска АФК и вызывают перекисное окисление ненасыщенных жирных кислот, падение уровня аминокислот и снижение метаболизма глутатиона (рис. 15,Д,Е).
Таким образом, обе концентрации ионов меди вызывали метаболический ответ сходный с действием системы запуска АФК. Этот эффект можно объяснить тем, что ионы меди способны инициировать реакцию Фентона, и следовательно образование гидроксил-радикалов. По-видимому, описанная выше метаболическая реакция корней связана с процессом генерации гидроксил-радикалов, и отображает их повреждающие действием на метаболизм растительных клеток.

4.3.3. Изменение уровней относительного содержания термостабильных полярных метаболитов на воздействие H2O2 в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
В метаболический ответ, вызванный воздействием пероксидом водорода в концентрации 30 мкмоль/л, было вовлечено значительно большее число метаболитов, чем на воздействие H2O2 (100 мкмоль/л) (Рис. 16). Это доказывает рассчитанная методом МГК модель дальнего расположения в плоскости первой и второй главных компонент метаболомов групп контроля и H2O2 (30 мкмоль/л) и близкого расположения к контролю метаболомов группы H2O2 (100 мкмоль/л) (Рис.16,А). На тепловой карте также видно, что в ответ на более низкую концентрацию Н2О2 уровень многих веществ снижается и выравнивается с контрольным на воздействие H2O2 (100 мкмоль/л) (Рис. 16,Б,В). В целом, применение Н2О2 вызывало значительное (р ≤ 0.05) изменение интенсивности сигналов 143 из 258 обнаруженных пиков метаболитов. Среди этих метаболитов было 49 идентифицированных веществ, только 8 (линоленовая, линолевая, гулоновая глюконовая, бензойная кислоты, Фен, Асп, путресцин) из них снижали (от 1,5 до 3 раз по сравнению с контролем) уровни содержания в ответ на обе концентрации Н2О2 (Таб. 7). Было выявлено 35 метаболитов, содержание которых уменьшалось в ответ на внесение H2O2 в среду (30 мкмоль/л), среди них наибольший уровень снижения был зарегистрирован у аспарагина и сахарозы, в 7 и 6 раз, соответственно, при сравнении с контролем.
Высокая концентрация пероксида водорода (100 мкмоль/л) вызывала накопление молочной кислоты, глюкозы, глюкаровой кислоты и арабинозы, тогда как его низкая концентрация увеличивала уровень мио-инозитола.
Анализ метаболических путей показал, что воздействие пероксидом водорода в концентрации 30 мкмоль/л вызывало наиболее достоверные и существенные изменения в метаболизме глутатиона, метаболизме дикарбоновых кислот и аминокислот, таких как Фен, Асп, Асн, Глу, Глн и Ала. В свою очередь применение Н2О2 (100 мкмоль/л) способствовало перекисному окислению ненасыщенных кислот, изменению метаболизма ароматических аминокислот, таких как Трп и Фен, и метаболизма углеводов.
Таким образом, данные результаты указывают на то, что ткани корней отвечали на внесение Н2О2 в концентрации 30 и 100 мкмолей/л разными количествеными паттернами изменения содержания метаболитов. Это может означать, что вещества, изменяющие уровень содержания в ответ на низкую концентрацию Н2О2, могут быть вовлечены в Н2О2-опосредованный сигналинг. В свою очередь, изменение набора аналитов, изменяющих уровень содержания при действии высокой концентрацией Н2О2, может указывать о преобладании повреждающего действия Н2О2.

4.2.3. Изменение уровней относительного содержания термостабильных полярных метаболитов на воздействие аскорбата в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л

Воздействие аскорбиновой кислотой, из всех тестируемых реагентов системы запуска АФК, оказывало наименьшее эффект на метаболизм тканей корней. Анализ методом главных компонент создал модель, в которой в плоскости первой и второй главных компонент метаболомы разных экспериментальных групп корней не образуют соответствующих группам отдельно расположенных скоплений (Рис. 17,А). Такая МГК модель свидетельствует о том, что воздействие аскорбатом сильно не изменяет вариабельность сравниваемых метаболомов. Этот результат также подтверждает визуализация уровней метаболитов на тепловой карте (Рис 17,Б), которая в основном отображает биологическую внутригрупповую вариабельность уровней метаболитов. Тем не менее, с использованием методов дисперсионного анализа и попарного сравнения с использованием t-критерия было выявлено около 70 пиков метаболитов с достоверными (p ≤ 0.05) изменениями уровней содержания в ответ на внесение аскорбиновой кислоты в среду (Рис. 17,В,Г, Таб. 8). Паттерны этих метаболитов значительно различались в ответ на воздействие 30 и 100 мкмоль/л аскорбата. Так, только четыре метаболита изменяли свое содержание в ответ на обе тестируемые концентрации аскорбата: уровни глюкозы, арабинозы и инозитола возрастали, а содержание аспартата снижалось в 2 и 2,5-3 раза в ответ на обработку низкой (30 мкмоль/л) и более высокой (100 мкмоль/л), соответственно, концентрациями аскорбата. Специфичными метаболитными реакциями корней арабидопсиса на аскорбата 30 мкмоль/л являлось двукратное возрастание уровня мио-инозитол фосфата и падение в 2-4 раза уровней органических кислот. Применение высокой концентрации аскорбата вызывало возрастание молочной кислоты (до 7 раз), глицерола, мальтозы и других 4 метаболитов (до 2-3 раз) и 2-4 кратное снижение линолевой и линоленовой кислот, четырех аминокислот и др. веществ. Наиболее значительное падение уровней (6-8 раз) наблюдалось у трех метаболитов: 2-оксогулоновой и глюконовой кислот.
Анализ метаболических путей выявил, что воздействие аскорбатом в концентрации 30 мкмоль/л влияет на метаболизм глутатиона, глиоксалата и дикарбоновых кислот и аминокислот, таких как Арг, Асп, Ала, Глу. Более высокая концентрация аскорбата изменяла метаболиз линоленовой кислоты, пирувата, и также влияла на метаболизм аминокислот, в том числе серусодержащих.
Таким образом, полученные результаты указывают, что по-видимому, основными мишенями воздействия системы запуска АФК и ее отдельных компонентов являются аскорбат-глутатионовая антиоксидантная защита, метаболизм дикарбоновых кислот и связанных с ними через реакции трансаминирования аминокислот, реакции перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот, метаболизм ароматических и сера-содержащих аминокислот. Также следует отметить 2-3 кратное возрастание мио-инозитол фосфата, которое наблюдается при воздействиях практически всех тестируемых реагентов и их смеси в низкой концентрации и, может указывать на участие фосфатидилинозитол-зависимого сигналинга в ответе клеток на генерацию АФК.

Задача 5 Анализ семи-полярных вторичных и карбонильных метаболитов методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS) в экстрактах корней A. thaliana, обработанных Н2О2 и смесями, генерирующими супероксид-радикалы. (Фролов А.А., Соболева А.В.)

5.1 Анализ карбонильного метаболома
На данный момент была выполнена серия предварительных экспериментов по оценке загрузки аналитической колонки экстрактом тестовых проб корней A. thaliana, содержащим дериватизированные карбонилы, в целях оптимизации объема экстракта для УВЭЖХ-МС/МС анализа, и выполнен анализ всей последовательности проб экспериментальных групп корней арабидопсиса. Полученная хромато-масс-спектрометрическая информации будет обработана в ходе следующего этапа (2022 г) выполнения проекта. На рис. 18 представлены типичные хроматограммы экстрактов растений A. thaliana контрольных и обработанных Н2О2 (30 мкмоль/л).
5.2 Относительные количественные изменения в паттернах вторичных метаболитов семи-полярных экстрактов корней арабидопсиса в ответ на воздействие реагентами, генерирующими АФК
5.2.1. Изменение уровней относительного содержания вторичных метаболитов на воздействие системы запуска АФК в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
Воздействие смесью (Н2О2, Сu2+, аскорбат), инициирующей генерацию АФК в реакции Хабера-Вайса, приводило к значительным сдвигам в содержании большого числа вторичных метаболитов в тканях корней арабидопсиса (Рис. 19). Анализ МГК и тепловые карты уровней содержания вторичных семи-полярных метаболитов, детектированных в режиме регистрации отрицательных и положительных квази-молекулярных ионов, выявили высокую внутригрупповую биологическую вариабельность контрольного варианта, а также межгрупповую вариабельность метаболомов корней, связанную с воздействием двух концентраций АФК-генерирующей смеси (Рис. 19,А-Г). Наибольший вклад в вариабельность метаболомов корней растений арабидопсиса, вызванную воздействием смеси, генерирующей АФК, вносили уровни содержания положительных квази-молекулярных ионов семи-полярных метаболитов (Рис. 19Б, Г). Наиболее значительные количественные изменения в составе вторичных веществ наблюдались между метаболомами контрольных и обработанных смесью корней. Различие между метаболомами корней обработанных разными концентрациями смеси было выражено слабее.
Концентрация 30 мкмоль/л системы запуска генерации АФК вызывала накопление 25 и 36 метаболитов, детектируемых в форме квази-молекулярных отрицательных и положительных ионов, соответственно (Рис. 19Д,Е). Значительно большее число метаболитов (95 отрицательных и 233 положительных ионов) снижало содержание в ответ на это воздействие. Увеличение концентрации реагентов смеси до 100 мкмоль/л не расширяло ряд накапливаемых веществ, но многократно увеличивало количество метаболитов (816 отрицательных и 1210 положительных ионов), содержание которых падало по сравнению с контролем. Такое массовое падение уровней вторичных метаболитов может быть следствием нарушений в обмене веществ первичных метаболитов, служащих предшественниками для вторичного биосинтеза.
5.2.2. Изменение уровней относительного содержания вторичных метаболитов на воздействие ионов меди Cu2+ в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
С помощью метода главных компонент на фоне высокой биологической вариабельности метаболомов контрольной группы корней и метаболомов корней, обработанных низкой концентрацией (30 мкмоль/л) Cu2+ (распределение метаболомов вдоль главной компоненты 1, охватывающей 64% объясненной информации), удалось выявить вариабельность метаболомов, связанную с действием ионов меди (распределение метаболомов вдоль второй главной компоненты, охватывающей 14% объясненной информации) (Рис. 20,А, Б). Несмотря на высокую биологическую вариабельность групп контроля и Cu2+ (30 мкмоль/л), которая также отображена на тепловых картах (Рис 20,В, Г), удалось обнаружить 50 отрицательных и 86 положительных квази-молекулярных ионов вторичных метаболитов, отвечающих значительным изменением содержания на применение Cu2+ (30 мкмоль/л). Уровни большей части этих метаболитов (70%) возрастали по сравнению с контролем (Рис. 20Д, Е). Увеличение концентрации Сu2+ до 100 мкмоль/л многократно увеличивало паттерн веществ (138 отрицательных и 660 положительных ионов метаболитов), уровни содержания которых снижались, при этом регистрировались только единичные вещества, которые накапливались в тканях в этих условиях.

5.2.3. Изменение уровней относительного содержания вторичных метаболитов на воздействие пероксида водорода в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
МГК и тепловые карты четко демонстрируют, что воздействие пероксидом водорода в концентрации как 30, так и 100 мкмоль/л не приводило к существенным изменениям количественного состава вторичных метаболитов (Рис. 21,А-Г). Парные сравнения, выполненные для метаболомов групп корней, подвергнутых воздействию каждой из тестируемых концентраций, против контроля, показало, что Н2О2 (30 мкмоль/л) вызывал возрастание уровней четырех метаболитов (2 отрицательных и 2 положительных ионов) и снижение уровней 12 положительно-заряженных ионов метаболитов. Тогда как более высокая концентрация Н2О2 изменяла эти паттерны вторичных веществ следующим образом: снижались уровни содержания 9 отрицательных и 7 положительных ионов, а уровни 18 отрицательных и 11 положительных ионов возрастали по сравнению с контролем (Рис. 21,Д, Е).

5.2.4. Изменение уровней относительного содержания вторичных метаболитов в ответ на воздействие аскорбатом в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
МГК указывает на появление существенных различий в количественных паттернах вторичных соединений корней арабидопсиса в ответ на воздействие аскорбатом, примененным в концентрации 100 мкмоль/л (Рис 22,А, Б). Более низкая концентрация аскорбата (30 мкмоль/л) не вызывала подобных изменений. На теплокартах уровней метаболитов (как положительных, так и отрицательных квази-молекулярных ионов) заметны кластеры веществ, уровни которых возрастают в ответ на обработку аскорбатом (100 мкмоль/л) по сравнению с контролем (Рис 22,В, Г). Парные сравнения метаболитных ответов на каждую из двух тестируемых концентраций аскорбата против контроля выявили: (1) 4 метаболита (зарегистрированных в форме отрицательных ионов), содержание которых возрастало на применение аскорбата (30 мкмоль/л), (2) более сотни отрицательных и положительных ионов с повышенными уровнями и около 10 отрицательных и положительных ионов вторичных метаболитов с пониженными уровнями содержания на применение аскорбата (100 мкмоль/л) (Рис 22,Д, Е).

Таким образом, воздействие системы генерации АФК и воздействие ионами меди вызывали значительные перестройки в количественном паттерне вторичных метаболитов. В отличие от воздействия смеси, отдельное применение ионов меди в концентрации 30 мкмоль/л вызывало накопление значительного числа метаболитов. Повышение концентрации АФК-генерирующей смеси и ионов меди до 100 мкмоль/л вызывало рост числа метаболитов, уровень содержания которых снижался. Пероксид водорода и аскорбат, примененные в концентрациях 100 мкмоль/л, также вызывали изменения в количественном паттерне вторичных метаболитов. В отличие от всех компонентов АФК-генерирующей смеси, отдельное применение аскорбата (100 мкмоль/л) вызывало рост числа метаболитов, уровень содержания которых возрастал в тканях корней.

Задача 6. Анализ термолабильных полярных метаболитов методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии (LC-MS) в экстрактах корней A. thaliana, обработанных Н2О2 и смесями, генерирующими супероксид-радикалы.
6.1 Качественные изменения паттерна анализируемых термолабильных метаболитов корней арабидопсиса в ответ на воздействие реагентами, генерирующими АФК
В отличие от термостабильных первичных метаболитов, качественный состав которых оставался стабильным при действии реагентов системы генерации АФК (см пункт 4.1.), паттерн анализируемых полярных термолабильных метаболитов существенно изменялся в ответ на действие, как полной АФК-генерирующей смеси, так и некоторых ее компонентов (Таб. 9). Так, в результате совместного воздействия Сu2+, Н2О2, аскорбата на растения арабидопсиса в экстрактах корней не обнаруживались такие вещества, как Коэнзим А, β-гидрокси-β-метилглутарил-КoA, Малонил-КоА, янтарная кислота. Коэнзим А также не обнаруживался в экстрактах корней в ответ на воздействие всех тестируемых реагентов за исключением обработки аскорбатом, примененным в концентрации 30 мкмоль/л.

6.2 Относительные количественные изменения в паттернах термолабильных метаболитов полярных экстрактов корней арабидопсиса в ответ на воздействие реагентами, генерирующими АФК
6.2.1. Изменение уровней относительного содержания термостабильных первичных метаболитов на воздействие системы запуска АФК в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
Воздействие системой запуска образования АФК (Сu2+, Н2О2, аскорбат) вызывало снижение уровней содержание многих метаболитов (Рис. 23). Наиболее сильный метаболический ответ, выраженный статистически достоверным (р≤0.05, рассчитанное с FDR-поправкой) снижением содержания 11 из 30 анализируемых метаболитов, наблюдался в ответ на внесение в ростовую среду смеси Сu2+, Н2О2 и аскорбата в концентрации 100 мкмоль/л. Этими веществами были аспарагин, лимонная кислота, АТФ, 5-фосфомевалоновая кислота (снижение содержания в 144, 45, 33 и 19 раз, соответственно, по сравнению с контролем), АДФ и аскорбат (14 раз), НАДФ+, шикимовая кислота, и НАД+ (10, 8 и 5 раз), АМФ и аденилосукцинат (4 и 3 раза). Концентрация 30 мкмоль/л вызывала 7-кратное снижение уровня АДФ.
6.2.2. Изменение уровней относительного содержания термостабильных первичных метаболитов на воздействие ионов меди Cu2+ в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л

Воздействие ионов меди вызывало сходный по направлению изменений, но менее выраженный по интенсивности изменений с АФК-генерирующей системой метаболический ответ корней (Рис.24). Было выявлено 11 метаболитов, снижающих свое содержание в ответ на внесение в ростовую среду ионов меди в концентрации 100 мкмоль/л. Из числа этих метаболитов наиболее сильное падение уровней отмечалось у АДФ и НАДФ+ (в 10 и 7.6 раз, соответственно, по сравнению с контролем).


6.2.3. Изменение уровней относительного содержания термостабильных первичных метаболитов в ответ на воздействие пероксида водорода в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л на корни растений Арабидопсиса

Внесение в ростовую среду пероксида водорода в концентрации 30 и 100 мкмоль/л не вызывало статистически значимых изменений (p-значение (скорректированное FDR поправкой) ≤0.05) в уровнях содержания 30 анализируемых термолабильных полярных метаболитов (Рис. 25).

6.2.4. Изменение уровней относительного содержания термостабильных первичных метаболитов на воздействие аскорбата в концентрациях 30 и 100 мкмоль/л
Тестируемые концентрации аскорбата (30 и 100 мкмоль/л) в основном не вызывали изменений в содержании анализируемых первичных термолабильных метаболитов. Было выявлено только 1.5-2-кратное возрастание уровней аденилосукцината и сукцинил-КоА в ответ на воздействие аскорбатом 30 мкмоль/л (рис. 26). Тогда как повышение концентрации аскорбата до 100 мкмоль/л не вызывало статистически достоверных изменений уровней анализируемых полярных метаболитов.

Заключение

Таким образом, обобщая полученные результаты можно заключить, что воздействие системой генерации АФК (Н2О2, Cu2+, аскорбат) и отдельное воздействие ионами меди вызывали сходные и значительные перестройки в профилях всех анализируемых метаболитов (термостабильных и термолабильных полярных веществ и вторичных семи-полярных соединений) корней арабидопсиса. Этот эффект усиливался с увеличением концентрации реагентов АФК-генерирующей смеси или отдельно применяемых ионов меди Cu2+ и выражался в многократном увеличении числа метаболитов, уровни содержания которых резко снижались в ответ на воздействие. Амплитуда этого эффекта была ниже в ответ на отдельное применение ионов меди по сравнению с действием полного состава системы генерации АФК. Метаболитный ответ корней арабидопсиса на отдельное применение пероксида водорода зависел от концентрации Н2О2. Его высокая (100 мкмоль/л) и низкая (30 мкмоль/л) концентрации вызывали количественные изменения разных паттернов веществ. Метаболический ответ на внесение в ростовую среду высокой концентрации Н2О2 (100 мкмоль/л) был сходный, но менее выраженный по амплитуде изменений, с действием ионов меди. Основными мишенями воздействия системы запуска АФК и ее компонентов являются аскорбат-глутатионовая антиоксидантная защита, компоненты центрального энергетического метаболизма, метаболизм дикарбоновых кислот и связанных с ними через реакции трансаминирования аминокислот, реакции перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот, метаболизм ароматических и сера-содержащих аминокислот, системы биосинтеза вторичных соединений. Поскольку система генерации АФК и ее отдельные компоненты, такие как ионы меди и Н2О2 запускают реакцию генерации гидроксил-радикалов, можно полагать, что описанный негативный эффект этих воздействий отражает картину ОН•-инициируемых повреждений метаболизма.
Метаболический ответ корней на отдельное применение Н2О2 (30 мкмоль/л) и аскорбата (30 и 100 мкмоль/л) отличался от действия системы запуска АФК в том, что выражался в увеличении числа веществ, как полярных первичных, так и семи-полярных вторичных метаболитов, с повышенным уровнем содержания. Этот эффект характерный для низкой концентрации пероксида водорода можно объяснить по-видимому реализацией его сигнальной функцией. Обработка растений аскорбатом при условии отсутствия остальных компонентов запуска АФК, по-видимому, способствует реализации мощного антиокислительного потенциала этого реагента, которое будет поддерживать редокс-статус клеток, и, как следствие, вызывать активацию синтеза многих веществ первичного и вторичного метаболизма.

Используемая литература
1. Wiśniewski, J.R., et al., Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods, 2009. 6(5): p. 359-362.
2. Mamontova, T., et al., Profiling of Seed Proteome in Pea (Pisum sativum L.) Lines Characterized with High and Low Responsivity to Combined Inoculation with Nodule Bacteria and Arbuscular Mycorrhizal Fungi. Molecules, 2019. 24(8): p. 1603.
3. Bassal, M., et al., Reshaping of the Arabidopsis thaliana Proteome Landscape and Co-regulation of Proteins in Development and Immunity. Molecular Plant, 2020. 13(12): p. 1709-1732.
4. Mamontova, T., et al., Proteome Map of Pea (Pisum sativum L.) Embryos Containing Different Amounts of Residual Chlorophylls. Int J Mol Sci, 2018. 19(12).
5. Coleto, I., et al., New Insights on Arabidopsis thaliana Root Adaption to Ammonium Nutrition by the Use of a Quantitative Proteomic Approach. International Journal of Molecular Sciences, 2019. 20(4): p. 814.
6. Slade, W.O., et al., Exogenous Auxin Elicits Changes in the Arabidopsis thaliana Root Proteome in a Time-Dependent Manner. Proteomes, 2017. 5(3): p. 16.
7. Leonova, T., et al., Does Protein Glycation Impact on the Drought-Related Changes in Metabolism and Nutritional Properties of Mature Pea (Pisum sativum L.) Seeds? International Journal of Molecular Sciences, 2020. 21: p. 567.
8. Osmolovskaya, N., et al., Methodology of Drought Stress Research: Experimental Setup and Physiological Characterization. Int J Mol Sci, 2018. 19(12).
9. Savojardo, C., et al., BUSCA: an integrative web server to predict subcellular localization of proteins. Nucleic Acids Research, 2018. 46(W1): p. W459-W466.
10. Greifenhagen, U., A. Frolov, and R. Hoffmann, Oxidative degradation of N(ε)-fructosylamine-substituted peptides in heated aqueous systems. Amino Acids, 2015. 47(5): p. 1065-76.
11. Shumilina, J., et al., Glycation of Plant Proteins: Regulatory Roles and Interplay with Sugar Signalling? Int J Mol Sci, 2019. 20(9).