Научная проблема, на решение которой направлен проект
Неоптимальный флуоресцентный сигнал и спектр поглощения ограничивает применение потенциал-зависимых флуоресцентных генетически-кодируемых белковых сенсоров на основе фоточувствительных белков, родопсинов, в оптогенетических исследованиях.
Научная значимость и актуальность решения обозначенной проблемы
Оптогенетика – использование светочувствительных белков для возбуждения/ингибирования или визуализации активности клетки, в первую очередь, нейронов и кардиомиоцитов. На сегодняшний день оптогенетика интенсивно развивается и применяется для решения широкого круга проблем в биологии и медицине. Дальнейшее развитие этой области требует создания новых инструментов с заданными характеристиками. Данное исследование направлено на создание новых инструментов для визуализации электрической активности клетки на основе фоточувствительных белков из семейства родопсинов.
Наиболее развитая и часто используемая на данный момент технология для визуализации активности нейронов основана на генетически-кодируемых кальциевых индикаторах (Zarowny et al., 2020; Shemetov et al., 2021). Однако детектирование изменения концентрации кальция является опосредованным способом изучения активности нейронов и прямое измерение мембранного потенциала позволяет увеличить временное разрешение и точность измерения сигнала. Прямое измерение сигнала можно достигнуть двумя способами – с использованием органических потенциал-зависимых красителей или при помощи генетически-кодируемых потенциал-зависимых флуоресцентных белков (GEVI). Оба подхода на данный момент имеют недостатки. Органические красители обладают высокой фототоксичностью, низкой таргетностью доставки и низкой фотостабильностью (Fiala et al., 2020; Kuhn et al., 2021). Подобные недостатки отсутствуют у генетически-кодируемых потенциал-зависимых сенсоров, наиболее распространенными из которых являются сенсоры на основе фоточувствительных белков, родопсинов. Однако, основным недостатком существующих на данный момент генетически-кодируемых потенциал-зависимых сенсоров является низкая интенсивность флуоресцентного сигнала (Bando, Y et al., 2019; Zhang XM et al., 2021). Улучшение этой характеристики позволило бы сделать данный вид сенсоров наиболее конкурентоспособным среди других классов. Также общей проблемой, ограничивающих применение всех классов флуоресцентных сенсоров in vivo является необходимость сдвига максимума полосы спектра поглощения в красную или ИК область спектра (Shcherbakova DM, 2021; Mollinedo-Gajate I et al, 2021).
Конкретная задача (задачи) в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб и комплексность
Объектом исследования в данном проекте являются потенциал-зависимые флуоресцентные белки на основе родопсинов. Основной задачей является получение белков с увеличенной интенсивностью флуоресцентного сигнала и сдвигом максимума полосы спектра поглощения в красную область. Получение данных белков позволит расширить возможности исследований широкого круга задач нейрологии, кардиологии и других областей, использующих методы оптогенетики.
При решении основной задачи будет решен ряд подзадач.
Так как основой предлагаемого подхода к решению задачи является одновременное использование нескольких подходов к молекулярному дизайну, а именно методов направленной эволюции и метода рационального дизайна, то необходимо разработать протоколы для их совместного применения. Подобные протоколы на данный момент широко не применяются. По этой причине их применение для дизайна флуорецентных родопсинов в рамках данной работы даст новую информацию, которую можно будет использовать для дизайна других белков и свойств.
В ходе реализации проекта, наряду с информацией, полученной при экспериментальной реализации метода направленной эволюции, который на данный момент очень широко используется, будет проведен дизайн методом направленной эволюции in silico. Данный подход является относительно новым и полученная информация будет важна для развития методов дизайна в целом.
В ходе реализации проекта будут созданы программы, которые будут представлены в открытом доступе и могут быть использованы в дальнейшем для вычислительного молекулярного дизайна.
Научная новизна исследований, обоснование достижимости решения поставленной задачи (задач) и возможности получения предполагаемых результатов
Планируемые результаты, которые являются главной целью проекта, будут получены впервые. Для достижения цели будут применяться как широко используемые методы и подходы, так и предложенные в рамках данного проекта.
Приведенные в разделах “Современное состояние исследований по данной проблеме” и “Имеющийся у научного коллектива научный задел по проекту” уже полученные нами результаты, а именно, проведенный нами дизайн и синтез новых сенсоров на основе археородопсина-3, а также наработанные в нашей группе компьютерные модели родопсинов, показывают, что запланированные результаты могут быть получены в рамках данного проекта.
Современное состояние исследований по данной проблеме, основные направления исследований в мировой науке и научные конкуренты
На сегодняшний день все используемые родопсиновые потенциал-зависимые флуоресцентные сенсоры были получены экспериментально методом направленной эволюции на основе археородопсина-3 путем экспериментального перебора большого количества вариантов. Исследования были направлены как на увеличение интенсивности флуоресценции (квантовый выход археородопсина-3 составляет всего 0.01%), так и сдвиг спектра поглощения в длинноволновую область (максимум поглощения археородопсина-3 556 нм). Наиболее широко применяемые варианты – QuasAr1, QuasAr2 (Hochbaum DR et al., Nat. Met., 2014; Chien MP et al., Sci. Adv., 2021), Archon1 (Piatkevich KM et al., Nat. Chem. Biol., 2018; Armbruster M et al., Nat. Neurosci., 2021), полученные A. Cohen (Harvard University) и E. Boyden (MIT), обладают спектром поглощения с максимумом в диапазоне 580-590 нм и квантовым выходом флуоресценции в диапазоне 0.4 - 1.4%. В группе под руководством F. H. Arnold (Stanford University) методом направленной эволюции удалось получить набор вариантов археородопсина-3 с наиболее на данный момент сдвинутым красную область спектром поглощения (616-628 нм) и квантовым выходом флуоресценции в диапазоне 0.34 - 0.87% (McIsaac RS et al., PNAS, 2014). Этой группе также удалось достичь более высокого квантового выхода флуоресценции (1.2%), но при этом флуоресценция перестала быть потенциал-зависимой (McIsaac RS et al., PNAS, 2014).
Для применения метода рационального дизайна к разработке новых инструментов на основе археородопсина-3 необходимо детальное понимание механизма флуоресценции. Для флуоресцентных белков QuasAr1, Archon1 исследования в данном направлении проводятся группой под руководством проф. P. Hegemann. В работах этой группы найдены некоторые структурные особенности флуоресцентных мутантов, однако механизм не был определен (Silapetere A et al., Nat. Commun., 2022). Также на сегодняшний день не проводились исследования по разработке флуоресцентных сенсоров мембранного потенциала на основе родопсинов, отличных от археородопсина-3, хотя наличие флуоресцентного состояния белка было найдено у набора других родопсинов, активно применяющихся в оптогенетике – натриевая помпа KR2, галородопсин, канальный родопсин (Kojima K et al., J. Phys Chem B, 2020). Создание флуоресцентных сенсоров на основе этих родопсинов, традиционно применяющихся в оптогенетике для активации и деактивации нейронной активности, может позволить использовать один белок в качестве актуатора при освещении на одной длине волны и сенсора при освещении на другой длине волны.
Нашей группой на основании анализа вариантов археородопсина-3, полученных методом направленной эволюции (McIsaac RS et al., PNAS, 2014) был проведен рациональный дизайн новых потенциал-зависимых флуоресцентных сенсоров на основе археородопсина-3, обладающих ярким флуоресцентным сигналом (квантовый выход флуоресценции приблизительно 1.2%) и спектром поглощения в диапазоне 638-643 нм (Рис. 1), что на данный момент является наиболее сдвинутым в длинноволновую область спектром (статья находится на рассмотрении в редакции). Для дизайна использовалась информация о механизме флуоресценции, полученная из результатов компьютерного моделирования. В рамках данного проекта планируется применить данную стратегию для получения новых вариантов флуоресцентных сенсоров как на основе археородопсина-3, так и других бактериальных родопсинов, применяемых в оптогенетике.
В данном проекте предлагается проведение дизайна фоточувствительных белков, родопсинов, с оптимальными свойствами для оптогенетических исследований. Оптимизируемыми свойствами будут максимумы полосы электронных спектров поглощения и интенсивность флуоресценции. Для дизайна будут задействованы как высокопроизводительные вычисления, так и эксперимент.
Используемые методы.
1. In silico дизайн.
а) Общие подходы к дизайну. Двумя наиболее часто используемыми подходами для дизайна белков с заданными свойствами являются рациональный дизайн и метод направленной эволюции. Для рационального дизайна как правило используются компьютерные модели, которые позволяют связать первичную структуру белка с оптимизируемым свойством. На основе этих компьютерных моделей предлагаются аминокислотные замены, которые могут быть экспериментально реализованы хорошо разработанным методом генетической инженерии – методом сайт-направленного мутагенеза. Метод направленной эволюции основан на последовательной генерации и синтезе наборов мутантов со стохастическим распределением аминокислотных замен и экспериментальном скрининге оптимизируемого свойства. Использование генетических алгоритмов позволяет итеративно улучшать оптимизируемое свойство на каждом этапе генерации.
Оба из рассматриваемых способов имеют свои достоинства и недостатки. Главный недостаток метода рационального дизайна – это сложность построения вычислительных моделей при недостатке информации о факторах, определяющих оптимизируемое свойство. При этом если получается построить вычислительные модели необходимого качества, то можно свести к минимуму экспериментальную часть. Метод направленной эволюции требует синтеза и скрининга огромного количества белков и не всегда позволяет получить самое оптимальное решение. С другой стороны, метод направленной эволюции позволяет получать белки с улучшенными свойствами без знания определяющих эти свойства факторов. Также метод направленной эволюции требует большого количества материальных ресурсов.
В данном проекте планируется использовать подход, позволяющий использовать сильные стороны обоих методов и повысить их эффективность. Для ограниченного набора белков, оптимизированных методом направленной эволюции, будут построены компьютерные модели и выявлены факторы, определяющие оптимизируемые свойства. Полученная информация будет использована для последующего рационального дизайна. Предложенные на основе рационального дизайна кандидаты будут синтезированы методом направленного мутагенеза и эффективность оптимизации искомых свойств будет проверена экспериментально. Для стадии направленной эволюции будут использованы наборы мутантов, известные из литературы. А также будут использованы и протестированы алгоритмы для проведения направленной эволюции in silico, основанные на объединении генетических алгоритмов и методов для расчета оптимизируемого свойства белка по его первичной структуре.
b) Предсказание трехмерных структур родопсинов на основе аминокислотной последовательности. Для предсказания структур родопсинов в основном состоянии и интермедиатов фотоцикла родопсинов на основе аминокислотной последовательности будет применяться метод моделирования по гомологии. Будет применяться наработанная нами методика (Nikolaev, D.M. … Ryazantsev, M.N., ACS Omega, 2018). Для предсказания наличия и положения молекул воды в полостях белка будет использоваться алгоритм Dowser++. Обоснование: результаты проведенного нами сравнительного исследования методов предсказания молекул воды в полостях белков (Nikolaev DM … Ryazantsev MN, PCCP, 2020).
с) КМ/ММ расчеты. Для оптимизации структуры родопсинов и расчета максимумов полос поглощения будут использоваться гибридные квантово-механические/молекулярно-механические (КМ/ММ) методы. Обоснование: методы были нами успешно использованы в ряде работ (Ryazantsev, M.N … Morokuma K, JACS, 2012; Schapiro I., Ryazantsev M. N. … Olivucci M, JACS, 2011; Melloni A., … Ryazantsev M.N. … Olivucci M., JACS, 2010; Sinicropi A., Martin E., Ryazantsev M.N. … Olivucci M, PNAS, 2008; Sumita M., Ryazantsev M.N., Saito K., PCCP, 2009; Nikolaev DM … Ryazantsev MN, PCCP, 2020; Shtyrov AA … Ryazantsev MN, IJMS, 2021). Для оптимизации геометрии хромофора в белке на поверхности энергии Гиббса будет использоваться КМ/ММ метод ASEC-FEG (Average Solvent Electrostatic Configuration - Free Energy Gradient), успешно примененная нами для моделирования родопсинов (Nikolaev DM … Ryazantsev MN … Olivucci M, JCTC, 2021).
Для расчета разницы в энергии Гиббса между конформерами родопсинов будет использоваться подход, основанный на построении термодинамического цикла и применения метода возмущения свободной энергии. Обоснование: метод был нами успешно использован в применении к родопсинам (Nikolaev DM … Ryazantsev MN … Olivucci M, JCTC, 2021).
Для расчета максимума флуоресценции и величины барьера на поверхности потенциальной энергии возбужденного состояния хромофора в электростатическом поле белка будут использоваться разработанный членами коллектива метод автоматического моделирования пути реакции от Франк-Кондоновской точки до конического пересечения. Используется модификация метода double-ADDF (double Anharmonic Distortion Downward Following), позволяющий автоматически строить пути реакции и находить сложные переходные состояния и интермедиаты на поверхности потенциальной энергии между заданными продуктами и реагентами (Ryazantsev M.N. et al., PCCP, 2015).
d) Направленная эволюция in silico. Для проведения направленной эволюции родопсинов in silico будут применяться стандартные генетические алгоритмы, связанные с модулем для построения КМ/ММ моделей родопсинов по аминокислотной последовательности для проведения вычислительного скрининга. Обоснование: первая версия алгоритма была нами разработана и программно реализована для сдвига pKa контриона археородопсина-3 (см. Задел).
3. Экспериментальные методы.
а) Биотехнологические методы для получения бактериальных родопсинов. Планируется использовать наработанную нами методику, приведенную ниже.
Используется прокариотическая плазмида pET-28b WT Arch-3-eGFP (Addgene, плазмида #58488). Мутации вводятся при помощи ПЦР с использованием полимеры AccuPrime Pfx DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific). Полученные конструкты транфецируются в клеточную линию E. coli (штамм XL1Blue). Для выделения ДНК используется стандартный набор (Plasmid Miniprep kit, Evrogen). Полученные конструкты верифицируется секвенированием.
Для наработки белка клеточная линия E. coli выращивается до OD600=0.7 при 37 С в питательной среде, содержащей 0.1 мкг/мл ампициллина. Затем в клеточную среду добавляется транс-ретиналь (концентрация 5 мкМ) и IPTG (концентрация 0.5 мМ), после чего клетки выдерживаются в течение 4-5 часов при 37 С в темноте. После завершения этой процедуры клетки выделяются центрифугированием (10 мин, 5000 оборотов в минуту), ресуспендируются в растворе, содержащем 0.3 М NaCl, 50 mM MgCl2, 0.01 М PBS, pH=7.4 и лизируются сонификатором Qsonica Q125 в течение 5 минут на льду (5 sec on / 10 sec off). Лизат центрифугируется (10 мин, 14000 оборотов в минуту), осадок ресуспендируется в водном растворе детергента (n-Decyl-beta-D-Maltopyranoside).
Полученная смесь пропускается через колонку (Ni-NTA agarose), промывается 3 раза 1 мл буфера (0.3 M NaCl, 0.05 M фосфатный буфер pH=7.0, 5 mM имидазол). Очищенный белок вымывается из колонки 1 мл раствора, содержащего 300 М имидазол, 0.1\% DM, 0.3 M NaCl, 0.05 M фосфатного буфера pH=8.0. Имидазол удаляется путем пятикратного промывания 0.1% водным раствором DM в фильтровальной колонке с фильтром 10 кДа (Amicon, Merck) при центрифугировании на 8000 g. Конечная концентрация белка определяется методом Бредфорда (Pierce BSA Protein Assay Kit, Thermo scientific).
б) Спектральные методы.
Для измерения спектров поглощения и флуоресценции (включая спектроскопию временного разрешения), а также спектров комбинационного рассеяния будут использоваться стандартные протоколы. Квантовые выходы флуоресценции будут измеряться как с использованием метода интегрирующей сферы, так и с использованием стандартов, в качестве которых будут использоваться флуоресцентные белки с известным квантовым выходом.
План работы
1 год.
Реализация и тестирование предложенных подходов к комбинированному дизайну, описанному выше, в применении к археородопсину-3. Будут предложены и получены новые флуоресцентные белки на основе археородопсина-3, будут исследованы их спектральные и фотофизические свойства.
Будет написан и протестирован программный код для in silico направленной эволюции для оптимизации максимума полосы поглощения и pKa критических аминокислот. В качестве дескрипторов для скрининга будут использованы связанные со спектром поглощения свойства, такие как изменения длин двойных и одинарных связей (BLA) и перенос заряда при переходе в возбужденное состояние.
Будет проведено исследование факторов, определяющих квантовый выход и потенциал-зависимость флуоресценции.
Расчеты будут сделаны с использованием ресурсов НИВЦ МГУ.
2, 3, 4 год. Будет продолжена работа по белкам на основе археородопсина-3, а также будут наработаны экспериментальные методики для синтеза и проведены исследования других типов родопсинов, в первую очередь натриевой помпы KR2. Будут проведен поиск дескрипторов для скрининга квантового выхода флуоресценции, а также факторов и дескрипторов для потенциал-зависимости флуоресценции.
Расчеты будут сделаны с использованием ресурсов НИВЦ МГУ.
Основным фактором, определяющим возможности проведения рационального дизайна белков in silico, является возможность конструирования компьютерной модели белка нужного качества. Для родопсинов, которые являются предметом исследования в данном проекте, членами коллектива были наработаны все методики, необходимые для получения трехмерных структуры белков и расчета на их основе спектральных и фотохимических свойств.
1. Были разработаны методики для расчета максимумов спектров поглощения родопсинов на основе кристаллографической структуры (Ryazantsev, M.N. // Morokuma K, JACS, 2012; Schapiro I., Ryazantsev M. N. // Olivucci M, JACS, 2011; Struts, A.V., Ryazantsev, M.N. // Brown MF, Biophys. J., 2019; Nikolaev DM // Ryazantsev MN, Phys Chem Chem Phys, 2020). Продемонстрировано хорошее согласие рассчитанных максимумов спектров поглощения с экспериментом. Проведено исследование механизмов влияния окружения белка на положение спектра поглощения ретинального хромофора, показано влияние реорганизации полярных аминокислот в связывающей хромофор полости и заряженных аминокислот белка на возникновение спектрального сдвига (Ryazantsev, M.N. // Morokuma K, JACS, 2012; Shtyrov AA // Ryazantsev MN, IJMS, 2021).
2. Были разработаны методики для моделирования максимумов спектров поглощения родопсинов на основе аминокислотной последовательности (Nikolaev DM // Ryazantsev MN, ACS Omega, 2018; Nikolaev DM // Ryazantsev MN, F1000Research, 2017; Shtyrov AA // Ryazantsev MN, IJMS, 2021). Показано хорошее согласие с экспериментов рассчитанных максимумов спектров поглощения бактериальных и зрительных родопсинов, структура которых была предсказана на основании аминокислотной последовательности.
3. Была разработана, программно реализована и успешно протестирована на наборе родопсинов методика для оптимизации геометрии хромофора в белке на поверхности энергии Гиббса и последовательный расчет свободной энергии Гиббса с использованием термодинамического цикла. Методика основана на проведении КМ/ММ оптимизации геометрии хромофора (КМ часть) в усредненном поле белка (Average Solvent Electrostatic Configuration, ASEC). Также для родопсинов был адаптирован метод расчета разницы в энергии Гиббса между конформерами белка, основанный на использовании термодинамического цикла. Для зрительного родопсина и Anabaena Sensory Rhodopsin показано хорошее согласие между рассчитанными данными и экспериментально наблюдаемыми соотношениями изомеров (Nikolaev DM // Ryazantsev MN // Olivucci M, J Chem Theor Comput, 2021).
4. Нами были наработан набор экспериментальных методов для синтеза мутантных форм археородопсина 3 и исследования их спектральных и фотофизических характеристик. Методы использовались для экспериментального исследования набора мутантов археородопсина 3 (см пункт 5), которое включало следующие этапы. 1. Внесение аминокислотных замен в генный вектор белка дикого типа, проверка внесенных аминокислотных замен секвенированием. 2. Экспрессия белка в E. Coli, выделение и очистка белка. 3. Измерение UV-Vis спектров, спектров комбинационного рассеяния и спектров флуоресценции выделенных белков. 4. Определение потенциал-зависимости флуоресценции белков путем измерения изменения яркости флуоресценции белка, экспрессированного в E. Coli, после добавления антибиотика в раствор с клетками (изменение мембранного потенциала вследствие гибели клетки). См. подробности в секции “Предлагаемые методы и подходы”.
5. Предлагаемый в данном проекте подход к дизайну белков, основанный на комбинировании стохастических методов и методов рационального дизайна, был успешно применен коллективом для получения новых флуоресцентных белков на основе археородопсина 3. Нами был проведен анализ набора мутантов, полученных методом направленной эволюции группой F. H. Arnold (McIsaac RS et al., PNAS, 2014) со спектром поглощения в диапазоне 616-628 нм и квантовым выходом флуоресценции достигающим 1.2%. Набор из пяти белков был исследован нами при помощи экспериментальных методов (спектроскопия комбинационного рассеяния, спектры электронного поглощения, спектры флуоресценции) и методов компьютерного моделирования. Было показано, что во всех изученных мутантах происходит термодинамическая стабилизация состояния (О-формы), отличного от основного состояния белка дикого типа (G-формы). Характерными особенностями О-формы является протонирование контриона Asp222 и депротонирование глутаминовой кислоты Glu214 (Рис. 2). На основании анализа КМ/ММ моделей были определены аминокислотные замены, приводящие к повышению pKa(Asp222) и, соответственно дестабилизации G-формы, а также приводящие к повышению стабильности О-формы за счет модификации сети водородных связей. Предложенные на основании моделирования мутанты были синтезированы, их спектральные и фотофизические характеристики были измерены экспериментально. Было показано, что полученные белки характеризуются высоким квантовым выходом флуоресценции и спектром поглощения в диапазоне 640-644 нм
6. Нами был разработан и программно реализован генетический алгоритм для заданного сдвига характеристик белка. Для проверки работы алгоритма в качестве свойства был выбран pKa(Asp222), повышение которого коррелирует с повышением стабилизации флуоресцентной формы белка (О-формы). Показано, что в течение 30 поколений алгоритм позволил определить набор мутантов археородопсина 3 со значением pKa(Asp222) в диапазоне 9.0-9.5, что существенно выше значения для дикого типа (3.8)
7. Нами были разработаны и программно реализованы методы для расчета величин барьеров на поверхности потенциальной энергии возбужденного состояния хромофора родопсинов в электростатическом поле белка. Использован подход для автоматического моделирования путей химических реакций и поиска переходных состояний, проводится поиск переходного состояния и минимума между Франк-Кондоновской точкой и коническим пересечением. Используется алгоритм double-ADDF (double Anharmonic Distortion Downward Following), позволяющий автоматически строить пути реакции и находить сложные переходные состояния и интермедиаты на поверхности потенциальной энергии между заданными продуктами и реагентами (Ryazantsev M.N. et al., PCCP, 2015).
8. У коллектива имеется большой опыт исследования спектральных, фотофизических и фотохимических свойств систем, включая спектроскопию высокого временного разрешения (Strashov DM, .., Panov MS, .., Ryazantsev MN, IJMS, 2021; Khvorost TA, …, Ryazantsev MN .., Mereshchenko AS., J Phys Chem B, 2021; Panov MS, …, Ryazantsev MN, .., Wilson RM, JACS, 2013; Mereshchenko AS,.., Panov MS.., Tarnovsky AN, J. Phys Chem B, 2019).
Основные публикации по теме проекта за последние 3 года.
1 Shtyrov, A. A., Nikolaev, D. M., Mironov, V. N., Vasin, A. V., Panov, M. S., Tveryanovich, Y. S., & Ryazantsev, M. N., 2021. Simple Models to Study Spectral Properties of Microbial and Animal Rhodopsins: Evaluation of the Electrostatic Effect of Charged and Polar Residues on the First Absorption Band Maxima. International Journal of Molecular Sciences, 22(6), p. 3029. DOI: 10.3390/ijms22063029. (IF: 5.924, Q1)
2 Nikolaev, D. M., Manathunga, M., Orozco-Gonzalez, Y., Shtyrov, A. A., Guerrero Martínez, Y. O., Gozem, S., Ryazantsev M.N., Coutinho K., Canuto S., Olivucci, M., 2021. Free Energy Computation for an Isomerizing Chromophore in a Molecular Cavity via the Average Solvent Electrostatic Configuration Model: Applications in Rhodopsin and Rhodopsin-Mimicking Systems. Journal of Chemical Theory and Computation, 17(9), pp. 5885–5895. DOI: 10.1021/acs.jctc.1c00221. (IF: 6.006, Q1).
3 Strashkov D. M., Mironov V. N., Nikolaev D. M., Panov M. S., Linnik S. A., Mereshchenko A. S., Kochemirovsky V. A., Vasin A. V., Ryazantsev M. N., 2021. Azobenzene/Tetraethyl Ammonium Photochromic Potassium Channel Blockers: Scope and Limitations for Design of Para-Substituted Derivatives with Specific Absorption Band Maxima and Thermal Isomerization Rate. International Journal of Molecular Sciences, 22(23), p. 13171. DOI: 10.3390/ijms222313171. (IF: 5.924, Q1)
4 Nikolaev, D. M., Shtyrov, A. A., Mereshchenko, A. S., Panov, M. S., Tveryanovich, Y. S., Ryazantsev, M. N., 2020. An assessment of water placement algorithms in quantum mechanics/molecular mechanics modeling: the case of rhodopsins’ first spectral absorption band maxima. Physical Chemistry Chemical Physics, 22 (32), pp. 18114-18123. DOI: 10.1039/D0CP02638G. (IF: 3.567, Q
