ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ ОТЧЕТА О НИР
Задача 1. Постановка экспериментов по термической обработке и искусственному старению семян различных сортов гороха.
Семена 20 сортов гороха были подвержены ускоренному старению при 45°С и относительной влажности 86% в течение 3 и 6 суток. Оптимизация процедуры ускоренного старения (УС) заключалась в подборе времени, после которого будет происходить значительное, однако не полное уменьшение всхожести семян. Затем была проведена оценка всхожести семян как интактных, так и подверженных УС. Оценка всхожести включала ежедневный подсчет количества семян с проклюнувшимся зародышевым корешком. Было установлено, что полученные семена оказались невысокого качества, так как, несмотря на то, что все семена прорастали в отсутствие УС, они не прорастали после 3ёх суток УС. Семена только одного сорта (Frisson) проросли после 3ех суток УС. Два сорта (PS9910134 и Sparkle) не взошли даже в отсутствие УС, поэтому они были исключены из работы.
Также семена всех сортов были высажены и выращены растения для получения свежих семян высокого качества. Для этого семена были стратифицированы в темноте в течение двух суток при 4С, пророщены в течение двух суток при 22С, перемещены в сосуды с землей и инокулированы культурой симбиотической бактерии Rhizobium leguminosarum bv. viciae CIAM 1026. Растения выращивали при световом режиме 16/8 часов день/ночь при 21°C и относительной влажности воздуха 75%. После сбора семена выдерживались при 18°C в течение двух месяцев для дозревания.
Задача 2. Скрининг провоспалительных эффектов белковых экстрактов, глубоких гидролизатов белка и водно-метанольных извлечений из семян гороха различных сортов.
Для выявления потенциальных провоспалительных эффектов различных компонентов семян гороха, образующихся при формировании семян, их хранении и термической обработке, была использована клеточная культура человека. Использование глубоких гидролизатов позволяет моделировать происходящее в желудочно-кишечном тракте переваривание белков до аминокислот, в том числе гликированных, которые наряду со вторичными метаболитами всасываются и попадают в кровяное русло, а затем эти соединения с током крови распространяются по организму и способны влиять на физиологические процессы.
Для обработки клеток белковыми гидролизатами было проведено выделение тотального белка методом фенольной экстракции с последующим определением концентрации белка с помощью набора 2D Quant (GE Healthcare). Для нормализации концентраций выделенных белков проводился электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na. Затем был проведен глубокий энзиматический гидролиз путем последовательной инкубации тотального белка с проназой Е (2 этапа по 24 ч при 37°С: на каждом этапе добавляли фермент в расчете 0,8 Е на 1 мг белка), протеиназой К (24 ч при 37°С в расчете 0,13 Е на 1 мг белка) и карбоксипептидазой Y (24 ч при 25°С в расчете 0,11 Е на 1 мг белка).
Для изучения воспалительного клеточного ответа использовали клеточную линию острой моноцитарной лейкемии человека THP-1. Недифференцированные и диференцированные клетки линии THP-1 представляют собой моноциты и макрофаги, соответственно, которые используются как модель для изучения про- и противовоспалительных эффектов различных соединений. Клетки обрабатывали разными концентрациями гидролизатов (0.0625-5 мг/мл) в течение разных временных промежутков (0.5-24 ч). Отрицательный контроль был представлен культуральной средой. После инкубации клеток с гидролизатами из лунок удаляли ростовую среду, дважды промывали раствором Хенкса, добавляли лизирующий буфер, содержащий ингибиторы протеиназ, фосфатаз и бензоназу в концентрациях, указанных в инструкциях производителей, после чего инкубировали при перемешивании в течении 10 мин при 4°С. После этого, лизаты центрифугировали при 20 000 g при 4°С в течение 20 мин. Затем в супернатанте определяли концентрацию белка по методу Лоури. Оценка клеточного воспалительного ответа основана на анализе активации NF-κB (фосфорилирование по Ser536, главного транскрипционного фактора, отвечающего за запуск воспалительной реакции. Анализ белков, вовлеченных в NF-κB-опосредованный сигналинг (c-Myc, FADD (Ser194), IκBα (Ser32), IKKα/β (Ser177/Ser181), NF-κB (Ser536), TNFR1), в полученных лизатах проводили с использованием многопараметрической иммунофлуоресцентной технологии Luminex xMAP (Bio-Plex 200, Bio-Rad) и набора MILLIPLEXMAP NF-κB Signaling 6-plex Magnetic Bead Kit 96-well Plate (Merk/Millipore) согласно инструкции производителя. Кроме того, клеточные лизаты анализировали с помощью набора MILLIPLEX MAP Multi-Pathway Magnetic Bead 9-Plex Kit для оценки активации других внутриклеточных сигнальных каскадов по уровню фосфорилирования следующих белков: CREB (pS133), ERK (pT185/pY187), NF-κB (pS536), JNK (pT183/pY185), p38 (pT180/pY182), p70 S6K (pT412), STAT3 (pS727), STAT5A/B (pY694/699), Akt (pS473). Полученные данные были обработаны с помощью программного обеспечения Bio-Plex Data Pro (Bio-Rad).
При обработке клеток THP-1 в течение 3 ч белковыми гидролизатами семян гороха в концентрации 0,5 мг/мл уровень фосфорилирования с-myc, ERK 1/2, Akt, JNK, CREB, p38, p70s6k изменялся по сравнению с клетками, обработанными средой. Однако не наблюдалось достоверной разницы в активации сигнальных каскадов при обработке разными типами гидролизатов, так как при данных условиях эксперимента клетки инкубируются в среде с высоким содержание аминокислот и их аддуктов. По-видимому, вклад клеточного ответа на присутствие аминокислотных аддуктов, образовавшихся в ходе ускоренного старения семян или термической обработки, в культуральной среде незначителен по сравнению с реакцией клеток на внесение гидролизатов в целом. Таким образом, для выявления провоспалительных свойств аминокислотных аддуктов, выделенных из семян гороха, необходимо провести изоляцию аддуктов из общей смеси аминокислот.
Задача 3. Широкомасштабный анализ метаболома семян гороха различных сортов.
Для выполнения данной задачи был использован замороженный измельченный с помощью барабанно-шаровой мельницы материал семян 18 линий гороха, подвергнутых искусственному старению, а также соответствующих контрольных образцов. При этом использовались новые, свежие семена, полученные в течение первого года выполнения проекта. Таким образом, в ходе метаболомного был проанализирован материал 36 экспериментальных вариантов семян гороха, каждый вариант был представлен материалом 3 биологических повторностей. Были отобраны навески этого материала для анализа первичных термостабильных метаболитов методом газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХМС), первичных термолабильных метаболитов методом ион-парной обращенно-фазовой ультравысокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрией (УВЭЖХ-МС) и вторичных семиполярных метаболитов методом обращенно-фазовой УВЭЖХ-МС.
Паттерны термостабильных первичных метаболитов семян гороха и их качественные изменения, связанные с ускоренным старением. На хроматограммах ГХМС экстрактов семян гороха всех 18 линий, проанализированных в рамках данного эксперимента, было аннотировано 235 хроматографических сигналов, из которых 126 пиков были идентифицированы как термостабильные первичные метаболиты (т.е. соединения, образующие термостабильные триметилсилильные дериваты, не деградирующие в условиях высокотемпературной инжекции в газовом хроматографе. Некоторые соединения были представлены несколькими сигналами, соответствующими структурно различным дериватам, содержащим различное количество ТМС-остатков. В связи с этим, общее число идентифицированных метаболитов было 88. При этом идентификация была основана на собственной спектральной библиотеке группы и ко-элюции с аутентичными стандартами, а также результатами поиска против библиотеки NIST и GMD. Было выявлено также несколько контрастных различий на качественном уровне. Так, в частности, глицин не был обнаружен в контрольных семенах следующих линий гороха: 4 (Vendevil), 12 (К-925), 13 (K-7129), 14 (PS9910188), 16 (Long drink (K-8261)), 18 (PS810191), стеариновая кислота не была обнаружена в контрольных семенах сорта 16 (Long drink (K-8261)). Количественные паттерны термостабильных метаболитов контрольных семян и семян, подвергнутых ускоренному старению, существенно различались во всех исследованных линиях гороха, что было показано методом главных компонент, выполненного отдельно для каждого сорта гороха. Выдерживание семян в условиях повышенных температуры и влажности способствовали накоплению в этих семенах значительного числа метаболитов. Среди накапливаемых метаболитов можно выделить группу из 8 метаболитов (сорбитол, глюконовая кислота и ее сигма-лактон, неидентифицированная С6-сахарная кислота, инозитол, манноза, тирозин, неидентифицированный амин), уровни которых в основном многократно (более чем в 3 раза) возрастали в стареющих семенах большинства линий гороха. В связи с этим для выявления метаболитов, которые могли бы служить потенциальными индикаторами чувствительности семян, изучаемых линий гороха, к условиям ускоренного старения, было решено сравнить метаболические профили семян у линий контрастных по проценту ненормально развиваемых проростков из стареющих семян. По этому признаку из всех линий гороха наиболее чувствительными к условиям ускоренного старения были сорта 11 (К-1693) и 20 (Sparkle), а наиболее устойчивыми к этим условиям были сорта 6 (Frisson) и 17 (Fallon).
Анализ первичных термолабильных метаболитов методом УВЭЖХ-МС. Для анализа использовали метод ион-парной УВЭЖХ на хроматографе Waters ACQUITY UPLC H-Class UPLC System(Waters GmbH), сопряженном в режиме он-лайн с тандемной масс-спектрометрией (масс-спектрометр AB Sciex QTRAP 6500, AB Sciex). Кластерный анализ с построением тепловых карт уровней содержания полярных метаболитов в 18 сортах гороха выявили присутствие межсортовой вариабельности содержания полярных термолабильных метаболитов в контрольных группах и группах с ускоренным старением семян. С другой стороны, предварительный анализ методом главных компонент (МГК) показал различия в ответе первичных метоболомов индивидуальных сортов гороха на условия ускоренного старения (УУС): для семи сортов эти различия были четкими (кластер образцов семян, подвергнутых УУС четко отделялся от кластера контрольных уже по первой компоненте), в то время как для одиннадцати других четкого разделения кластеров не наблюдалось. Анализ вклада индивидуальных метаболитов в наблюдаемые различия между группами семян, подвергшихся ускоренному старению и контролем с помощью индекса важности переменной в проекции VIP (Variable Importance in the Projection) показал, что приложение УУС семян прежде всего оказывает влияние на процессы энергетического обмена и метаболизма нуклеотидов.
Анализ вторичных семиполярных метаболитов. Данный анализ выполняли с помощью хроматографа Waters ACQUITY UPLC I-Class UPLC System (Waters GmbH) соединенного в режиме онлайн с гибридным масс-спектрометром AB Sciex TripleTOF 6600 (AB Sciex) c квадруполь- времяпролетным масс-анализаторами (QqTOF-MS) с ионизацией электрораспылением. Было выполнено два УВЭЖХ-МС/МС эксперимента. В ходе первого анализа осуществлялась регистрация положительно заряженных, а в ходе второго – отрицательно заряженных квази-молекулярных ионов семиполярных метаболитов. В экстрактах семян гороха всех 18 линий, рассматриваемых в данном эксперименте, в режимах регистрации положительных и отрицательных квази-молекулярных ионов метаболитов было аннотировано 6349 и 4625 возможных аналитов (features), соответственно. Для выполнения относительного количественного анализа вторичных соединений с целью выявления направленности и выраженности метаболических ответов в сравниваемых вариантах аналиты, которые показывали низкую повторяемость (оценена с использованием относительного стандартного отклонения (RSD = стандартное отклонение/среднее), были отфильтрованы из последующего анализа. Порог фильтрации был установлен таким образом, что осталось 2500 предполагаемых аналитов для каждого режима детектирования. Кластерный анализ с построением тепловых карт уровней содержания вторичных метаболитов в 18 сортах гороха выявил значительные различия количественных профилей вторичных метаболитов контрольных семян и семян, подвергнутых УУС для всех индивидуальных сортов. Как и в случае с первичными метаболитами выдерживание семян в условиях повышенных температуры и влажности способствовали накоплению в этих семенах значительного числа вторичных семиполярных метаболитов. В условиях контроля и ускоренного старения было обнаружено 5 общих метаболитов в режиме регистрации положительных ионов:
m1964 (время удерживания (tR) - 4.70, m/z - 331.1535, предполагаемая идентификация – гиббереллин, протонный аддукт [M+H]+)
m3322 (tR - 5.88, m/z - 454.1351, аннотация - неизвестный метаболит, аммониевый аддукт - [M+NH4]+)
m4690 (tR - 4.58, m/z - 666.2008, аннотация – неизвестный метаболит, протонный аддукт [M+H]+)
m5862 (tR - 10.23, m/z -914.5233, аннотация – неизвестный метаболит, аддукт [M+H]+),
m5898 (tR - 10.23, m/z - 930.5427, предполагаемая идентификация – β-D-глюкопиранозидуроновая кислота, аммониевый аддукт - [M+NH4]+);
в режиме детекции отрицательных ионов:
m3905 (tR – 6.047, m/z - 809.21204, аннотация – неизвестный метаболит, аддукт - [M-H]-) и m930 (tR - 4.726, m/z -347.142431, аннотация – неизвестный метаболит, аддукт - [M-H]-).
Aвтоматическая идентификация аналитов выполнялась программой MSDial, которая основывалась на поиске и сравнении экспериментальной пары m/z значений (m/z Q1 квази-молекулярного иона и m/z Q3 одного из фрагментных ионов аналита) со стандартами масс-спектрометрических библиотек MassBank (https://massbank.eu/MassBank/ https://massbank.eu/MassBank/), MoNA (MassBank of North America) https://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/). Однако, данный метод не обладает высокой надежностью идентификации. Поэтому, выявленные соединения нуждаются в дополнительной четкой идентификации, поскольку они могут служить маркерами чувствительности сорта семян к старению или к условиям хранения. Таким образом, обнаруженные предполагаемые молекулярные маркеры будут выделены препаративно и структура этих веществ будет охарактеризована с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса. Этот метод получить информацию, достаточную для однозначного вывода о структуре веществ.
Задача 4. Широкомасштабный анализ протеома семян гороха.
Был проведен протеомный анализ интактных и подверженных УС семян четырех сортов гороха. Для этого были выбраны сорта Rondo (с зелеными семядолями) и Skif (с желтыми семядолями), которые использовались в ходе первого года выполнения проекта для проведения метаболомного анализа. А также были выбраны сорта Long drink и Sparkle, которые проявляли высокую и низкую степень устойчивости к УС, соответственно. Для проведения протеомного анализа белок был выделен с помощью метода фенольной экстракции. После растворения полученного белка в водном растворе 10% (w/v) ДДС-Na, была определения концентрации белка с помощью набора 2D Quant (GE Healthcare). Пробоподготовка и триптический гидролиз образцов проводилась с помощью центрифужных фильтров Amicon Ultra 30K (Merck). Для контроля прохождения гидролиза проводили электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na. Полученные гидролизаты были обессолены с помощью обратно-фазной твердофазной экстракции. Затем триптические гидролизаты были проанализированы с помощью нанопоточной обратнофазовой хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием нанопоточного хроматографа EASY-nLC 1000 и гибридного масс-спектрометрa LTQ-Orbitrap-Velos (Thermo Fisher Scientific). Для обработки данных было использовано программное обеспечение Progenesis QI (Non-linear Dynamics). В результате может быть получен список дифференциально экспрессированных белков. В рамках данного исследования для этого была использовано програмное обеспечение. Список дифференциально обильных пептидов был использован для поиска против базы данных последовательностей гороха (референсный геном гороха) с помощью поисковой машины SEQUEST и програмного обеспечения Proteome Discoverer 2.2. Результат поиска был загружен в Progenesis QI. В результате был получен финальный список, содержащий 344 уникальных дифференциально экспрессированных белка, которые в дальнейшем были нормализованы с помощью log2-трансформации для дальнейшего процессинга. Для снижения размерности массива данных был проведен анализ с помощью метода главных компонент. В результате анализа было выявлено 24 компоненты, вносящих вклад в различия между экспериментальными группами, наиболее информативные из них 1 и 2 компоненты. Было показано, что доля межсортовых различий гораздо выше, чем различий между контрольными и подверженными УС семенами внутри каждого сорта. При этом группируются сорта Rondo и Skif, которые в свою очередь различаются по цвету семядолей и устойчивости к УС. Функциональная аннотация, проведенная с помощью алгоритма Mercator позволила распределить 344 дифференциально экспрессированных белка, выделенных из интактных и подверженных УС семян гороха к одному из 34 функциональных классов. Кластер с наибольшим количеством записей – это белковый метаболизм. Субклеточная локализация была предсказана с помощью веб-сервера BUSCA (Bologna Unified Subcellular Component Annotator). Было установлено, что большая часть белков, вносящих вклад в различия, сосредоточена в ядре (30%), цитоплазме (20%), в хлоропластах (18%), и экстраклеточном пространстве (%). Меньше всего таких белков локализовано в закрепленных компонентах плазматической мембраны (менее 1%).
Таким образом, предварительный протеомных анализ с использованием семян четырех сортов гороха показал, что наибольшую значимость имеют межсортовые различия.
Задача 5. Анализ глубоких гидролизатов белка, изолированных из семян различных сортов гороха.
Для анализа аддуктов аминокислот, образующихся в результате УС в семенах 4ёх сортов гороха, полученные гидролизаты белков анализировали с помощью обратно-фазной жидкостной хроматографии, совмещенной с масс-спектрометрической детекцией (RP-HPLC-QqTOF-MS), используя технологию SWATH-MS (англ. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra) в режиме детекции положительных ионов. Предварительно проводили дериватизацию смеси аминокислот и аддуктов путем инкубации с дериватизирующим агентом диэтилэтоксиметиленмалонатом (DEEMM) в присутствии 0.75 моль/л боратного буфера pH 9 в течение 24 ч. Для выявления маркеров УС были проведены попарные сравнения интактных и подверженных УС семян каждого сорта с помощью дискриминантного анализа ортогональных проекций на скрытые структуры (англ. orthogonal projections to latent structures discriminant analysis, OPLS-DA). Данный анализ позволил нам выявить соединения, которые вносят наибольший вклад в различия для каждого сорта. По результатам анализа OPLS-DA для каждого сорта были отобраны топ-25 соединений с наибольшим значением VIP score (variable influence on projection).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В ходе выполнения проекта были выращены растения гороха и получены контрольные семена хорошего качества 18-ти сортов. Затем были оптимизированы условия УС семян, и определена всхожесть как интактных, так и подверженных УС семян. Далее была оценена способность гидролизатов из семян гороха четырёх сортов вызывать провоспалительную реакцию в культуре клеток. При обработке разными типами гидролизатов не наблюдалось достоверной разницы в активации сигнальных каскадов, так как, по-видимому, вклад клеточного ответа на присутствие аминокислотных аддуктов, образовавшихся в ходе ускоренного старения семян, в культуральной среде незначителен по сравнению с реакцией клеток на внесение гидролизатов в целом. Затем был проведён протеомный анализ семян четырех сортов, который показал, что наибольшую значимость на уровне белков имеют межсортовые различия. Таким образом, изменения на уровне белкового состава семян в условиях УС минимальны для рассмотренных сортов. Также был проведен анализ аминокислотных аддуктов, который позволил выявить соединения, образующиеся в ходе УС в разных сортах. И наконец, был проведен широкомасштабный метаболомный анализ семян 18-ти сортов гороха. Было выявлено, что одним из наиболее ярких маркеров устойчивости семян к хранению является сохранение уровня метаболитов энергетического обмена при приложении условий ускоренного старения. Таким образом, этот фактор рассматриваться при выборе сортов гороха с повышенным качеством семян.