Description

В условиях интенсивного земледелия все больше проявляется тенденция утраты биологического и, что особенно важно, генетического разнообразия культурных видов растений. Для всех возделываемых в условиях интенсивного земледелия сельскохозяйственным культурам характерен процесс «генетической эрозии», суть которого в обеднении разнообразия аллелей (генетического разнообразия) возделываемых и создаваемых сортов сельскохозяйственных культур из-за сужающегося круга исходного материала для селекции. Выход из кризиса видится в поиске новых перспективных аллелей в геномах диких видов, находящихся в природе (in situ), и во введении в селекционную практику староместных сортов, сохраняемых в генных банках (ex situ). Целесообразность сравнительного изучения геномной композиции перспективных староместных сортов и диких видов овса и ячменя, изучение генетического и геномного разнообразия подвидов дикорастущих предков пшеницы Aegilops tauschii и их участия в создании высокопродуктивных и устойчивых сортов пшеницы обусловлена большим интересом селекционеров к их практическому использованию. Широкий диапазон адаптаций данных форм к неблагоприятным факторам внешней среды, их приспособленности к разнообразным почвенно-климатическим условиям, устойчивости к патогенным организмам, признаков, связанных с элементами повышенной продуктивности и качества, представляет уникальный источник исходного материала для селекции.

В частности, на последней 10 Международной конференции по овсу (10IOC 2016) в Санкт-Петербурге, важнейшей конференции по селекции, генетике и геномике овса в мире, руководителями и организаторами которой были участники данного проекта, было отмечено, что наиболее актуальными направлениями расширения исходного материала для селекции являются более активное вовлечение в селекционный процесс местных, староместных сортов народной селекции и малоизученных видов рода Avena (http://oats2016.org/). Эти направления работы с селекционным материалов актуальны также для пшениц и ячменей.

Наше сравнительное исследование композиции геномов селекционных и староместных сортов и диких видов рода Hordeum (селекционные сорта, староместные сорта H. vulgare, дикорастущие подвиды H. vulgare ssp. spontaneum, которые свободно скрещиваются с культурным ячменем, дают плодовитое потомство и вид с H-геномом H. bulbosum L.), исследование вклада в геном современных сортов овсов геномов дикорастущих диплоидных и тетраплоидных видов с С- и A- геномами, многочисленных и разнообразных по композиции генома дикорастущих подвидов вида Aegilops tauschii, даст важную информацию для новых работ по селекции, поскольку использование дикорастущих видов сельскохозяйственных культур наряду с раскрытием геномного разнообразия сортов народной и промышленной селекции является наиболее перспективным направлением для борьбы с генной эрозией.

Направление нашего проекта полностью совпадает с научным направлением Стратегии НТР РФ, так как он нацелен на создание новых высокопродуктивных, высоко адаптивных и устойчивых к абиотическим факторам среды сортов ячменя, овса, пшениц.

Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.

Фундаментальная генетическая особенность культурных пшениц (род Triticum) и овсов (Avena) состоит в том, что это аллополиплоиды (тетраплоиды и гексаплоиды), геном ядра которых сформировался в результате объединения в одном ядре геномов двух или трех разных родов и видов злаков. Так ядерный геном гексаплоидных пшениц имеет в своем составе три генома – геномная формула AABBDD (2n=42). Геномы эти разного происхождения. Геном D, в частности, пшеницы получили от вида, близкого к Aegilops tauschii. Разные геномы принесли культурным сортам разные качества. Так гены, связанные с хлебопекарными характеристиками пшеницы, отличающими ее от других злаков, получены пшеницей с геномом D. Возник ли каждый аллополиплоидный вид культурных злаков однократно или имели место несколько независимых актов межвидовой гибридизации, происходивших в разное время, в разных участках ареала родительских видов и относились ли предки к одному или разным подвидам в настоящее время неизвестно, однако может быть выяснено, в частности, и в ходе данного исследования.

В отличие от культивируемых видов пшениц и овсов, в кариотипе ячменя Hordeum vulgare всего две копии генома (2n=14), хотя геном относительно большой - 4-5 млрд. п.н. (Bennett and Smith, 1976; Kankanpää et al., 1996). Однако, как все злаки, это палеополиплоид, в генеалогии которого имели место 3-4 раунда полногеномных дупликаций (Salse, 2017). Кроме того, какое-то участие в эволюции генома ячменей могли иметь место акты гомоплоидной межвидовой гибридизации, не сопровождавшиеся дупликацией генома. Проблема роли и места гомоплоидной гибридизации в эволюции растений и в генезисе сельскохозяйственных культур в частности, малоисследована. Гомоплоидные гибриды на ранних стадиях часто бесплодны или демонстрируют другие физические барьеры для дальнейшего развития, которые необходимо преодолеть естественным отбором для превращения гибрида в новый сорт или новый вид (Rieseberg et al. 1995; Abbott et al. 2010; Folk et al. 2018).

Актуальность планируемого нами цикла работ обусловлена тем, что исследования последнего времени показали: события межвидовой гибридизации, как правило, сопровождаются множественными изменениями генома и эпигенома, экспансией транспозонов, утратой значительной части генов одного из родителей, замещением гомеологов (скрытой анеуплоидией) (Родионов А.В. и др. Генетические последствия межвидовой гибридизации, ее роль в видообразовании и фенотипическом разнообразии растений // Генетика. 2019. Т. 55. №3. С. 255-272). Как именно сформировались геномы современных и староместных сортов злаков в настоящее время известно лишь в общих чертах, на основании сохранившихся записей селекционеров, однако может быть выяснено или верифицировано с использованием технологии локус-специфичного секвенирования нового поколения. Есть все основания думать, что генетическое и геномное разнообразие происхождения и современного состояния сортов и видов культурных злаков значительно выше, чем это считалось ранее. Выявить его в ходе настоящего проекта и использовать эти знания в дальнейшей селекционной работе – наша задача.

Научная новизна проекта состоит в том, что появившиеся относительно недавно методы секвенирования нового поколения (NGS) впервые позволили эффективно раскрывать внутригеномный полиморфизм полиплоидных видов, в частности, многократно повторенных в геноме генов 35S рРНК и их транскрибируемых спейсеров. Последние являются наилучшими для растений ДНК-идентификаторами видов (ДНК-штрихколами) (Shneyer V.S., Rodionov A.V. Plant DNA Barcodes // Biology Bulletin Reviews. 2019. Vol. 9. #4, p. 295-3900. DOI: 10.1134/S207908641904008X; Жохова Е.В., Родионов А.В., Повыдыш М.Н. и др. Современное состояние и перспективы использования ДНК-штрихкодирования и ДНК-фингерпринтинга для анализа качества лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов // Успехи современной биологии. 2019. Т. 139. №1. С. 25-40). Нами показано, что пыяив внутригеномный полиморфизм рДНК гибрида или вида гибридного происхождения можно эффективно определять происхождение гибридного генома и количественно оценивать присутствие в геномах аллополиплоидов рДНК каждого из предковых видов (Беляков Е.А., Мачс Э.М., Михайлова Ю.В., Родионов А.В. Гибридизационные процессы в рамках рода Sparganium L. подрода Xanthosparganium Holmb. по данным секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing — NGS) // Экологическая генетика. – 2019. – Т. 17. – № 4. – С. 25–33. https://doi.org/10.17816/ecogen17425-33; Rodionov A.V., Krainova L., Gnutikov A.A. и др. Intragenomic polymorphism of internal transcribed spacer ITS1 in the locus 35S rRNA of polyploid Avena species // Plant Genetics, Genomics, Bioinformatics, and Biotechnology (PlantGen2019). The Fifth International Scientific Conference. Novosibirsk, –2019. – P. 166). Для объектов нашего исследования методы никогда не применялись или применялись нами и фрагментарно (Rodionov et al., 2919, цит. выше).

Использование диких видов ячменя наряду с местным сортовым разнообразием является наиболее перспективным направлением для борьбы в «эррозией генофонда» культивируемых видов ячменя, расширения генетической основы для селекции создаваемых новых сортов. Генетическая коллекция ячменя ВИР (куратор – участник проекта О. В. Ковалева) уникальна по внутривидовому разнообразию ячменя (более 18000 образцов, из них 5000 местных и стародавних сортов). Наиболее интересные из них в рамках данного проекта, будут впервые охарактеризованы с помощью усовершенствованной на основе NGS технологии ДНК-штрихкодирования (генетическая паспортизация). Впервые таким образом будут изучены староместные сорта ячменя, собранные Н.И. Вавиловым и П. М. Жуковским. Это может дать возможность выделить в составе генетической коллекции ВИР новые источники аллелей и доноры хозяйственно ценных признаков, адаптивности и устойчивости к биотическим стрессам, способные расширить генетическую основу культурного ячменя. Следует отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и NGS секвенирования ранее не проводилось.

Предполагается создание геномной коллекции (коллекции тотальной геномной ДНК, выделенной из листового или семенного материала) диких видов и староместных и селекционных сортов ячменя. Наличие подобной коллекции значительно упростит геномные исследования рода и положит начало генетической паспортизации сортов и видов овса, что имеет стратегическое значение для их идентификации и последующего использования в селекционной работе особенно во временной перспективе.

Использование диких видов овса наряду с местным сортовым разнообразием культурных видов является наиболее перспективным направлением для расширения генетической основы и уменьшения генной эрозии создаваемых новых сотов. Коллекция ВИР обладает уникальным внутривидовым и видовым разнообразием овса (более 13000 образцов, относящихся к 4 культурным видам и 26 диким видам овса), для наиболее интересных из них (на этом этапе исследований) мы впервые предлагаем провести генетическую паспортизацию по маркерным последовательностям ДНК, используемым при ДНК-штрихкодировании. В ходе этого исследования впервые будут изучены староместные сорта овса, собранные в 20-е годы ХХ столетия. Это путь к выявлению новых источников и доноров хозяйственно ценных признаков продуктивности, адаптивности и устойчивости к абиотическим стрессам, расширяющих генетическую основу культурного овса, для использования в селекционных программах. Надо отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия овса для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и секвенирования по Сэнгеру и локус-специфичного секвенирования NGS для маркерных ядерных и хлоропластных последовательностей до настоящего времени не проводилось. При изучении внутригеномного полиморфизма рДНК и изучении роли и места, которую играла межвидовая гибридизация в истории современных диплоидных и полиплоидных видов Avena и сортов овса посевного нами будет использован метод targeted-секвенирования «популяции» ITS-последовательностей полиплоидных геномов и, при необходимости, генов 5S рРНК, на платформе Illumina.

Род Avena довольно разнообразен, виды, входящие в него, имеют три уровня плоидности (x = 7, 2n = 14, 28, 42) и сильно различаются по геномному составу и эколого-географическому распространению. Большинство этих видов является дикими, произрастающими либо в ненарушенных фитоценозах, либо как сегетальные сорняки (Лоскутов, 2007). В тоже время, нет единого мнения о происхождении отдельных видов овса, их систематическом положении и родственных связях. До настоящего времени существуют значительные разногласия в объеме рода, особенно касающиеся выделения редких специализированных видов из видов-агрегатов (Цвелёв, 1976; Лоскутов, 2007; Loskutov, Rines, 2011). Изучение видов-агрегатов в полном объеме, и, в частности, изучение геномной конституции этих видов методами геномики, до сих пор не проводилось, таксономический статус таких сорных видов овса, как A. volgensis, A. septentrionalis, A. intermedia, A. aemulans и др., в сущности, не известен. Наши методы, включая использование специальных праймеров на маркерные последовательности C-генома овса и targeted-секвенирование, позволят выявить геномную конституцию диких и культурных видов этого рода и точно указать диких родственников культурных видов овса.

Хлебная (мягкая) пшеница Triticum aestivum L (2л = 42) является естественным аллополиплоидом с геномной формулой BBAADD в образовании которого принимали участие диплоидные виды Triticum и Aegilops. Triticum urartu является донором генома А, геном D ведет свое происхождение от Aegilops tauschii., а наиболее вероятным донором генома В из пяти видов Aegilops секции Sitopsis язляется Ае. speltoides (Feldman, 2001), В рамках данного проекта мы планируем исследовать вклад субгеномов разных подвидов (природных рас) Ae. tauschii в гексаплоидный геном разных сортов пшеницы. Генетическая коллекция эгилопсов и пшениц ВИР уникальна как по набору линий пшеницы, в которых представлены субгеномы, произошедшие от Ae. tauschii (возможно, от разных подвидов), так и, главное, включает в себя богатую коллекцию Ae. tauschii разного происхождения, в том числе разные подвиды – всего 674 образца, из которых в работу, по нашим предварительным данным, прежде всего будет взято 12.

Современное состояние исследований по данной проблеме.

Объем и структура рода Avena, а также происхождение отдельных видов до сих пор вызывает споры среди исследователей. Значительный вклад в познание рода Avena внесли ученые ВИРа, и прежде всего А. И. Мальцев (1929, 1930), исследовавший все известные в то время виды рода Avena, в своей монографии «Овсюги и овсы» (1930). Мальцев дал наиболее полную филогенетическую систему типовой секции (Euavena Griseb.) рода Avena. Большое внимание филогении овса уделял Н. И. Вавилов (1919; 1926, 1927). В современных классификациях рода Avena наблюдаются две тенденции: укрупнение видов (основной критерий – скрещиваемость) и дробление их на основании морфологических и кариологических различий. В соответствии с этим число признаваемых видов колеблется от 7 (Ladizinsky, Zohary, 1971) до 31-34 (Baum, 1977, Zeller, 1998).

Современные прикладные и общебиологические исследования рода Avena в значительной степени опираются на молекулярно-филогенетические и кариологические данные. Так, достаточно много работ посвящено родству единственного многолетнего тетраплоидного вида A. macrostachya и диплоидных видов рода Avena (Fominaya et al., 1988; Pohler, Hoppe, 1991; Leggett, 1992; Leggett, Markland, 1995; Родионов и др., 2005; Badaeva et al., 2010). Геном этого уникального многолетнего автотетраплоидного вида ближе всего к C-геномам других видов Avena, кроме того, установлено, что его геном образовался еще до эволюционного разделения A и C-геномов овса (Родионов и др., 2005; Badaeva et al., 2010).

Анализ родства геномов видов рода Avena разного уровня плоидности методом RAPD, проведенный И.Н. Перчук и соавт. (2002) показал, что диплоидные виды рода Avena разделяются на две клады – виды с геномами А и виды с геномами С. При этом хорошо заметно отличие по набору амплифицируемых фрагментов у видов с геномами Cp (A. clauda и A. pilosa) от набора фрагментов, характерного для A. ventricosa (геном Cv). Различаются Cp и Cv геномы и по последовательностям ITS1 (Родионов и др. 2020 – в печати). В последнее время интересные данные получены при изучении полиморфизма ретротранспозонов и ISSR-маркеров, затрагивающих весь геном (Katsiotis et al, 1996; Paczos-Grzeda, Bednarek, 2014). По положению в геноме ретротранспозонов гексаплоид A. sativa оказался ближе к A. sterilis, чем к диплоиду A. strigosa (Tomas et al., 2016). ISSR-маркеры оказались эффективны в распознавании различных сортов овса и показали, что A. fatua ближе к A. sativa, чем к A. sterilis (Paczos-Grzeda, Bednarek, 2014). При этом авторы предполагают, что A. sterilis является предковым для A. fatua. Испанские исследователи использовали ретротранспозоны, а также ITS-последовательности при изучении родства гексаплоидных A. sativa, A. sterilis и диплоида A. strigosa. Анализ ITS-последовательностей показал очень высокую гомологию у всех трех видов (Родионов и др., 2005), но при проведении FISH были обнаружены различия в расположении ядрышковых организаторов (содержащих гены 35S рРНК).

При исследовании молекулярной филогении рода Avena используются различные маркеры, такие как последовательности ITS1-гена 5.8S рРНК-ITS2 (Rodionov et al., 2005; Nikoloudakis et al. 2008; Nikoloudakis, Katsiotis 2008), интрона гена LEAFY (Peng et al., 2010), внешние транскрибируемые спейсеры (Rodrigues et al., 2017). Эти работы прояснили ряд родственных взаимоотношений между видами Avena с разными геномами: показано, что B и D субгеномы полиплоидов близко родственны A-субгеномам полиплоидов и А-геномам диплоидов, в то время как виды с C-геномами очень сильно отличаются от них (Rodionov et al., 2005; Nikoloudakis et al. 2008; Nikoloudakis, Katsiotis 2008, Badaeva et al., 2010).

Исследование происхождения полиплоидных видов овса путем сравнительного изучения полиморфных ДНК-маркеров пока не позволяет сделать однозначных выводов о системе рода. Так, Li et al. (2000) изучили встречаемость видоспецифичной стателлитной ДНК ASS49, 40 микросателлитов и 4 минисателлитов у диплоидов и полиплоидов для того, чтобы определить вид, который был диплоидным и тетраплоидным предком гексаплоидного овса. Это сравнение показало, что Ac геном диплоида A. canariensis является вероятным предковым геномом для А-субгеномов гексаплоидов скорее, чем A. strigosa, обычно рассматриваемая в этом качестве. Однако изучение других полиморфных маркеров дает другие результаты. Так паттерны AFLP диплоидов, тетраплоидов и гексаплоидных видов овса показывают, что не A. canariensis, а A. wiestii представляется более вероятным донором А-геномов гексаплоидов с геномной конституцией ACD (Fu and Williams, 2008). Вывод о том, что именно A. wiestii, был одним из доноров А-геномов для гексаплоидов A. sativa, A. occidentalis, A. sterilis и тетраплоида A. murphyi следует и из сравнения хлоропластных последовательностей trnL-F и ядерного гена Acc1 (Peng et al., 2010b; Yan et al., 2014).

Паттерны рестрикции хлоропластной и митохондриальной ДНК показали, что пластиды и митохондрии овса посевного и других гексаплоидных и тетраплоидных видов получены от А-геномных, а не от С-геномных предков. Поскольку пластидная и митохондриальная ДНК наследуется у злаков по материнской линии, это означает, что гексаплоидные виды овса получили материнский геном от какого-то А-геномного диплоида. Филогенетический анализ основанный на хлоропластном межгенном спейсере trnL-trnF psbA-trnH подтвердил, что некий А-геномный вид был предком гексаплоидных видов овса с материнской стороны (Nikolaudakis and Katsiotis, 2008; Peng et al., 2010b; Yan et al., 2016; Fu, 2018).

Донор С-генома полиплоидных видов овса также остается неизвестным. Основываясь на исследовании кариотипов, характерной морфологии, способности к межвидовому скрещиванию и возможной области возникновения гексаплоидных видов, Тибор Раджанти (Rajhathy, 1966) предположил, что A. ventricosa является наиболее вероятным донором С-субгенома гексаплоидных видов овса. Е. Бадаева и соавторы (Badaeva et al., 2010) пришли к такому же заключению исследуя С-бэндинг и картируя 35S и 5S рРНК гены у диплоидов и полиплоидов. При этом, Бадаева полагает, что гексаплоиды получили Cv геном A. ventricosa через тетраплоидный вид A. magna или A. insularis. С другой стороны, Ли с соавторами (Li et al., 2000), используя полиморфизм микросателлитов, показали, что A. eriantha (CpCp) является не менее вероятным донором С-генома для сложно-составного ACD генома гексаплоидов. Сравнение AFLP паттернов полиплоидных и диплоидных видов также показало, что Ср геном A. eriantha близок С-субгеному гексаплоидных видов овса (Fu, Williams, 2008). И, наконец, Пенг с соавт. (Peng et al., 2010) использовали второй интрон гена FLORICAULA/LEAFY показал, что С-геном диплоидного вида A. clauda (Сp) играл важную роль в происхождении как С- так и D-геномов полиплоидных видов овса. Таким образом, на сегодняшний день, все три дикорастущих диплоидных вида с С-геномами едва ли не с равной вероятностью могут рассматриваться как возможные предки С-субгенома полиплоидов.

В настоящее время требуется расширить круг источников и доноров ценных признаков и более эффективно использовать все имеющееся мировое разнообразие культурного и дикого овса. Прогресс в достижении этой цели становится все более важным, учитывая признаки утраты генетического разнообразия овса в различных регионах мира (Baohong et al., 2003; Fu et al., 2003; Achleitner et al., 2008), и проявление «генетической эрозии» у современных селекционных сортов. Недостаточное финансирование, выделяемое на проведение молекулярно-генетических работ по овсу по сравнению с другими зерновыми культурами, означает, что в познании генома овса остаются большие пробелы. Все это приводит к тому, что многие аспекты морфологии и строения репродуктивных органов, важных для селекции и производства, у овса еще предстоит генетически охарактеризовать и, кроме того, существует постоянная потребность для различных регионов мира в идентификации аллелей генов, придающих сортам устойчивость к важнейшим грибным заболеваниям (Winkler et al., 2016).

В значительной степени остаются невостребованными и недостаточно изученными в плане их генетического потенциала староместные популяции, сохраняемые в коллекции ВИР на протяжении длительного времени, и многие селекционные сорта овса. Наш проект предполагает комплексный подход к определению генетического разнообразия, выделению новых доноров и изучению процессов эволюции на видовом и внутривидовом уровне с использованием уникальных коллекционных материалов и самых современных методов исследования.

Ячмень (Hordeum vulgare L.) – одна из первых однолетних одомашненных культур длинного дня, получившая широкое географическое распространение в обитаемом человеком мире. Как объект генетических исследований ячмень характеризуется рядом биологических преимуществ: диплоидной природой и небольшим числом относительно крупных хромосом, почти клейстогамным типом опыления и легкостью гибридизации. Дикорастущие виды рода Hordeum (их около 33 видов - Bothmer et al. 1995) обладают рядом ценных признаков, таких как устойчивость к биотическим и абиотическим стрессовым факторам, в связи с чем их использование в интрогрессивной гибридизации представляет интерес для расширения генетического разнообразия культурного ячменя. При этом вопрос о том, имели ли место такие акты межвидовой гомоплоидной гибридизации при образовании староместных сортов остается открытым.

В зависимости от возможности использования в селекции культурного ячменя генофонда сортов и дикорастущих видов рода последние подразделяют на три генетических пула: первичный (селекционные сорта, староместные сорта, дикорастущие подвиды, такие как H. vulgare ssp. spontaneum, которые свободно скрещиваются с культурным ячменем, дают плодовитое потомство), вторичный (H. bulbosum L.) и третичный (все остальные виды Hordeum) генный пул (Bothmer et al., 1992).

Важность и перспективность межвидовых гибридизаций в селекции Hordeum для расширения генетического потенциала культуры очевидна. Так гены эффективной устойчивости к мучнистой росе выявлены у образцов H. spontaneum K. Koch. Ячмень луковичный имеет ряд ценных признаков, таких как устойчивость к мучнистой росе, стеблевой и листовой ржавчине, которые могут быть интродуцированы при гибридизации этих видов (Jones, Pickering, 1978). В ряде исследований на основе гибридов H. vulgare c H. bulbosum были получены формы H. vulgare с интрогрессией генетического материала H. bulbosum (Pickering, 1988; Pickering et al., 2000; Jonson, Pickering, 2002). Среди интрогрессивных форм выявлены формы, устойчивые к BaMMV, BaYMV, BYDV вирусам, идентифицированы новые гены устойчивости (Michel, 1996; Ruge, et al,2003; Ruge-Wehling et al., 2006; Scholz et al., 2009).

Почти половина видов рода Hordeum - полиплоиды (тетра и гексаплоиды). По этой причине род Hordeum - хорошая модель для изучения видообразования, идущего через полиплоидизацию. С другой стороны, корректно определить происхождение аллополиплоидных видов ячменя – сложная, ранее, в догеномную эру, трудноразрешимая задача. Не случайно, даже через 50 лет исследования видовых отношений в роде Hordeum, филогения рода до сих пор предмет дискуссий (Brassac et al., 2015; Blattner, 2018). большинство филогенетических исследований, опубликованых на сегодняшний день, были направлены на разрешение отношений только нескольких полиплоидных видов рода (Salomon, Bothmer, 1998; Petersen, Seberg, 2004; Taketa et al., 2009; Brassac et al., 2015; Blattner, 2018).

Староместные сорта, ячменя собранные в экспедициях Н.И. Вавилова и П.М. Жуковского, изучали в 30- 60е годы ХХ столетия. В настоящее время к ним возрос интерес в связи с выявлением новых источников селекционно важных признаков в условиях изменяющегося климата. Местные образцы изучали на чувствительность к фотопериоду, устойчивость к сетчатой пятнистости, устойчивость к мучнистой росе. Однако, все эти исследования фрагментарны.

Ячмень является одной из культур для которой секвенирован геном (The International Barley Genome Sequencing Consortium, 2012). Это стало хорошей основой для поиска молекулярных маркеров, идентификации генов и изучении механизмов их взаимодействия. Так, исследование 265 образцов из Дагестана в условиях короткого и длинного дня, а также проведенная идентификация аллелей генов Ppd-H1 и Ppd-H2 показала, что большинство образцов – носители доминантного аллеля Ppd-H2, который обеспечивает раннее развитие в условиях короткого дня. Выращивание образцов в непривычных для них условиях длинного дня приводило к задержке цветения (Абдуллаев и др., 2017). Сведения о взаимодействии генов, относящихся к системам Vrn, Ppd и Eam, и об аллельных вариантах этих генов, по-разному влияющих на сроки перехода от вегетативной стадии к генеративной, используются в изучении генетических ресурсов растений и в практической селекции (Абдуллаев и др., 2013; Алабушев и др., 2015, 2019; Донцова и др., 2016; Zlotina et al., 2013).

Использование методов секвенирования нового поколения позволяет выявлять минорные изменения нуклеотидной последовательности генома. Картирование с помощью секвенирования, которое сочетает в себе генетическое картирование с целевым ресеквенированием, было использовано для определения полиморфизмов потенциальных генов ячменя (Pankin et al., 2014). Еще одной задачей, решение которой зависит от знания геномных последовательностей, является сравнительный анализ геномов растений при установлении основных закономерностей происхождения различных видов растений и сельскохозяйственных культур (Avni et al., 2017). Изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов NGS пока не проводилось.

Род Aegilops, включающий 27 диплоидных, тетраплоидных и гексаплоидных видов – важный источник новых ценных аллелей генов для селекционного улучшения пшеницы. Среди видов Aegilops особое место занимает вид Ae. tauschii – наиболее вероятный донор генома D мягкой пшеницы. Вид этот полиморфен по морфологическим и физиологическим признакам, и занимает в природе широкий ареал от Причерноморья до отрогов Тянь-Шаня. В виде принято выделять два подвида – subsp. eusquarrosa и strangulate. В генетических коллекциях собраны и хранятся сотни образцов Ae. tauschii, который с 1980-х годов активно используется для обогащения генофонда пшеницы. В коллекции ВИР более 600 образцов этого вида. Наши предварительные результаты показывают, что в конструировании гексаплоидного генома T. aestivum принимали участие Ae. tauschii разного происхождения.

Значение гибридизации Ae. tauschii и Ae. umbellulata и Triticum для целей селекции ясно видно из следующего примера. Ранее была показана крайняя узость генетического разнообразия образцов мягкой пшеницы по эффективной ювенильной устойчивости к вредоносным грибным болезням – листовой ржавчине (возбудитель Puccinia recondita), септориозу (Stagonospora nodorum), темно-бурой листовой пятнистости (Bipolaris sorokiniana). Среди образцов Ae. tauschii из коллекции ВИР были выделены устойчивые ко всем 3-м болезням, а среди Ae. umbellulata – высокоустойчивые к листовой ржавчине. Наличие известных эффективных генов резистентности к ржавчине Lr9 и Lr41 изучали с помощью фитопатологического теста и ДНК-маркирования. Выявлены образцы эгилопсов, защищенные данными генами резистентности. У короткостебельных форм проведено ДНК-маркирование генов Rht2 и Rht8. В результате работы выделены образцы эгилопсов, перспективные для интрогрессивной гибридизации с мягкой пшеницей (Колесова и др., 2019).

Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта. Материал для исследования

Материалом для нашего исследования будет набор образцов староместных сортов и диких видов из уникальной мировой коллекции культурных и выделенных из природы видов ВИР имени Н.И. Вавилова (Санкт-Петербург), овсов (куратор И.Г. Лоскутов – участник проекта), эгиловсов (куратор Н.И. Чикида – участник проекта) и ячменей (куратор О.В, Ковалева – участник проекта), и коллекция гербарных образцов дикорастущих Avena, Hordeum, Aegilops, собранных нами во время экспедиций 2003-2019 г. в Алтай, Алтайский край, Туву и Хакассию, а также коллекции отдела гербарий БИН РАН (LE). Коллекции достаточно полно отражают спектр всего внутри- и межвидового разнообразия исследуемых родов, включая исторический материал по староместным сортам.

Все работы по размножению семенного материала, фенотипированию и выделению источников и доноров по широкому кругу морфологических, хозяйственно ценных признаков и устойчивости к абиотическим стрессам (эдафический стресс) будут проведены в полевых условиях Пушкинских и Павловских лабораторий ВИР с использованием стандартных методических указаний по изучению мировой коллекции овса (Лоскутов и др., 2012).

В работе будут использованы стандартные методы выделения ДНК, ПЦР-амплификации и секвенирования ITS-последовательностей и хлоропластных маркеров по Cэнгеру на секвенаторе Applied Biosystems 3130 ЦКП БИН РАН «Клеточные и молекулярные технологии изучения растений и грибов» и секвенирование нового поколения на платформе Illumina на секвенаторе ЦКП СПбГУ.

Способ изучения происхождения полиплоидов на основании исследования полиморфизма ITS-последовательностей был предложен нами (Пунина и др., 2012, 2017) и в дальнейшем усовершенствован (Rodionov et al., 2019; Беляков и др., 2019). В цитируемых работах Пуниной и соавт (2012, 2017), мы использовали интересную особенность геномов пионов – у них отсутствует или замедлен процесс изогенизации рДНК и при секвенировании по Сэнгеру в позициях, по которым ITS-последовательности родительских видов различаются, видны оба варианта нуклеотидов, благодаря чему можно реконструировать ITS-последовательность обоих предков, что позволяет верифицировать гипотезы о происхождении видов и культиваров.

В данной работе для выявления полученных аллополиплоидами от родительских видов вариантов ITS мы будем использовать локус-специфичное (targeted sequencing) секвенирование района ITS1 и фрагментов гена 18S и 5.8S рРНК на секвенаторе Illumina MiSeq с набором реагентов MiSeq® v3 (600 циклов) в соответствии с инструкциями производителя (Illumina Inc., США). При этом за одну реакцию можно прочесть примерно 10-20 тыс. копий ITS1 и соседних районов исследуемого генома (около 300-400 п.н.) и, таким образом, выявить внутригеномный полиморфизм этих последовательностей. Метод относительно новый, но несколько раз использовался при изучении внутригеномного полиморфизма рДНК (Matyasek et al., 2012; Kim et al., 2017; Rodionov et al., 2019; Гнутиков и др., 2019). Мы используем его для анализа происхождения субгеномов полиплоидных видов Avena. Triticum, внутригеномного полиморфизма рДНК Hordeum. Ранее нами показано, что у 4 предварительно исследованных полиплоидных видов Avena в геноме от общего числа генов 35S рРНК сохраняется 2-3% генов, происходящих от диплоидных видов с С-геномами (Rodionov et al., 2019; Родионов и др., 2020 – статья выйдет в журнале «Генетика» в №4) и при исследовании межвидовых гибридов у водного растения Sparganium (Беляков и др., 2019).

Первичные данные NGS будут обработаны при помощи стандартных инструментов: программ FastQC [National Center for Biotechnology Information. GenBank Overview. Available from: https://www.ncbi.nlm. nih.gov/genbank/], Trimmomatic [Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics.2014;30(15):2114-2120] и Fastq-join [Aronesty E. Сomparison of sequencing utility program. Open Bioinformatics J. 2013;7:1-8]. Дальнейшая фильтрация данных более сложна, поскольку анализ SNP-ов в данном случае проводится на основе безреференсного выравнивания. Алгоритм действий следующий: 1) консенсусная фильтрация (исключение из анализа заведомо не выравниваемых вариантов – очевидных контаминантов); 2) с использованием программы COUNT (создана участником проекта Э.М. Мачсом) рассчитывалась частота каждого варианта последовательности в выборке – одинаковые гаплотипы представлены в дальнейшем анализе одной последовательностью с индексом – частота повторяемости). Для подсчета частот и сортировки гаплотипов будут использованы алгоритмы попарного сравнения и пузырьковой сортировки. 3) Далее используем программное обеспечение UGENE [Okonechnikov K. et al. Unipro UGENE: a unified bioinformatics toolkit // Bioinformatics. 2012. V. 28. P. 1166-1167. doi:10.1093/bioinformatics/bts091 5.], MEGA7 [Kumar S. et al. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets // Molec. Biol. Evol. 2016. V. 33. P. 1870-1874. doi: 10.1093/molbev/msw054] и MEGA X [Kumar S. et al. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms // Molec. Biol. Evol. 2018. V. 35. P.1547-1549.doi: 10.1093/molbev/msw054]. Cравнированные вырианты ITS будут сравниваться с секвенированными по Сэнгеру ITS-последовательностями дикорастущих видов.

Для получения независимых данных по разным родительским линиям будут проанализированы и хлоропластные последовательности, прежде всего trnL-trnF, хорошо зарекомендовавшие себя при ДНК-штрихкодировании (Шнеер, Родионов, 2018).

Филогенетический анализ полученных последовательностей будет проводиться с использованием алгоритмов «объединение ближайших соседей» (NJ), программы MrBayes.

При необходимости, будет проведен цитогенетический анализ диплоидных и полиплоидных видов родов Avena, Hordeum, Aegilops (существенно при работе с образцами, выделенными из природы). При этом будут использоваться стандартные методы приготовления хромосомных препаратов и окрашивания их флуорохромами DAPI и CMA (Пунина и др., 2000).

Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту.

Участниками проекта изучались закономерности эволюции внутренних транскрибируемых спейсеров и хлоропластных ДНК у злаков триб Poeae, Aveneae, Meliceae, Phleeae, Brylkiniae, Phalaridea, а также эволюция хромосомных комплексов злаков (обзоры: Родионов и др., 2013, 2015, 2016, 2019) и растений сем. Trilliaceae (Пунина и др., 2005). Развернуты работы по молекулярно-филогенетическому исследованию злаков, триллиевых, молочаев, пионов, таксономически сложных родов Sparganium, Silene и Iris флоры России. В лаборатории биосистематики и цитологии БИН РАН впервые секвенированы ITS-последовательности и гены 5.8S рРНК всех видов такого важного с генетической и научно-практической точки зрения рода злаков как Avena (Родионов и др., 2005; Тюпа и др., 2009; Rodionov et al., 2016), секвенированы ITS более сотни видов из круга родства двухромосомных злаков Zingeria и Colpodium (Родионов и др., 2008; Ким и др., 2010, Nosov et al., в редакции на рецензии), что впервые позволило показать, что кариотип этих двух этих уникальных по хромосомным наборам злаков, традиционно относимых к разным трибам, возник недавно и однократно. Нами впервые секвенированы и проанализированы ITS и гены 5.8S рРНК около 100 видов Poa, многие из которых представляют собой аллополиплоиды, и покащано, какие из современных диплоидов участвовали в формировании аллополиплоидных Poa (Носов, Родионов, 2008; Родионов и др., 2010, 2016; Носов и др., 2015). Нами впервые секвенированы и проанализированы ядерные и некоторые хлоропластные последовательности таких уникальных родов и видов, как Colpodium, Paracolpodium, Catabrosella, Anthoxantum, Zingeria, Glyceria и многих других. Эти данные помещены в международные банки данных и активно используются другими исследователями, занимающимися проблемами молекулярной таксономии Злаков. Все это позволило предложить гипотезу о путях эволюции кариотипа овсов на ранних этапах дивергенции видов этого рода (Родионов и др., 2005) и путях эволюции хромосом в семействе Здаки в целом (Родионов и др., 2013). Нами впервые, путем сравнительного анализа ядерных и хлоропластных генов с использованием методов молекулярной филогении, реконструированы филогенетические деревья, показывающие наиболее вероятные пути дивергенции видов трибы Phalarideae и положение родов Anthoxanthum, Hierochloё, Phalaris (Райко и др., 2008; Райко, Родионов, 2011) и родов Glyceria, Melica, Pleuropogon и Schizachne (триба Meliceae)(Rodionov et al., 2013, 2016) в системе злаков.

Некоторые из проведенных в лаборатории исследований касались происхождения гибридогенных видов и особенностей организации гибридогенных геномов. Так, исследуя эволюцию кариотипов в сем. Trilliaceae (Пунина и др., 2005 и др.), мы показали, что по паттерну дифференциальной исчерченности рисунок дифференциальной исчерченности хромосом у Trillium tschonoskii рисунок гетерохроматиновых сегментов гораздо более сходен с патерном представителей рода Paris, чем Trillium. В то время как для триллиумов T. camschatcense, T. erectum, T. grandiflorum и T. recurvatum характерны крупные блоки только АТ-богатого гетерохроматина, выявляемые при флуорохромировании хромосом, дифференциальное Q-окрашивание хромосом T. tschonoskii выявляет почти исключительно мелкие точечные AT-обогащенные блоки. В целом, их рисунок гораздо более сходен с патерном гетерохроматиновых районов хромосом у представителей рода Paris, чем у Trillium. Последовательности ITS1 и ITS2 этого вида, секвенированные нами (исследовалась геномная ДНК T. tschonoskii, собранного на Сахалине), по многим позициям также отличались от консенсусной последовательности, характерной для рода Trillium, но при этом имела все родоспецифические инсерции и делеции (индели) и однонуклеотидные замены, характерные для секвенированных нами видов рода Paris. Между тем, если судить по морфологии и последовательностям хлоропластного гена matK (Farmer, Schilling, 2002), T. tschonoskii - типичный представитель подрода Trillium рода Trillium, близкий T. camschatcense. Учитывая, что T. tschonoskii аллотетраплоид, и то, что по данным как морфологии так и секвенирования последовательностей гена хлоропластного генома matK этот вид близок к диплоидному T. camschatcense, можно предположить, что дальневосточный тетраплоидный вид T. tschonoskii - древний межродовой гибрид, в формировании которого участвовали пока неизвестные (а возможно, уже не существующие) виды Paris и Trillium, причем материнским растением в этой гибридизации был Trillium (Пунина и др., 2005).

В роде Avena известно около 25 диплоидных, тетраполоидных и гексаплоидных видов с геномами А, С, B и D (B и D – это варианты генома А). Проведенное обычным способом секвенирование ITS последовательностей диплоидных и полиплоидных видов Avena показало, что по ITS геномы A, B и D неотличимы друг от друга, но определенно отличаются от геномов типа С. При этом у полиплоидов обнаруживались только ITS геномов типа A(B,D) (Родионов и др., 2005; Nikoloudakis et al., 2008), что согласуется с результатами цитогенетических исследований Е.Д. Бадаевой и соавт. – FISH показывает, что С-субгеномы полиплоидных видов овсов потеряли большую часть рДНК, на них удается выявить только слабые 35S рДНК-позитивные сигналы (Шелухина и др. 2007, 2008; Badaeva et al., 2010). Для того, чтобы выяснить, какой из диплоидных видов мог стать потенциальным донором генома С у полиплоидных видов рода Avena, мы (Тюпа, 2006; Тюпа и др., 2009) разработали специальную систему геномспецифичных праймеров, позволяющую выявлять в геномах полиплоидов даже минорные количества С-геномной рДНК. Это позволило впервые определить, что наиболее вероятным предком, передавшим тетраплоидам A. magna, A. murphyi и A. fatua и гексаплоидам A. sativa и A. occidentalis субгеном С был вид A. ventricosa. Наши выводы согласуются с результатами работы греческих авторов (Nikoloudakis, Katsiotis, 2008), полученными независимо, с использованием других геном-специфичных праймеров, но разработанные нами праймеры более удобны и более информативны, так как в большей степени специфичны для С-генома (захватывают делецию, по которой геномы А и С различаются) и, кроме того, они позволяют амплифицировать большие по размеру фрагменты рДНК.

Нами исследованы также происхождение полиплоидных геномов в роде Poa (Родионов и др., 2010), роде Sparganium (Беляков и др., 2019), роде xTrisetokoeleria (Гнутиков и др., 2029), роде Elymus (Rodionov et al., 2019), в трибах Meliceae (Rodionov et al., 2013), и Phalarideae (Райко и соавт. 2008, 2011 и др.) и, в частности, показано, что виды, ранее относимые к подроду Arctopoa рода Poa (Цвелев, 1976), в действительности не только составляют особый род, а не подрод Poa, но и род, относящийся к другой филогенетической ветви (Родионов и др., 2010), чем Poa; что триба Phalarideae определенно гетерогенна и может быть разделена на 2 независимые филогенетические Anthoxanthum+Hierochloe+Ataxia и отдельную ветвь Phalaris+Phalaroides (Райко и др., 2011). Триба Meliceae, напротив, монофилетична, но в ее состав, по-видимому, может быть включена монотипная триба Брылкиниевых (Rodionov et al., 2013).

Изучая ITS-последовательности видов рода Paeonia, мы подтвердили наблюдение Санга (Sang et al., 1995), что у пионов по каким-то причинам не идут процессы изогенизациии рДНК, что позволяет использовать полиморфные сайиы в ITS-последовательностях для определения родительских видов у природных аллополиплоидов (Пунина и др., 2012) и у сортов садовых гибридов (Пунина и др., 2017). В последовательностях рДНК транскрибируемых спейсеров ITS1 и ITS2 регулярно выявляются «двойные пики», свидетельствующие о присутствии значимого количества сразу двух нуклеотидов в данной позиции. В частности, нами было показано, что кавказский нотовид P. x majkoae Ketzch. является межвидовым гибридом между P. tenuifolia L. и P. caucasica (Schipcz.) Schipcz. и не тождественен западно-сибирскому виду P. intermedia C. A. Mey (=P. hybrida Pall.), как полагали китайские исследователи (Hong, Zhou, 2003). Анализ распределения PS на участке ITS1-5.8S рДНК-ITS2 у предполагаемого спонтанного садового гибрида между P. tenuifolia и P. anomala L. подтвердил гипотезу о его происхождении. Исследуя PS у культивара «Ballerina», - гибрида, полученного в 1941 г. в результате скрещивания P. lactiflora и P. wittmanianna Stev. (Успенская , 2003) мы также подтвердили его происхождение (Пунина и др., 2012).

В лаборатории давно применяются методы исследования кариотипов и дифференциального окрашивания хромосом нуклеотид-специфичными флуорохромами, окрвшивание хромосом по С-методу, методы ПЦР-амплификации ДНК со случайных и геноспецифичных праймеров. В лаборатории впервые был разработан метод холодового дифференциального окрашивания эухроматиновых сегментов хромосом растений (Раскина, Родионов, 1992) и изучены механизмы получения CPD - исчерченности хромосом растений (Ким и др., 2002). При участии сотрудников лаборатории разработаны оpигинальные компьютерные программы хромосомного анализа и анализа электрофореграмм, позволяющие строить в интерактивном режиме денситограммы плотностей по длине хромосомы и получать каpты хpомосом высокого pазpешения, а также анализировать электрофореграммы (Пунина и др., 1994; Muravenko et al., 1998; Пичугин и др., 2001 и др.). Кроме того, сотрудниками лаборатории давно проводятся исследования структуры кариотипов широкого круга растений рутинными методами (см. обзоры: Almeida et al., (2006) Index of Plant Chromosome Numbers 2000-2003”; Applequest et al. (2010) Index of Plant Chromosome Numbers 2004-2006; Punina et al., 2015; Gnutikov et al., 2016-2019; Гнутиков и др., 2017 и др.).

Участниками проекта из ВИРа разработана уточненная система рода Avena L. и дано описание ключей для определения видов. На основе анализа данных по культурным и диким видам овса подтверждено установление их центров происхождения и разнообразия. Проведение изучения и анализа географического распространения ареалов видов, морфологических и селекционно ценных признаков позволило расширить представления о потенциальных возможностях отдельных видов и всего рода в целом. Выявлена возможность увеличения генетического разнообразия посевного овса за счет расширения его генетической основы при использовании в селекции малораспространенных и диких видов, обладающих селекционно ценными признаками (Лоскутов, 2007; Loskutov, Rines, 2011).

В совместных исследованиях ВИР и БИН РАН в течение многих лет исследуются разные стороны эволюции аллополиплоидных геномов овса. Для того, чтобы выяснить, какой из диплоидных видов мог стать потенциальным донором генома С у полиплоидных видов рода Avena были разработаны геномспецифичные праймеры (Тюпа, 2006; Тюпа и др., 2009), позволяющие выявлять в геномах полиплоидов даже минорные количества С-геномной рДНК.

Одна из работ была посвящена исследованию ранних этапов эволюции кариотипов видов рода Avena (Родионов и др., 2005). В этой работе впервые было показано, что у всех полиплоидных видов Avena, кроме эндемика Атласских гор A. macrostachya, при секвенировании по Сэнгеру выявляются только ITS-последовательности А-субгеномов. На основании анализа ITS-последовательностей, были построены филогенетические гипотезы, отражающие дивергенцию видов рода Avena. На основании этих схем нами была разработана модель эволюции кариотипов овса: предок Avena имел диплоидный хромосомный набор с "симметричными" хромосомами, похожими в этом отношении на хромосомные наборы (Cm) A. macrostachya и кариотипы диплоидных видов овса с геномом А. Далее произошло разделение филогенетических линий Avena с геномами А и С, сопровождавшееся накоплением различий по рассеянным повторам (определяющим результаты GISH-гибридизации) и накоплением специфичных для каждой филогенетической ветви транзиций и трансверсий в ITS. Затем в линии С-геномов произошло разделение филогенетических ветвей предка A. macrostachya и предка других видов с геномами С, после чего у предка A. macrostachya произошло удвоение хромосомного набора и появились крупные блоки С-гетерохроматина в прицентромерных районах хромосом, а у предка других видов с геномом С (A. clauda, A. pilisa и A.ventricosa) имели место хромосомные перестройки, изменившие положение центромеров. "Десимметризация" хромосом у предка A. clauda, A. pilisa и A. ventricosa сопровождалась уменьшением размеров и нуклеотидного состава АТ- и ГЦ-богатых прителомерных и прицентромерных блоков гетерохроматина и появлением множественных небольших интерстициальных блоков С-гетерохроматина, не выявляемых нуклеотид-специфичными красителями. У видов овса с геномами А мог происходить противоположный процесс − увеличение размера прителомерных и прицентромерных сегментов гетерохроматина. С помощью новейших методов пиросеквенирования («4-5-4 Life Sciences») был получен пул последовательностей ITS1 у полиплоидных видов овса Avena magna, A. murphyi, A. sativa, A. occidentalis, A. fatua. По ITS геномы A, B, D значимо не отличаются друг от друга, в то время как геном C определенно иного происхождения. По результатам NGS секвенирования ITS-последовательности генома C обнаружены в минорном количестве, всего 1 - 3% от общего числа сиквенсов. Полиплоидные овсы оказались наиболее близкими к диплоиду A. ventricosa, но, что неожиданно, C-геном был близок не только к этому виду, но также и к очень отличающемуся от него по морфологическим признакам многолетнику A. macrostachya (Rodionov et al., 2016).

Кроме того, внутривидовое разнообразие овса изучалось с использованием белковых маркеров по спектрам запасных белков (авенинов). Было установлено, что коллекция староместных сортов посевного овса, собранная и поддерживаемая в ВИРе, обладает значительным генетическим полиморфизмом, выявляемым по спектрам авенина. Наличие такого полиморфизма подтверждает высокий уровень генетического разнообразия староместных сортов овса и свидетельствует в пользу перспективности использования спектра авенина для идентификации биотипов овса (Зеленская и др., 2004). Дальнейшие исследования подтвердили, что электрофоретические спектры авенина могут служить инструментом генетического разнообразия образцов и для анализа генетической стабильности коллекции овса в ходе их репродукции. На основании полученных данных был составлен каталог белковых формул и компьютерная база данных, которые могут быть использованы для более тщательного подбора генетического материала для целей селекции (Лоскутов, 2008; Перчук и др., 2016).

Участники проекта проводят комплексное полевое и лабораторное изучение генетических ресурсов овса с целью раскрытия потенциала наследственной изменчивости образцов коллекции для рационального использования их генетического, адаптивного и хозяйственного потенциалов в селекции, производстве продовольствия и ведении сельского хозяйства (Лоскутов, 2007; Лоскутов и др., 2016; Loskutov, 2014). Селекционерам страны переданы выделенные доноры устойчивости к полеганию и 11 созданных доноров с идентифицированными генами (Dw) короткостебельности (Лоскутов, 2006). Совместно создано 5 сортов голозерного, 4 сорта пленчатого овса и один сорт ячменя, получен один патент на изобретение и 6 патентов на селекционные достижения (http://gossort.com/).

При изучении всего видового разнообразия рода Avena L. из коллекции ВИР по комплексу хозяйственно ценных признаков, устойчивости к абиотическим и биотическим стрессорам и содержанию качественных параметров зерна были выявлены генотипы, расширяющие их генетическую основу культурных видов, перспективные для селекции высокоурожайных сортов овса, пригодных для производства продуктов, рекомендованных для здорового функционального питания (Лоскутов, 2007). Среди селекционных линий из ведущих селекцентров России были выделены линии с минимальным содержание ДНК грибов Fusarium и микотоксинов в зерновке. Впервые в мире была проведена оценка широкого разнообразия диких видов Avena по устойчивости к заражению Fusarium и накоплению фузариотоксинов (Лоскутов и др., 2016; Gagkaeva et al., 2017).

При проведении биохимического анализа по содержанию белка и масла в зерновке выделялись голозерные сорта овса. Кроме того, повышенное содержание этих показателей было связано между собой и с заражением зерна фузариозом. По жирнокислотному составу выделены генотипы с высоким содержанием незаменимых жирных кислот – олеиновой (более 45%), ленолевой (более 40%) и леноленовой (более 2%). Отмечается, что, в большинстве случае, у образцов диких видов эти показатели были выше (Конарев и др., 2015).

Метаболомный анализ селекционных сортов овса и образцов диких видов позволил идентифицировать метаболиты, содержание которых меняется в процессе «окультуривания» или по которым образцы диких видов отличаются от сортов овса. Установлены достоверные корреляции между изученными показателями качества зерновки и устойчивостью к фузариозу и накоплению микотоксинов. Выявлено, что повышенное содержание сахарозы и фруктозы А имело обратную связь с поражением зерна фузариозом и накоплением микотоксинов. Анализ пленчатых и голозерных сортов овса показали, что голозерные сорта имели большие суммарные показатели по органическим, жирным и аминокислотам, стеролам, дисахарам и общим сахарам, а пленчатые сорта имели повышенные показатели только по моноацилглицеролам, азотисным основаниям, многоатомным спиртам и моносахарам (Лоскутов и др., 2016).

В результате анализа микроэлементного состава образцов овса установлено, что между концентрацией изученных микроэлементов и накоплением отдельных жирных кислот в масле, а также заражением фузариозом и накоплением микотоксинов в зерновках были найдены достоверные корреляции (Bityutskii et al., 2017; Bityutskii et al., 2019).

Таким образом, исследовательский коллектив полностью обладает необходимым опытом и навыками для изучения всего видового и внутривидового разнообразия рода Avena на уровне, отвечающем мировым стандартам.

Имеющаяся в ВИР генетическая коллекция Aegilops изучена всеми известными методами, в том числе и с использованием ДНК технологий. Однако внутривидовой полиморфизм рДНК в линиях пшениц и вклад в это разных линий Aegilops не выполнялся никогда. По нашим предварительным данным, с помощью этого подхода нам удастся показать наличие в составе Ae. tauschii ssp.strangulsta двух линий, разделить известный подвид и четко диагностировать морфологические признаки каждой линии, дав им «паспорт» по белковым маркерам (глиадинам) и по ДНК.

Детальный план работы на первый год выполнения проекта.

В 2020 нами будет изучен внутригеномный полиморфизм рДНК 10-15 староместных сортов овса и 10-15 староместных сортов ячменя и рДНК малоизученных диких видов овса и ячменя, которые, вполне возможно, участвовали в актах гибридизации, приведших к появлению гексаплоидных и тетраплоидных видов культурного овса. Методами секвенирования нового поколения (NGS) будет выявлен внутригеносный полиморфизм рДНК изучаемых сортов и видов, определена система риботипов и их наиболее вероятное происхождение. Будут сделаны выводы о случаях гибридизации между видами в роде Avena, приведших к формированию полиплоидов и решен вопрос, сохранились ли следы межвидовых гибриизаций (если они были) в геномах староместных сортов ячменя. Это позволит выявить филогенетические связи и установить границы между отдельными компонентами сложной таксономической системы родов Avena и Hordeum. Для культурных видов овса и, возможно, ячменя, будут выявлены предковые таксоны среди диких видов, в дальнейшем будет прояснен таксономический статус редких и критических видов (A. aemulans, A. volgensis, A. septentrionalis, A. intermedia и, возможно, др.). Наиболее интересные из староместных сортов овсов и ячменя в рамках данного проекта, будут впервые охарактеризованы с помощью усовершенствованной на основе NGS технологии ДНК-штрихкодирования (генетическая паспортизация). Впервые таким образом будут изучены староместные сорта ячменя, собранные Н.И. Вавиловым и П. М. Жуковским. Это может дать возможность выделить в составе генетической коллекции ВИР новые источники аллелей и доноры хозяйственно ценных признаков, адаптивности и устойчивости к биотическим стрессам, способные расширить генетическую основу культурного ячменя. Следует отметить, что изучение видового и внутривидового генетического разнообразия ячменя для селекционных целей с использованием методов выделения полимеразной цепной реакции и NGS секвенирования ранее не проводилось.

Будет проведено сравнительное морфологическое исследование 674 коллекционных образцов Ae. tauschii, отобрано 12 наиболее перспективных для изучения вклада их геномов в гексаплоидные геномы разных сортов мягкой пшеницы. По нашим предварительным данным эти эксперименты позволят доказать, что есть все основания считать, что Aegilops tauschii ssp.strangulsta гетерогенен с морфологической и молекулярно-генетической точек зрения, что в его составе есть четко отличающаяся уникальную форма, которую по комплексу признаков и ботанических и молекулярно -генетических участники проекта предполают отнести к новому подвиду.


Layman's description

В условиях интенсивного земледелия становится актуальной задача сохранения имеющегося и дальнейшее расширение биологического и, что особенно важно, генетического разнообразия культурных растений. Для современного земледелия характерно увлечение небольшим числом высокопродуктивных сортов, что ведет к «генетической эрозии», к обеднению разнообразия генов в генофонде сельхозкультур. Выход из кризиса видится в поиске новых генов в геномах диких видов, находящихся в природе, и поиске новых генов в староместных сортах, созраняемых в генетических коллекциях. Наше сравнительное исследование геномов староместных сортов и диких видов овсов, ячменей и эгилопсов, которые скрещиваются с культурными сортами, даст важную информацию для новых работ по селекции, поскольку использование дикорастущих видов сельскохозяйственных культур наряду с раскрытием геномного разнообразия сортов народной и промышленной селекции является наиболее перспективным направлением для борьбы с генной эрозией.
Направление нашего проекта полностью совпадает с научным направлением Стратегии НТР РФ, так как он нацелен на создание новых высокопродуктивных, высоко адаптивных и устойчивых к абиотическим факторам сортам культурных растений.

Key findings for the stage (in detail)

1. ГЕНОМНАЯ КОНСТИТУЦИЯ ДИПЛОИДНЫХ ВИДОВ РОДА AVENA L. С A-ГЕНОМОМ ПО ДАННЫМ СЕКВЕНИРОВАНИЯ СЛЕДУЮЩЕГО ПОКОЛЕНИЯ (NGS). ОПИСАНИЕ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Сравнительный анализ морфологии митотических хромосом видов в роде Avena L. показал, что диплоидные виды овса могут иметь геномы А или С-типа, при этом было предложено различать пять вариантов А-генома. Варианты генома А отличаются друг от друга по числу акроцентрических хромосом. Геномы A. canariensis B. R. Baum, Rajhathy et D. R. Sampson (Ac), A. damascena Rajhathy et B. R. Baum (Ad), A. longiglumis Durieu (Al), и A. prostrata Ladiz. (Ap), – видоспецифичны, в то время как разновидность генома As встречается у нескольких диплоидных видов: A. atlantica B. R. Baum et Fedak, A. hirtula Lag., A. strigosa Schreb., A. wiestii Steud. (Loskutov, Rines, 2011). Виды с разными вариантами А-генома не скрещиваются, гибриды их могут быть получены, однако они полностью или почти полностью стерильны, в то же время виды с геномом As в эксперименте скрещиваются и дают фертильное потомство (Лоскутов, 2001). Диплоидные овсы с A-геномом – это преимущественно средиземноморские и ближневосточные растения, как правило, сорные и сорно-рудеральные.
Мы исследовали внутригеномный полиморфизм рДНК у диплоидных овсов с A-геномами, а также у культурного гексаплоида A. sativa var. aurea Korn. A. sativa (Овес посевной) – широко культивируется в качестве кормового и пищевого растения. Овес посевной дает один из лучших концентрированных кормов для скота, а зеленый корм и сено из овса, которые обычно используют в смеси с бобовыми культурами, имеют большое значение в животноводстве.
Сравнительный анализ морфологии митотических хромосом диплоидных и полиплоидных видов Avena показал, что диплоидные виды овсов могут иметь геномы А или С-типа, при этом было предложено различать два варианта С-геномов, Сv и Cp, и пять вариантов А-геномов (As, Ap, Al, Ad, Ac). Варианты геномов А различаются по числу акроцентрических хромосом. Признак, который отличает Ср- геном от Cv−генома − это количество спутничных хромосом: в геномах Ср две спутничные хромосомы, с большим и малым спутником, в Cv − одна пара хромосом с малым спутником (Rajhathy, Thomas, 1974).
Диплоидные виды с разными геномами не скрещиваются, гибриды между разными вариантами А генома могут быть получены, однако они полностью или почти полностью стерильны (Лоскутов, 2001).
Тетраплоидные виды рода Avena разнообразны по геномной конституции: тетраплоид A. macrostachya имеет кариотип СmCmСmCm (Родионов и др., 2005; Badaeva et al., 2010), у A. barbata, A. vaviloviana, A. abyssinica, A. agadariana, кариотип AABB (Badaeva et al., 2010b), у A. moroccana, A. murphyi, A. insularis DDCC (Badaeva et al., 2010a). Все гексаплоиды имеют кариотип AACCDD (Rajhathy, Thomas, 1974).

Мы провели локус-специфичное секвенирование внутреннего спейсера – ITS1 – ген 5.8S рРНК методом NGS (секвенирование следующего поколения) на платформе Illumina в Центре коллективного пользования «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ). Пул секвенированных ITS-последовательностей был обработан с помощью программы TCS 1.2 (Clement et al., 2000). Результаты TCS-расчетов были обработаны и визуализированы в программе TCS BU (Murias dos Santos et al., 2016).
Наши исследования показали, что диплоидный вид A. canariensis, судя по риботипам, занимает обособленное положение среди диплоидов и лишь очень отдаленно связан с остальными диплоидами – носителями A-генома. A. canariensis – это эндемик Канарских островов (Испания). Вид характеризуется своеобразным морфотипом – осыпается целыми колосками и обладает нижней цветковой чешуей с двумя зубцами, что не характерно для остальных диплоидных видов рода Avena (Loskutov, Rines, 2011). Кроме того, у растений этого вида лодикулы и эпибласт такого же типа, как у видов-гексаплоидов культурного типа (Baum, 1977). Анализ рДНК вида A. canariensis показывает, что в его формировании принимали участие два предковых вида с близкими, но не идентичными риботипами, однако при этом в его геноме есть минорные последовательности рДНК (37 и 39 ридов), идентичные рДНК диплоидных видов A. hirtula и A. wiestii (геномы As) и рДНК A. longiglumis (Al).
Ранее A. canariensis считался донором A-генома для полиплоидных видов и, в частности, для овса посевного A. sativa (Loskutov, Rines, 2011). Мы проверили эту гипотезу и она, по-видимому, не подтверждается. На рис. 1 видно, что последовательности рДНК гексаплоидного A. sativa (геном ACD) можно разделить на два мажорных риботипа (7623 рида и 3786 ридов), отдаленно родственных, из диплоидных видов с А-геномами, A. longiglumis (геном Al). При этом представляется весьма любопытным, что в общем пуле риботипов диплоидных видов с разными вариациями А-генома обнаружился минорный компонент (всего 129 ридов), найденный и в геноме A. sativa var. aurea (возможно именно этот компонент представляет рДНК предкового вида с А-геномом).
Наше исследование показало, что диплоидные виды рода Avena представляют собой интрогрессивно-гибридизационный комплекс, сеть видов, в той или иной степени объединенную родственными связями, в которой можно различить некоторые общие для них семейства риботипов. Так, обособленный риботип характерен для A. longiglumis (9412 ридов), этот же вариант рДНК второй по массовости в геноме у видов c As-геномами – A. hirtula (3479 ридов), A. wiestii (2901 рид), и, как минорная фракция, он представлен в геноме вида с геномом Ad A. damascena (11 ридов). Редкий эндемичный вид c геномом Ap A. prostrata, отличающийся очень небольшими размерами нижних цветковых чешуй и всего растения, имеет набор рибосомных генов, в котором присутствует помимо основного еще и второй риботип, родственный вторым по массовости последовательностям рДНК A. hirtula (2959 ридов), A. wiestii (2589 ридов), A. damascena (3939 ридов). Таким образом, по результатам наших исследований представляется возможным, что геном узкого эндемика A. canariensis мог принимать участие в формировании аллополиплоидного генома современных культурных гексаплоидных видов рода Avena как один из предковых таксонов. Тем не менее вклад этого вида в геномную конституцию гексаплоидов (ACD) незначителен, о чем говорит малая доля риботипов, характерных для A. canariensis, в геноме гексаплоидов в сравнении с риботипами иного происхождения. Наличие общих риботипов у видов с разными типами A-геномов можно объяснить тем, что это остатки рДНК их общего предка. Вторая гипотеза – это могут быть следы спорадически происходящей гибридизации A. canariensis (геном Ac) с диплоидными видами A. hirtula и A. wiestii (геномы As) и A. longiglumis (геном Al).
Эти результаты можно интерпретировать как свидетельство того, что диплоидные виды Avena, носители Al, Ap и As-геномов, являются, в действительности, не первичными диплоидами, репродуктивно изолированными друг от друга, а своеобразным средиземноморским интрогрессивно-гибридизационным комплексом видов (термин Р.В. Камелина, 2009), спорадически вступавших и вступающих в акты межвидовой гибридизации.
Второй вывод: сравнение риботипов диплоидных и гексаплоидных видов показывает, что геномы современных природных диплоидов достаточно далеко отстоят от А-субгеномов культурного вида A. sativa. Это может быть связано как с тем, что геном А гексаплоидами был получен от особого, вымершего диплоидного вида с А- геномом. Вторая гипотеза, заслуживающая проверки, состоит в том, что современный вариант рДНК гексаплоидов заметно отличается от исходного «прародительского» варианта, поскольку, как известно, в геномах полиплоидов происходят малоизученные процессы мутирования и изогенизации последовательностей рДНК (концертной эволюции), в результате которой субгеномы становятся более похожими друг на друга, а не на предполагаемых предков (согласно модели эволюции повторенных генов «рождение-и-смерть» (Родионов и др., 2016). Таким образом, наше исследование методом секвенирования следующего поколения (NGS) на платформе Illumina показало высокое разнообразие и разнородность геномов диплоидных видов рода, не выявляемая ранее секвенированием по методу Сэнгера.

2. МОЛЕКУЛЯРНО-ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СОРНО-ПОЛЕВЫХ ВИДОВ РОДА AVENA L.

В ходе работ по проекту нами проведено молекулярно-филогенетическое исследование сорно-полевых видов рода Avena L. с использованием маркерных последовательностей ITS1–гена 5.8S рРНК–ITS2. Кроме того, было проведено секвенирование нового поколения (NGS) на платформе Illumina последовательности ITS1 и начала гена 5.8S рРНК. Результаты секвенирования по Сэнгеру выявили отдельную кладу видов с хорошим уровнем поддержки и малым уровнем различия между собой. По данным NGS-секвенирования, были выявлены два наиболее массовых по количеству последовательностей риботипа. Среди общих последовательностей гексаплоидов не обнаружены относящиеся к С-геному. Для A. persica и A. georgica показано наличие уникальных риботипов.
Сорно-полевые виды рода Avena L. – это специализированные сорняки полбы, овса и ячменя, распространяются они с зерном культурных растений, засоряя посевы. Ареал их когда-то охватывал весь зерновой пояс, занимая пространства от южных районов земледелия до приполярных районов, осваиваемых первопроходцами. Такая обширная география способствовала формированию широкого внутривидового морфологического и, вероятно, генетического разнообразия видов и подвидов овсов. Сегодня, в условиях интенсивного земледелия, эти виды встречаются очень редко, а некоторые, возможно, уже исчезли из природы. Между тем широкий диапазон адаптации сорно-полевых видов к неблагоприятным факторам внешней среды, их приспособленность к разнообразным почвенно-климатическим условиям, устойчивость к патогенным организмам представляют уникальный источник исходного материала для селекции.
Изучение внутривидового разнообразия – сборов, сохранившихся в коллекции генетических ресурсов овса (ВИР), показало, что сорно-полевые виды имеют четкую географическую приуроченность и локализуются, в основном, на территории Ирана, Грузии и России (республики Башкортостан, Дагестан, Татарстан и Чувашия).
Изучение генетического полиморфизма «сорных» видов овсов представляет большой интерес для селекционеров. Среди этих видов могут быть и наверняка есть природные расы, близкородственные A. sativa (A. aggr. sativa) и A. fatua (A. aggr. fatua). Ботаники в A. aggr. sativa включают, в частности, такие виды и разновидности, как эндемик Поволжья A. volgensis (Vavilov) Nevski (=A. sativa var. volgensis Vavilov), A. sativa var. kasanensis Vavilov, A. sativa var. segetalis Vavilov, европейско-среднеазиатский A. macrantha (Hack.) Nevski (=A. sativa var. asiatica Vavilov), европейско-кавказско-сибирский A. georgica Zuccagni (=A. sativa var. praegravis Krause), евросибирско-дальневосточный A. orientalis Schreb., преимущественно южноевропейско-среднеазиатский A. persica Steud. (=A. sativa var. persica Vavilov). К A. aggr. fatua относят, например, европейско-кавказскосибирский A. intermedia T. Lestib., преимущественно европейско-североамериканский A. cultiformis (Malzew) Malzew, европейский A. aemulans Nevski и южноевропейско-среднеазиатский A. occidentalis Durieu (=A. fatua subsp. meridionalis Malzew).
Нами впервые были секвенированы маркерные последовательности ITS1–гена 5.8S рРНК–ITS2 у разновидностей A. sativa и A. fatua (Рис. 2). Геномную ДНК выделяли из семян CTAB методом (Doyle & Doyle 1987) с модификациями, а также используя Qiagen DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA). Для амплификации района ITS1–5.8S рДНК–ITS2 ядерного генома в ходе полимеразной цепной реакции использовались праймеры: Its-1P (Ridgway et al., 2003) и Its-4 (White et al.,1990).
Все исследованные виды - гексаплоиды с геномом ACD (Loskutov, Rines, 2011), однако при этом на древе мы не видим теоретически возможного различия между рДНК, происходящими от А, С и D -геномов. В этом особенность секвенирования рДНК по Сэнгеру - секвенирование по Сэнгеру выявляет лишь наиболее массовый вариант субгенома в полиплоидном геномном наборе, а доля рДНК С-субгеномов в общем пуле рДНК гексаплоида, как мы показали ранее, не превышает 1,5-2% (Родионов и др., 2020). На древе рис. 2 все виды и разновидности сформировали отдельную кладу с хорошим уровнем поддержки, при этом их различия между ними невелики (p-distance от 0.003 до 0.02).. Эта клада соответствует A-субгеному гексаплоидных овсов, в нее также входит последовательности образцов A. sativa из Южной Кореи и из Греции и A. fatua из Южной Кореи и Китая.

Характерная особенность ITS-последовательностей видов – внутригеномный полиморфизм в позициях 46 и 101 (ITS1), 226 (5.8S рДНК), 301, 308, 543 (ITS2). Так, у A. georgica, A. occidentalis, образца A. persica из Дагестана, A. sativa var. segetalis в позиции 46 стоит A и G (У A. volgensis, A. volgensis var. kasanensis, образца A. persica из Ирана в позиции 46 находится A, у некоторых образцов A. sativa из Греции – G, у A. intermedia из Китая (провинция Сычуань) – G, и у некоторых образцов A. sativa из Греции – A. Такой же полиморфизм у вышеназванных образцов наблюдается и в позиции 101, там C и T У A. volgensis, A. macrantha, A. volgensis var. kasanensis, A. persica в этом положении стоит C, у A. intermedia из Сычуаня T, греческие образцы A. sativa – либо C, либо T. Не все образцы A. sativa попадают в кладу с сорно-полевыми видами видами: например, некоторые образцы A. sativa из Греции имеют в позиции 143 (5.8S рДНК) аутапоморфную делецию трех нуклеотидов.
Для прояснения филогенетического положения видов из агрегатов A. sativa и A. fatua нами было проведено локус-специфичное секвенирование нового поколения (NGS) маркерных последовательностей ITS1–гена 5.8S рРНК на платформе Illumina. NGS-cеквенирование проводили в ЦКП «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ).
Мы обработали результаты NGS-секвенирования всего спектра последовательностей ITS полиплоидных геномов Avena с помощью программы TCS (Clement et al., 2000). Алгоритм TCS основан на вероятностном методе статистической парсимонии и позволяет определять вероятность связи между всеми гаплотипами с индикацией числа мутаций, по которым различаются исследуемые гаплотипы. Результаты TCS-расчетов были обработаны в программе TCS BU (Múrias dos Santos et al., 2016).

Результаты NGS выявили два наиболее представленных по количеству последовательностей семейства риботипов в полиплоидном геномном наборе, общих почти для всех исследованных видов и разновидностей из родства A. fatua и A. sativa (Рис. 3). Эти два семейства риботипов соответствуют последовательностям А-генома и D (A')-генома, который, как предполагалось ранее является вариантом генома A (Loskutov, Rines, 2011). При этом большинство риботипов в этих субгеномах оказались общими для всех исследованных образцов. Для A. persica и A. georgica показано и наличие уникальных видоспецифичных риботипов, содержащих последовательности исключительно этих видов, числом чуть более двухсот ридов для каждого.
Полученные данные позволяют предположить, что мы имеем дело с начальными процессами видообразования в этой очень близкородственной группе гексаплоидных овсов. Именно поэтому, по результатам молекулярно-филогенетических исследований достаточно сложно разделить эту группу на отдельные «биологические» виды.

Тем не менее, мы видим вероятное начало обособления двух видов: A. persica и A. georgica, которые, используя терминологию В. Гранта (1984) вероятно можно считать «полувидами». Так же вызывает большой интерес то, что последовательности С-генома в общем пуле последовательностей гексаплоидов не обнаружены, они располагаются отдельно, образуя очень небольшую фракцию (всего 44 рида), вероятно сильно измененную процессами постгибридизационной трансформации. Наши данные подтверждаются цитогенетическими исследованиями. Метод FISH показал, что С-субгеномы полиплоидных видов овса потеряли большую часть рДНК, и на них удается выявить только очень слабые 35S рДНК-позитивные сигналы (Badaeva et al., 2010a,b; Родионов и др., 2020).

3. ПРОИСХОЖДЕНИЕ РЕДКОГО ЭНДЕМИЧНОГО ВИДА ОВСА
AVENA BRUHNSIANA.

Известны один тераплоидный вид овсов с геномом С – Avena macrostachya и четыре диплоидных вида овсов с С-геномом - A. ventricosa, A. pilosa (= A. eriantha), A. clauda и A. bruhnsiana (Loskutov, Rains, 2011). Геном Cv A. ventricosaсостоит только из субакроцентрических хромосом. Геномы A. pilosa и A. clauda, называемые геномом Cp, более сложны по морфологии хромосом: у них два больших субметацентрика, один метацентрик среднего размера, два акроцентрика среднего размера и два малых субтелоцентрика (Шелухина и др., 2008; Badaeva et al., 2010a,b). В геноме Cv имеется один ядрышковый организатор (NOR), а в обоих гаплоидных Cp геномах по две NOR-хромосомы (Лоскутов и Абрамова 2006; Шелухина и др. 2008; Badaeva et al., 2010a,b). Что касается A. bruhnsiana, четвертого диплоидного вида с С-геномом, то он имеет кариотип 2n = 14 с одной или двумя парами субметацентриков (Rajhathy 1971; Лоскутов и Абрамова 2006).
Кариотипы видов с С-геномами показывают, что A. ventricosa, вид, в геноме которого утрачен один из ЯОР, по-видимому, относительно далек от близких друг другу видов A. clauda и A. pilosa (Шелухина и др. 2008; Badaeva et al., 2010a,b). Вопрос в том, какое место на филогенетическом дереве занимает вид A. bruhnsiana. Впервые этот вид был собран фармацевтом Александром Брунсом на Апшеронском полуострове и острове Святом (ныне о-в Пираллахи) в Каспийском море в 1863–1864 годах и был описан как новый вид Грюнером (1868). По своим морфологическим признакам A. bruhnsiana близок к A. ventricosa, однако A. bruhnsiana, как правило, имеет более крупные размерные характеристики (Мусаев, Исаев, 1971; Rajhathy, 1971; Цвелев, 1983). Вид встречается на Апшеронском п-ове у прибрежных песков в ненарушенных растительных сообществах с A. ventricosa. По-видимому, вид отличается от A. ventricosaпо морфологии хотя бы одной пары хромосом (Emme 1930; Rajhathy 1971; Лоскутов, Абрамова 2006). В отличие от A. ventricosa, у этого вида всего одна пара ЯОР (Лоскутов, Абрамова, 2006). Гибриды между A. bruhnsiana и A. ventricosa, по-видимому, не отличаются от родительских видов по плодовитости (Rajhathy, 1971). С другой стороны, A. bruhnsiana при скрещивании с A. clauda и A. pilosa не давала плодородного потомства (Nishiyama, Yabuno, 1975). Таксономический статус вида не ясен. Мальцев (1930) объединил A. ventricosa и A. bruhnsiana в один вид A. ventricosa Balansa с двумя подвидами: subsp. ventricosa и subsp. bruhnsiana. Цвелев (1983) считал A. bruhnsiana синонимом более широко распространенного A. ventricosa. Rajhathy (1971) полагал, что кариологические данные и отсутствие репродуктивной изоляции поддерживают мнение Мальцева (1930) и объединял A. ventricosa Balansa и A. bruhnsiana Gruner в один вид. В то же время азербайджанские ботаники Мусаев и Исаев (1971) предположили, что A. bruhnsiana, возможно, является межвидовым гибридом. Мы исследовали эту гипотезу. Для этого мы исследовали внутригеномный полиморфизм локусов 18S рДНК (частичная последовательность) - внутренних транскрибируемых спейсеров ITS1-5.8S рДНК (частичная последовательность) у этого вида, используя локус-специфическое секвенирование этой области на платформе Illumina.
Также как в других экспериментах в рамках этого Проекта, образцы овса для анализа были получены из коллекций Федерального исследовательского центра Всероссийского института генетических ресурсов растений (ВИР) им. Н.И. Вавилова. Овес в коллекциях ВИР собирали в естественной среде обитания, а затем поддерживали путем пересадки. В наших исследованиях использовались следующие растительные материалы: Avena bruhnsiana (к-212, Азербайджан, Апшеронский полуостров, колл. В.Н. Солдатов; инвентарные номера Генбанка OK303012 - OK303068); Avena ventricosa (k-2056, Алжир, 3 км к востоку от Орана, Колорадо М. Леггетт; инвентарные номера OK301935 - OK302014); Avena clauda (к-269, Азербайджан, Агсуинский район, Агсу, колл. В.Н. Солдатова; инвентарные номера OK273905 - OK274031); Avena pilosa (k-1890, Сирия, 40 км к северу от Дамаска, Coll. M. Leggett; инвентарные номера OK273862 - OK273899); Avena macrostachya (k-1856, Algeria, Atlas Mts, Djurdjura Mt., Coll. M. Leggett; инвентарные номера OK256902 - OK256954). ДНК из листового материала экстрагировали согласно модифицированному протоколу Doyle & Doyle (1987) с использованием мини-кита для растений Qiagen (Qiagen inc., Германия). Секвенирование 18S рДНК (фрагмент) - внутренний спейсер ITS1–5.8S рДНК (фрагмент) методом NGS проведено в Центре коллективного пользования «Геномные технологии, протеомика и клеточная биология» ВНИИСХ. Микробиология. Полученные последовательности были обрезаны с использованием программного обеспечения Trimmomatic PE (Bolger et al. 2014). Последовательности (чтения) были объединены с помощью программы fastq-join (Aronesty 2013). Затем мы обработали результаты секвенирования ITS-последовательностей с помощью программы TCS, которая использовалась для построения сети риботипов (Clement et al. 2000). Алгоритм TCS основан на вероятностном методе статистической экономии и позволяет определить вероятность родства между всеми гаплотипами с указанием количества мутаций, по которым различаются исследуемые гаплотипы. Результаты расчетов TCS были визуализированы в TCS BU (Múrias dos Santos et al., 2016). В анализ были включены последовательности, содержащие не менее 10 считываний на геном. Последовательности С-генома овса, полученные методом NGS, также использовали в байесовском и NJ-анализах. Байесовский подход был выполнен с использованием программы Mr. Bayes 3.2.2 (Ronquist et al. 2012) в соответствии с моделью TPM + I + G, вычисленной с помощью jModelTest 2. 1.6 (Darriba et al. 2012). Анализ сети NJ проводился с помощью программы SplitsTree4 (Huson and Bryant, 2006).

Секвенируемая и анализируемая область рДНК в наших экспериментах включала 3'-конец 18S рДНК (71 п.н.), область ITS1 (224 п.н.) и частичную последовательность 5,8S рДНК (54 п.н.). Изучение внутригеномного полиморфизма этой последовательности у видов C-генома показало, что виды с одним ЯОР - A. ventricosa демонстрируют один доминирующий вариант риботипа Cv1 рДНК (12560 прочтений, 81% всех прочтений) (табл.1, рис. 4-5). 19% прочтений в этом геноме являются минорными вариантами основной версии рДНК (рис. 4). У тетраплоидного вида с С-геномом A. macrostachya мы видим два близкородственных основных риботипа (Cm1A - 4971 чтения, 52% и Cm1B 3033 чтения, 32%) (табл. 1). У диплоидного вида с двумя ЯОР, A. pilosa, мы обнаружили 2 основных риботипа - Cp1A (1366 прочтений, 82%) и Cp1B (1748 прочтений, 11%). Минорные варианты близки к этим двум основным версиям рДНК (рис. 4).

Совершенно иной паттерн риботипов у A. clauda, рДНК этого вида удивительно разнообразна. Во-первых, это риботип Cc1A, который идентичен риботипу Cp1B (21% считываний) и близкородственному риботипу Cc1B (10% считываний) (Табл. 1). Затем серия риботипов Cc2A, Cc2B и Cc2C, последовательность которых близка к рДНК видов с геномами типа А. Паттерн рДНК этого вида характеризуется большим количеством минорных вариантов, одна группа из которых образует «облако» вокруг основных вариантов Cc1B - Cp1B / Cc1A, а вторая группа близка к вариантам риботипов из семейства Cc2 ( Рис.3-4).

Уровень различий между разными риботипами невелик - один или несколько SNP и делеций (табл. 2).

Структура риботипов A. bruhnsiana показывает, что это вид гибридного происхождения, в геноме которого основная часть рДНК (67%) представлена риботипом C1v, но 11% генома составляет риботип Cc1B (11%) и 2% прочтений - риботип Cp1B / Cc1A (Табл. 1, Рис. 3-4). Отметим, что тесная связь между A. bruhnsiana и A. ventricosa подтверждается тем фактом, что минорный вариант рДНК с протяженной делецией в области ITS1 длиной 70 п.н. (107 и 105 прочтений у A. ventricosa и A. bruhnsiana, соответственно - 0,7% прочтений в обоих геномах) обнаружено только в геномах этих двух видов. На рис. 1 эти последовательности отмечены звездочкой.
Вопрос о втором предке этого вида - A. pilosa или A. clauda - однозначно не решен. Однако можно предположить, что это был A. clauda. В геноме A. bruhnsiana, помимо рДНК варианта Cc1B, мы можем видеть минорные варианты, близкие к риботипам Cc2B - 1,7% таких прочтений в геноме.
Гомоплоидное видообразование гибридов, при котором новые гибридогенные виды возникают без изменений числа хромосом, традиционно считалось редкостью по сравнению с более распространенным видообразованием аллополиплоидных гибридов (Abbott et al. 2010). Наши результаты показывают, что диплоид A. bruhnsiana является таксоном гибридного происхождения: (нотовидом), одним из его предков был A. ventricosa, а вторым, по-видимому, A. clauda. Таким образом, мы приходим к выводу, что правильнее было бы принять его название как Avena × bruhnsiana. Поскольку кариотип A. × bruhnsiana диплоидный (2n = 14) (Emme 1930; Rajhathy 1971; Лоскутов, Абрамова, 2006), это, как сказано, гомоплоидный гибрид. По разнообразию рДНК один из его предков, A. clauda, также является гомоплоидным гибридом, и, возможно, одним из его предков был вид с рДНК, близкой к рДНК диплоидного A-генома вида Avena. Таким образом, из четырех изученных диплоидных видов рода Avena по крайней мере два являются гомоплоидными гибридами.
Другое наблюдение, сделанное в этой работе, требует дальнейших исследований. Виды с двумя ядрышковыми организаторами в их геноме на разных хромосомах имеют по крайней мере два риботипа, в то время как A. ventricosa, имеющая один ЯОР, имеет только один риботип. Это может указывать на то, что гомогенизация рДНК происходит в пределах одного ЯОР более эффективно, чем гомогенизация рДНК в локусах, лежащих на разных хромосомах. Это может быть связано с тем, что один из механизмов гомогенизации рДНК связан с конъюгацией гомологичных хромосом и, следовательно, происходит более эффективно в пределах одной хромосомы, чем между разными хромосомами (Eickbush and Eickbush 2007; Sochorová et al.2018).
Среди изученных С-геномов овса есть один тетраплоид (2n = 28) - A. macrostachya. Этот вид считается самым древним видом рода Avena (Nikoloudakis, Katsiotis, 2008; Peng et al., 2008). A. macrostachya, многолетний, перекрестноопыляемый узкоэндемичный вид, впервые был собран в 1971 г. в виде отдельных побегов (клонов) на большой высоте (1500 м) у самой кромки снега в горном районе Джурджура Атласских гор на северо-востоке Алжира (Baum and Rajhathy, 1976). На каменистых склонах гор, покрытых лугами и пастбищами, этот вид может подниматься до 2000 м над ур. (Лоскутов 2007). По своим морфологическим особенностям это многолетнее растение является примитивным представителем рода Avena. Некоторые исследователи даже относили его к роду Helictotrichon (Golub, 1958). A. macrostachya обладает особым типом C-генома, обозначенным как CmCm (Родионов и др., 2005). Также считалось, что A. macrostachya могла иметь ранее не описанный геном EE (Лоскутов 2007). Проведенный нами анализ данных NGS по последовательностям рДНК 18S – ITS1-5.8S показал, что риботипы A. macrostachya C-типа, но они сравнительно далеки от других существующих С-геномных овсов (рис. 3, табл. 2).
Мы можем видеть, что анализ внутригеномного полиморфизма рДНК последовательностей гораздо более информативен, чем результаты обычно используемого в молекулярно-филогенетических исследованиях анализа последовательностей путем секвенирования по Сэнгеру. Здесь мы видим, что даже «хорошие» диплоидные виды имеют следы древней гибридизации в своих NORs.

4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СПЕКТРА БЕЛКОВ –ГЛИАДИНОВ И ПОЛИМОРФИЗМА РДНК КАК ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ У ДИКОРАСТУЩИХ ПОДВИДОВ ВИДА AEGILOPS TAUSCHII.

Изучение генетического разнообразия диких и культурных злаков, в частности пшеницы и ее сородичей, основанное на изучении полиморфизма белков и нуклеиновых кислот, позволяет дифференцировать и идентифицировать линии, сорта, выявлять филогенетическое родство между видами и разновидностями, изучать генетические процессы, протекающие в популяциях в естественных условиях и в селекционном процессе, при репродукции образцов в генных банках, а также в семеноводстве. В качестве молекулярно-генетических маркеров генотипов злаков хорошо зарекомендовали себя электрофоретические спектры глиадина – множественного, генетически полиморфного запасного белка эндосперма зерновки. Спектры глиадина пшеницы и ее сородичей контролируются множественными аллелями глиадин-кодирующих локусов, локализованных на коротких плечах I и VI гомеологичных хромосом геномов (Kasarda et all., 1976). Простота и доступность методов электрофореза, не требующих дорогостоящего оборудования, позволяют выявлять у злаков высокий полиморфизм по спектрам глиадина и на этом основании маркировать отдельные генотипы. Для регистрации результатов электрофоретического анализа нами использован биохимический способ записи, основанный на разделении спектра глиадина на отдельные фракции (α, β, γ, ω) и определении подвижности компонентов в каждой из них. Способ разработан в отделе молекулярной биологии ВИР в 70-80 годах ХХ века и утвержден Международной организацией по семенному контролю (ISTA) (Konarev et. al., 2000). Спектр в целом маркирует определенный генотип, а компонентный состав его регистрируется в виде «белковой формулы».
Объект нашего исследования - вид Ae. tauschii является ценным источником полезных признаков в селекции мягкой пшеницы. Показано, что подвид Ae. tauschii ssp. strangulata участвовал в появлении вида Triticum aestivum как донор генома D (Dvorak et all.,1998).
Цель работы этого этапа работы: по спектрам глиадина, как маркерам генотипа, провести сравнительный анализ образцов эгилопсов, традиционно определяемых как Ae. tauschii ssp. strangulata, собранных в разных прикаспийских районах Азербайджана и Ирана. Определить и зарегистрировать в виде «белковых формул» особенности биотипов образцов из разных мест сбора исходя из предположения (рабочей гипотезы), что здесь могут сосуществовать два разных подвида.
Материал и методы. Список исследованных образцов эгилопсов с указанием районов сбора, года и места репродукции, а также «белковые формулы» выявленных биотипов представлены в таблице 3. В общей сложности изучено 11 образцов «типочных» Ae. tauschii ssp. strangulata и 3 образца, которые мы считаем новым подвидом. Как правило, это оригинальные образцы из мест сбора или их наиболее ранние репродукции из коллекции ВИР. Для определения стабильности и сохранения оригинальности образцов в процессе репродукции исследованы эгилопсы strangulatа (к-1958) и нового подвида (к-1740) различных лет и мест репродукции. Минимальная стандартная выборка – 14, максимальная – 98 зерновок. В общей сложности проанализировано свыше 500 индивидуальных зерновок. Для проверки возможности маркирования спектрами глиадина отдельных растений в составе популяции и определения полиморфизма в пределах колоса исследован колосовой материал 7 случайных растений (по 3 зерновки от каждого) оригинального образца к-1958 подвида strangulatа иранского происхождения из коллекции ВИР.
Электрофоретический анализ запасного белка глиадина, выделенного из индивидуальных зерновок, проводили по стандартной методике, разработанной в ВИРе в модификации, используемой для злаков (Konarev et al., 2000). Глиадин экстрагировали из предварительно измельченных зерновок 6М раствором мочевины в течение 2 часов при комнатной температуре или 10-12 часов при 4° С. Электрофорез выполняли в пластинах 6,5% ПААГ в ацетатном буфере РН 3,1 в течение первого часа при силе тока 20 mА на одну пластину и напряжении 300 V, а в последующие 4 часа при силе тока 40 mA на пластину и напряжении 580V. По окончанию электрофореза пластины извлекали и фиксировали в растворе (6мл 0,25% водного Кумасси G-250 в 200мл 12,5% ТХУ). Окрашенные пластины фотографировали. Спектры регистрировали в виде «белковых формул», отражающих компонентный состав каждой зоны спектра с учетом подвижности компонентов, их интенсивности, наличия субкомпонентов, обозначаемых подстрочными индексами 1 и 2. В качестве стандарта для регистрации зон спектра и нумерации отдельных компонентов использовали хорошо изученные спектры глиадина сорта пшеницы Кавказ. Идентичные по составу спектры объединяли в биотипы, определяли частоту в каждом образце. Анализ генетического разнообразия проводили не только по спектру в целом, но и по составу α - β и γ - ω зон, особенности которых определяются аллельной структурой локусов GLI-1D и GLI-2D, локализованных на коротких плечах хромосом 1D и 6D.
На рисунке 5 представлены фотографии колосков двух из семи случайно отобранных растений оригинального образца к-1958 подвида strangulata иранского происхождения и электрофоретические спектры индивидуальных зерновок из этих растений. По морфологическим признакам колоски этих растений имеют незначительные различия. Однако растения, отнесенные к предположительно разным подвидам, четко различались по спектрам глиадина (Рис. 5). Анализ спектров глиадина индивидуальных зерновок от каждого из семи исследованных растений не выявил полиморфизма в пределах колоса ни у одного из них, что указывает на возможность маркирования спектрами глиадина отдельных растений. В целом из семи растений пять по морфологии колосков и спектру глиадина соответствовали ssp. strangulata, а два – новому подвиду.
Спектры глиадина индивидуальных зерновок отдельных образцов Ae.tauschii ssp.strangulata и нового подвида из Ирана и прикаспийских районов Азербайджана представлены на рисунке 6.

Как видно, они значительно различаются между собой. Состав компонентов, отражающий особенности структуры каждой зоны (α, β, γ и ω) и спектра глиадина в целом, у всех исследованных образцов, зарегистрирован в виде «белковых формул» (Таблица 3).
Как видно, они значительно различаются между собой. Состав компонентов, отражающий особенности структуры каждой зоны (α, β, γ и ω) и спектра глиадина в целом, у всех исследованных образцов, зарегистрирован в виде «белковых формул» (Таблица 3).

В общей совокупности у 14 образцов выявлено 25 типов спектра. Сравнивая их между собой, можно отметить сходство компонентного состава отдельных зон спектра у разных образцов, но в целом они различаются между собой и маркируют разные биотипы. Это позволило определить качественный состав биотипов и выделить группы моно- и полиморфных образцов.

Среди мономорфных образцов большая часть относится к «типовому» подвиду strangulatа, а три образца: к-112 из Азербайджана, к-901 и к-1740 из Ирана по морфологическим и ряду других признаков определены как новый подвид, условно: «iranica». Все образцы strangulatа (как мономорфные, так и полиморфные) отличаются между собой по компонентному составу спектров глиадина, но общим для них является наличие в различном сочетании от 1 до 5 быстродвижущихся компонентов в α-зоне (таблица 3, рис. 6). По этому признаку данный подвид отличается от представителей подвида tauschii, в спектрах образцов которого компоненты α-зоны полностью отсутствуют.
Образцы подвида «iranica» однородны по спектрам глиадина, сходны между собой, но четко отличаются от представителей типичного ssp. strangulate. Особенностью их является обедненная α-зона и наличие в ней очень интенсивного компонента α 51, которого нет в спектрах глиадина исследованных образцов ssp. strangulate (рис. 6, таблица 3). Спектры образцов «iranica» при очевидном сходстве имеют ряд отличий по компонентному составу α-β-зон, кодируемых сложным полиморфным локусом GLI-2D, а также по γ- ω- зонам, находящимся под контролем локуса GLI-1D.
Анализ зерновок оригинального образца к-1740 и трех его репродукций ( Ташкент-81, -88 и Дербент-13) показал, что данный образец остается однородным и идентичен оригиналу независимо от года и места репродукции (данные не показаны), что указывает на стабильность его генетической структуры.
Дополнительный анализ по спектрам глиадина нескольких образцов, тщательно отобранных и отнесенных по морфологическим признакам к «iranica», показал, что в их составе могут присутствовать два-три выявленных нами и зарегистрированных биотипов этого подвида. Это свидетельствует о наличии в природе популяций, включающих только биотипы нового подвида iranica, которые можно выявить, используя методы молекулярно-генетического анализа.
Таким образом, на основании маркирования спектрами глиадина биотипов эгилопсов исследована внутрипопуляционная структура образцов подвидов strangulatа и «iranica» из Ирана и прикаспийских районов Азербайджана.
Показано, что
- ТИПИЧНЫЙ подвид ssp.strangulata обладает большим запасом генетической изменчивости в глиадинкодирующих локусах на коротких плечах хромосом 1 D 6 D. В зависимости от числа биотипов в выборках определены группы моно - и полиморфных образцов. Высокий уровень полиморфизма отмечен в популяциях из центральной части Ирана и прикаспийских районов Азербайджана, что соответствует ранее обозначенному месту происхождения данного подвида эгилопсов;
- исследованные образцы предположительно нового подвида «iranica» относятся к монотипной группе. По спектрам глиадина идентифицированы и зарегистрированы в виде «белковых формул» три биотипа (А, В и С), характерные для образцов к-112 из Азербайджана, к-901 и к-1740 из Ирана, соответственно. Это указывает на генетическое разнообразие в подвиде iranica. Маркерным признаком биотипов ssp.iranica по сравнению с ssp. strangulatа является обедненность α-зоны спектра глиадина и наличие в ней интенсивного α 51 компонента. Образцы данного подвида сохраняют идентичность независимо от года и места репродукции как в монотипном состоянии, так и в составе популяции совместно с представителями ssp. strangulatа.
В рамках нашего проекта рДНК «типичных» и «нетипичных» образцов Ae. tauschi ssp. strangulatа были исследованы методом NGS ITS1 – результаты подтвердили выводы, сделанные на основании исследования полиморфизма белков-глиадинов зерновок – скорее всего, это два разных по конституции рДНК подвида (рис. 7).

5. ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ РЕДКОГО ЭНДЕМИЧНОГО БАНАНА, MUSA HUANGBAIOA.

Продолжалось исследование происхождения предположительно гибридных видов и сортов бананов. В 2021 году изучалось происхождение вида Musa huangbaioa, который был описан в китайском журнале в 1987 г. Этот банан был найден у подножия горы Эмей в провинции Сычуань. Он имеет примечательные морфологические черты, такие как волнистый край черешка листа, ребристые плоды и неправильную форму семян, что достаточно необычны для рода Musa (рис. 8). Из-за его неопределенного родства, мы исследовали положение M. huangbaioa в семействе Musaceae с помощью молекулярно-филогенетического анализа двух маркерных последовательностей, nrITS и trnL–trnF (рис. 9-10).
Виды большей части семейства банановых (Musaceae) в основном имеют широкий естественный ареал, но объект нашего исследования M. huangbaioa описывался только у подножия горы Эмэй и поэтому является узко эндемичным. Это довольно необычно для бананов. Морфологические признаки Musa huangbaioa показывают его принадлежность к секции Мusа: псевдостебли высокие, прицветники желтые, иногда буроватые, листья с сероватым оттенком. Этот вид также отличается от всех остальных видов бананов необычной ребристой формой плодов и волнистыми краями черешков. Цветочные признаки M. huangbaioa, а также высота растений больше всего напоминают M. itinerans. Семена также напоминают семена секты. Муса; они угловатые, почти как у M. acuminata. Цветочные признаки напоминают M. itinerans Cheesman, но прилистник длиннее, чем у M. itinerans. Более того, согласно результатат секвенирования ITS, M. huangbaioa идентична образцу M. basjoo, культивируемому в Центральной Америке, и имеет те же последовательности trnL – trnF, что и M. basjoo.


Вид мог возникнуть в олигоцене и, судя по морфологическим данным, образоваться после разделения линий M. balbisiana, M. acuminata и M. schizocarpa. Как показано нами ранее, M. basjoo agr. содержит сложные гибридные виды, вероятно, с разными материнскими геномами. Можно предположить, что вид M. huangbaioa может быть современным гибридом с материнским геномом, унаследованным от M. basjoo. Необычная форма плода может быть приспособлением к горным условиям. Мы обнаружили, что этот вид принадлежит к большой и достаточно сложной группе китайских бананов, кладе M. basjoo–M. itinerans. По данным ITS, M. huangbaioa. Вся группа M. basjoo–M. itinerans, к которой принадлежит M. huangbaioa, хорошо отграничена внутри секции Musa и может быть склонна к частым гибридизациям в естественной среде; она требует дополнительного изучения для более точной дифференциации этой группы.





Key findings for the stage (summarized)

Изучено происхождение дикорастущих диплоидных видов овсов с С- и A- геномами. Анализ внутригеномного разнообразия рДНК диплоидов с разными вариантами А-геномов показал, что эти виды в прошлом прошли через этапы межвидовых скрещиваний и интрогрессии чужеродных генов в их геномы и представляют собой интрогрессивно-гибридизационный комплекс видов. Они образуют сеть с общими семействами риботипов, представленными в геномах разных видов с разной частотой. Выявляя филогенетические связи сорных видов овса, мы показали близкое родство этих видов с A. sativa и A. fatua, показано, что у них произошла почти полная потеря рДНК, полученной от диплоидных предков с С-геномами. Показана относительно высокая дивергенция рДНК A. persica и A. georgica, которых, используя терминологию В. Гранта (1984), можно считать «полувидами». Гексаплоидные виды A. fatua, A. sterilis, происхождение которых нами изучалось, используются в селекционных программах при выведении холодоустойчивых сортов овса посевного. Проведен анализ спектра белков – глиадинов у разнообразных по композиции генома дикорастущих образцов вида Aegilops tauschii, собранных в Азербайджане и Иране. Этот вид – прародитель генома D мягкой пшеницы. Показано, что по спектрам глиадина образцы разделяются на две группы. Одна из них соответствовала образцам по морфологии типичным представителям подвида Ae. tauschi spp. strangulata, вторая группа имела определенные морфологические отличия. Анализ транскрибируемых спейсеров ITS1 «типичных» и «нетипичных» Ae. tauschi spp. strangulata подтвердил их генетические различия. Совокупность данных позволяет предполагать, что кроме подвида Ae. tauschi spp. strangulata в прикаспийских районах Ирана и Азербайджана есть другой подвид. Статья с его описанием готовится к печати. Выделена геномная ДНЕ иведется анализ внутригеномного полиморфизма Hordeum vulgare. Полученные в 2021 году результаты важны для селекционеров, поскольку использование дикорастущих предков сельскохозяйственных культур в селекции является наиболее перспективным направлением для борьбы с генной эрозией

Academic ownership of participants (text description)

Родионов А.В. - руководитель проекта, планирование экспериментов, координация работ, написание статей по итогам исследования.
Лоскутов И.Г. - Подбор материала для исследования, фенотипический анализ образцов Avena, анализ и обсуждение результатов исследования, написание статей.
Чикида Н.Н. - Подбор материала для исследования, фенотипический анализ образцов Пшеницевых, анализ и обсуждение результатов исследования, написание статей.
Ковалева О.Н. - Подбор материала для исследования, фенотипический анализ образцов ячменей, анализ и обсуждение результатов исследования, написание статей.
Коцеруба В.В, - Кариологический анализ, написание статей.
Носов Н.Н. - Геномный анализ злаков, молекулярно-филогенетическое исследование образцов, написание статей.
Гнутиков А.А. - Выделение геномной ДНК, секвенирование, анализ результатов секвенирования, написание статей.
Журбенко П.М, - Выделение геномной ДНК, секвенирование, анализ результатов секвенирования, написание статей.
Лукина К.А, Работа с генетической коллекцией овсов, фенотипический анализ образцов овсов и ячменей, написание статей.
Карабицина Ю.М. - абота с генетической коллекцией эгилоплов, геномный анализ, обсуждение полученных результатов, написание статей.
Крапивская Е.Е. - секвенирование геномной ДНК, обработка полученных результатов, написание статей.

Transfer of the full copy of the report to third parties for non-commercial use: permitted/not permitted

разрешается

Check of the report for improper borrowing in external sources (plagiarism): permitted/not permitted

разрешается
Short titleGZ-2021
AcronymМ1_2020 - 2
StatusFinished
Effective start/end date23/03/2131/12/21

ID: 75429205