Известно, что развитие и старение растений, созревание их семян, действие неблагоприятных абиотических факторов среды, а также хранение и термическая обработка продуктов питания растительного происхождения приводит к образованию конечных продуктов глубокого гликирования (КПГГ) растительных белков. При потреблении млекопитающими растительной пищи, гликированные белки подвергаются глубокому ферментативному гидролизу, и образующиеся гликированные аддукты лизина и аргинина могут всасываться в пищеварительном тракте преимущественно в виде ди- и олигопептидов. Несмотря на наличие значительного количества информации о взаимодействии таких аддуктов с рецепторами клеток эндотелия и внутренней среды млекопитающих, на данный момент остаются в значительной мере неизученными два аспекта: (i) паттерны продуктов гликирования, образующихся в растительных белках при созревании семян, их хранении и термической обработке, а также (ii) все многообразие физиологических эффектов этих продуктов, имеющих место при их воздействии на клетки млекопитающих и совокупность сигнальных путей, опосредующих клеточные ответы на эти воздействия.
Таким образом, целью предлагаемого проекта является изучение характера гликирования белков семян гороха в зависимости от различных условий выращивания растений, специфики используемых сортов, условий хранения семян и их термической обработки перед употреблением в пищу в контексте физиологических эффектов, наблюдаемых в модельных клеточных культурах и экспериментальных животных.
Для достижения поставленной цели необходимо выполнение следующих задач:
1. Постановка модели гликирования белков семян гороха in vivo. В рамках данной задачи будет рассмотрено гликирование белков in vivo под действием абиотических стрессоров (засуха). Осмотический стресс будет приложен после завершения цветения, на стадии формирования последних бобов. Помимо этого, будет рассмотрено гликирование белков семян in vitro – т.е. в ходе хранения и термической обработки семян. Хранение семян будет смоделировано с помощью подхода, известного как ускоренное старение, т.е. инкубация семян в условиях повышенной температуры и влажности в течение 3 – 8 дней. Термическая обработка будет проведена в форме длительного кипячения в соответствии с основной бытовой и промышленной технологией переработки семян гороха.
2. Характеристика ответа растений на стресс. Оценка осмотического стресса будет основана на ряде физиологических и биохимических маркеров с помощью методов, рутинно используемых в лаборатории руководителя. Кроме того, будет проводиться оценка качества собранных созревших семян с точки зрения их жизнеспособности, всхожести и морфологии развивающихся проростков. Физиологические эксперименты будут проводиться в тесном сотрудничестве с многолетними партнерами руководителя – зав. Каф. Физиологии и Биохимии Растений СПбГУ проф. С.С. Медведевым и доц. Г.Н. Смоликовой, известными специалистами в области физиологии стресса и семян.
3. Идентификация конечных продуктов глубокого гликирования в семенах гороха. Для решения данной задачи будет проводиться глубокий ферментативный гидролиз белков, изолированных из семян с помощью фенольной экстракции, с последующим анализом гликированных аддуктов методом обратнофазной хромато-масс-спектрометрии. При этом, основное внимание будет сосредоточено на аддуктах аминокислот, увеличивающих свое содержание в условиях засухи, при исскусственном старении и в результате термической обработки. Структура этих аддуктов, с высокой степенью вероятности являющихся конечными продуктами глубокого гликирования (КПГГ), будет охарактеризована с помощью тандемной масс-спектрометрии (MSn) и ядерного магнитного резонанса (NMR).
4. Оценка паттернов потенциальных гликирующих агентов. На данном этапе будет проведен анализ потенциальных предшественников КПГГ: реактивных карбонилов и сахаров. Результаты будут интерпретированы в контексте уровня гликирования белков, общего содержания отдельных продуктов гликирования в семенах, а также физиологических эффектов препаратов семян в клеточных и животных тест-системах. Таким образом, анализ гликирующих агентов необходим для понимания механизмов образования КПГГ и их роли в физиологических эффектах, связанных с гликированием.
5. Оценка физиологических эффектов гидролизатов белков семян гороха. Потенциальное провоспалительное действие продуктов гликирования в составе гидролизатов белков из семян гороха будет оцениваться с помощью культуры клеток острой моноцитарной лейкемии человека THP-1, а также нейробластомы человека SH-SY5Y. Степень фосфорилирования NF-κB (Ser536), которое является маркером запуска воспалительного клеточного ответа, будет определяться с помощью вестерн-блоттинга. Анализ экспрессии генов провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α) будет проводиться с помощью количественной ПЦР в реальном времени. Кроме того, с помощью проточной цитометрии будет оцениваться содержание активных форм кислорода, образующихся в клетках при воздействии КПГГ и влияющих на активацию фактора NF-κB.
6. Анализ молекулярных механизмов, лежащих в основе ответа клеток на действие экзогенных КПГГ в составе гидролизатов белков семян гороха. Для оценки механизмов, лежащих в основе ответа клеток на внесение гидролизатов белков, гликированных in vitro и in vivo, будут использоваться методы протеомного анализа. Изменения протеома дифференцированно обработанных популяций клеток будут проанализированы с помощью метода мечения аминокислот стабильными изотопами в культуре клеток (stable isotope labeling of amino acids in cell culture, SILAC). Для увеличения глубины охвата протеома, эксперименты могут быть также проведены с индивидуальными клеточными фракциями (ядро, цитозоль, микросомы, митохондрии). При этом, особое внимание будет уделено фосфопротеому, как основному источнику информации о путях клеточного сигналинга.
7. Влияние экзогенных КПГГ в составе гидролизатов белков семян гороха на физиологическое состояние экспериментальных животных. Физиологические эффекты, обнаруженные при воздействии гидролизатов белков на клетки острой моноцитарной лейкемии человека THP-1 и нейробластомы человека SH-SY5Y будут далее изучены в экспериментах кормления модельных животных – мышей. Для этого в пищу животных будут добавлены семена растений, подвергнутых абиотическому стрессу (засухе), или семена, подвергнутые так называемому ускоренному старению. При этом будут оцениваться как анатомо-морфологические, так и физиологические и биохимические параметры состояния животных. Для оценки ответа организма на внесение семян, содержащих КПГГ, будет исследован протеом плазмы крови, мозга, печени, почек, сосудов и мышц.