4.3.7.1. Научная проблема, на решение которой направлен проект.
Модификация растительных белков с целью замены белков животного происхождения в фармацевтической, косметической, пищевой отраслях промышленности и уменьшения загрязнения окружающей среды представляет одну из основных научных проблем устойчивого развития.
4.3.7.2. Актуальность проблемы, научная значимость решения проблемы.
Задача обеспечения растущего населения нашей планеты богатыми белком продуктами питания становится особенно актуальной. Она может быть решена, по крайней мере частично, в результате замены животных белков на белки, полученные из растений, при условии сохранения питательности, вкусовых свойств и безвредного воздействия на организм. Важно отметить, что животноводство и дальнейшее производство продуктов питания оказывают особенно негативное воздействие на окружающую среду, в частности, в результате роста выделения парниковых газов [1]. Различные материалы на основе растительных белков оказываются значительно дешевле, чем полученные на основе белков животного происхождения, что позволяет их использовать при создании эффективных эмульгаторов, биоразлагаемых пластмасс, не приводящих к образованию микропластика, биосовместимых тканей для применения в медицине, адсорбентов для очистки воды от ионов тяжелых металлов [1-9].
Среди различных функциональных материалов на основе белков особый интерес представляют амилоидные фибриллы. Получение нетоксичных амилоидных фибрилл в последние два десятилетия вызвало широкий интерес к этим системам. Этот вид самоорганизации белков привел к созданию многочисленных искусственных белковых материалов с большим разнообразием функций: от переноса и медленного выделения в организме антираковых терапевтических пептидов [10] до биокатализа и трансфекции [11-14]. Амилоидные фибриллы с высокоупорядоченной морфологией и разнообразием активных групп на их поверхности стали рассматриваться как гибкие блоки для создания функциональных материалов [15-18]. Практическое использование амилоидных фибрилл в различных областях медицины и техники подробно обсуждается в многочисленных обзорах, опубликованных в последнее время [19-30]. В последние годы в нескольких работах было показано, что растительные белки могут эффективно заменять белки животного происхождения в фибриллах, в частности, при создании биопластмасс и адсорбентов для очистки воды от тяжелых металлов [4,7,31]. Эти исследования только начинают развиваться и были проведены только для небольшого числа доступных растительных белков. К настоящему времени функциональные свойства белков растительного происхождения исследованы в значительно меньшей степени, чем свойства животных белков.
В то же время замена животных белков на растительные может оказаться не простой задачей, поскольку функциональные свойства экстрактов растительных белков часто уступают свойствам животных белков. Более того, коммерчески доступные экстракты часто оказываются слабо растворимыми в воде и характеризуются относительно низкой поверхностной активностью. Они также обычно представляют смеси различных белков и содержат примеси полифенолов, липидов и полисахаридов [32-34]. Таким образом, возникает важная научная задача определения свойств водных растворов очищенных растительных белков, водных дисперсий их агрегатов, включая фибриллы, влияния различных примесей на эти свойства и модификация этих свойств за счет взаимодействий с другими веществами, прежде всего, с целью увеличения поверхностной активности.
Литература
1. M. Peydayesh, M. Bagnani, W.L. Soon, R. Mezzenga, Chem. Rev. ч123 (2023) 2112−2154.
2. A. Poirier, A. Banc, A. Stocco, M. In, L. Ramos, 526 (2018) 337–346.
3 A. Poirier, A. Stocco, R. Kapel, M. In, L. Ramos, A. Banc, Langmuir 37(8) (2021) 2714–2727.
4. A. Herneke, C. Lendel, D. Johansson, W. Newson, M. Hedenqvist, S. Karkehabadi, D. Jonsson, M. Langton, ACS Food Sci. Technol. 1 (2021) 854−864.
5. M. Peydayesh, M. Bagnani, R. Mezzenga, ACS Sustainable Chemistry and Engineering, 9(35) (2021) 11916-11926.
6. L.M.C. Sagis, J. Yang, Curr. Opin. Food Sci. 43 (2022) 53–60
7. T. Li, J. Zhou, M. Peydayesh, Y. Yao, M. Bagnani, I. Kutzli, Z. Chen, L. Wang, R. Mezzenga, Adv. Sustainable Syst. 7, (2023) 2200414.
8. W.L. Soon, M. Peydayesh, R. Mezzenga, A. Miserez, Chem. Eng. J. 445 (2022) 136513.
9. M. Bagnani, S. Ehrengruber, W.L. Soon, M. Peydayesh, A. Miserez, R. Mezzenga, Adv. Mater. Technol. 8 (2023) 2200932.
10. S. K. Maji, D. Schubert, C. Rivier, S. Lee, J. E. Rivier, R. Riek, PLoS Biol. 6 (2008) e17.
11. C. X. Li, S. Bolisetty, R. Mezzenga, Adv. Mater. 25 (2013) 3694.
12. S. Bolisetty, J. J. Vallooran, J. Adamcik, R. Mezzenga, ACS Nano. 7 (2013) 6146.
13. J. Y. Zhou, A. Saha, J. Adamcik, H. Q. Hu, Q. S. Kong, C. X. Li, R. Mezzenga, Adv. Mater. 27 (2015) 1945.
14. S. Bolisetty, R. Mezzenga, Nat. Nanotechnol. 11 (2016) 365.
15. C. Li, J. Adamcik, R. Mezzenga, Nat. Nanotechnol. 7 (2012) 421.
16. Y. Cao, S. Bolisetty, G. Wolfisberg, J. Adamcik, R. Mezzenga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116 (2019) 4012.
17. S. Bolisetty, R. Mezzenga, Nat. Nanotechnol. 11 (2016) 365.
18. A. Palika, A. Armanious, A. Rahimi, C. Medaglia, M. Gasbarri, S. Handschin, A. Rossi, M. O. Pohl, I. Busnadiego, C. Gubeli, R. B. Anjanappa, S. Bolisetty, M. Peydayesh, S. Stertz, B. G. Hale, C. Tapparel, F. Stellacci, R. Mezzenga, Nat. Nanotechnol. 16 (2021) 918.
19. T. P. Knowles and R. Mezzenga, Adv. Mater., 28 (2016) 6546–6561.
20. C. Li, R. Qin, R. Liu, S. Miao, P. Yang, Biomater. Sci. 6(3) (2018) 462–472.
21. Y. P. Cao and R. Mezzenga, Adv. Colloid Interface Sci. 269 (2019) 334–356.
22. P. C. Ke, R. H. Zhou, L. C. Serpell, R. Riek, T. P. J. Knowles, H. A. Lashuel, E. Gazit, I. W. Hamley, T. P. Davis, M. Fandrich, D. E. Otzen, M. R. Chapman, C. M. Dobson, D. S. Eisenberg and R. Mezzenga, Chem. Soc. Rev. 49 (2020) 5473–5509.
23. K. S. Antonets, M. V. Belousov, A. I. Sulatskaya, M. E. Belousova, A. O. Kosolapova, M. I. Sulatsky, E. A. Andreeva, P. A. Zykin, Y. V. Malovichko, O. Y. Shtark, A. N. Lykholay, K. V. Volkov, I. M. Kuznetsova, K. K. Turoverov, E. Y. Kochetkova, A. G. Bobylev, K. S. Usachev, O. N. Demidov, I. A. Tikhonovich, A. A. Nizhnikov, PLoS Biol. 18 (2020) e3000564.
24. B.A. Noskov, A.G. Bykov, G. Gochev, S.Y. Lin, G. Loglio, R. Miller, O.Y. Milyaeva, Adsorption layer formation in dispersions of protein aggregates, Adv. Colloid Interface Sci. 276 (2020) 102086.
25. S.F. Mirpoor, C.V.L. Giosafatto, R. Porta Trends Food Sci. Technol. 109 (2021) 259−270.
26. C. Lendel, N. Solin, RSC Adv. 11 (2021) 39188.
27. Y. Meng, Z. Wei, C. Xue, Trends in Food Science & Technology 121 (2022) 59–75.
28. Y. Chen, Q. Liu, F. Yang, H. Yu, Y. Xie, W. Yao, Int J. Biol. Macromol. 200(1800) (2022) 151–161.
29. J. Yue, X. Yao, Q. Gou, D. Li, N. Liu, D. Yang, Z. Gao, A. Midgley, N. Katsuyoshi, M. Zhao, Food Hydrocolloids 132 (2022) 107827.
30. Y. Yuan, N. Solin, Adv. Mater. Interfaces (2022) 2200926.
31. Y. Han, Y. Cao, J. Zhou, Y. Yao, X. Wu, S. Bolisetty, M. Diener, S. Handschin, C. Lu, R. Mezzenga, Adv. Sci. 10 (2023) 2206867.
32. E.B.A. Hinderin,C.C. Berton-Carabin, K. Schroen, A. Riaublanc, B. Houinsou-Housou, A. Boire, C. Genot, J. Agric. Food. Chem. 69 (2021) 6601-6612.
33. R. Kornet, C. Shek, P. Venema, A.J. van der Goot, M. Meinders, E. van der Linden, Food Hydrocoll. 117 (2021) 106691.
34. J.P.D. Wanasundara, T.C. McIntosh, S.P. Perera, T.S. Withana Gamage, P. Mitra, OCL 23 (2016) D407.
4.3.7.3. Конкретная задача в рамках проблемы, на решение которой направлен проект, ее масштаб.
Среди различных свойств водных систем, содержащих растительные белки, наиболее важными для приложений оказываются их поверхностные свойства, как статические, так и динамические, а также поверхностная активность их комплексов с другими биомакромолекулами, амфифильными веществами и наночастицами. В работах последних лет отмечается, что поверхностные свойства водных систем оказываются определяющими, например, при получении на основе растительных белков гетерогенных продуктов питания [4,35,36], датчиков магнитного поля [31], пленок биоразлагаемых пластмасс [7,9]. В то же время, как замечают многие авторы, в настоящее время поверхностные свойства растительных белков и водных дисперсий их агрегатов только начинают изучаться [35,37,38]. В течение длительного времени все исследования в этой области ограничивались обсуждением результатов измерения поверхностного натяжения. Только в последние годы появились работы, где к растворам растительных белков начали применять методы поверхностной реологии [2,3,32,36,39]. Информация о конформации молекул белков в поверхностном слое и об их взаимодействии с амфифильными веществами у межфазной границы до сих пор оказывается крайне ограниченной [20,26,29,35]. Более того, в большинстве опубликованных работ поверхностные свойства измеряются только для растворов изолятов растительных белков, т.е. для относительно сложных систем, включающих несколько компонентов [2,3,35,39].
Таким образом, возникает задача определения структуры и свойств поверхностных слоев в водных системах, содержащих различные растительные белки, их агрегаты и смеси с различными амфифильными веществами, на решение которой направлен данный проект. Решение этой задачи должно открыть новые возможности замены белков животного происхождения в продуктах питания и различных технологиях на растительные белки.
Литература
35. S. Drusch, M. Klost, H. Kieserling, Curr. Opinion Colloid Interface Sci. 56 (2021) 101503.
36. V. Kontogiorgos, Food Hydrocolloids 138 (2023) 108486.
37. T.G. Burger, Y. Zhang, Trends Food Sci. Technol. 86 (2019) 25–33.
38. C. Berton-Carabin, K. Schroën, Curr. Opin. Food Sci. 27 (2019) 74–81.
39. O. Mileti, N. Baldino, J.A. Carmona, F.R. Lupi, J. Muñoz, D. Gabriele, Food Hydrocolloids 126 (2022) 107472.
4.3.7.4. Научная новизна поставленной задачи, обоснование достижимости решения поставленной задачи и возможности получения запланированных результатов.
Имеющиеся знания о поведении белков у межфазных границ получены, главным образом, на основе исследования белков животного происхождения. Однако структура растительных белков, как правило, оказывается более сложной, и, следовательно, структура поверхностного слоя может сильно отличаться от структуры межфазных границ в системах, содержащих животные белки. Первые исследования показали, что различия между поверхностными свойствами растворов животных и растительных белков не слишком велики. Эти свойства также зависят от внешних факторов, таких как рН, ионная сила и структура дисперсионной среды. К сожалению, большая часть проведенных исследований относится к изолятам белков, которые могут содержать различные белки. Ситуация становится еще более сложной, если учесть, что эти изоляты подвергались различным химическим воздействиям с целью изменить их структуру и функциональные свойства. Это означает, что существующая информация о поведении растительных белков в поверхностном слое оказывается крайне скудной [35, 38].
Примерно такая же ситуация сложилась и при исследовании поверхностных свойств агрегатов растительных белков, прежде всего амилоидных фибрилл. Амилоидные фибриллы большинства белков характеризуются высокой поверхностной активностью, и многие их применения связаны с функционализацией различных межфазных границ и свободных жидких пленок [26, 28, 40-44]. Согласно Ю с сотрудниками функциональность амилоидных фибрилл во многих случаях определяется поверхностными свойствами используемых систем, что делает задачу исследования адсорбции фибрилл на флюидных межфазных границах особенно актуальной [29]. В то же время информация о свойствах нанесенных и адсорбционных пленок фибрилл до сих пор оказывается крайне ограниченной. Так, например, несмотря на эффективное использование фибрилл для повышения устойчивости пен и эмульсий, механизм стабилизирующего действия, как и особенности поверхностных свойств дисперсий агрегатов белка, приводящих к этому эффекту, до последнего времени оставались недостаточно ясными [45,46]. Насколько известно из литературы, исследования агрегатов растительных белков, в частности, амилоидных фибрилл только начались [23]. Единственная работа по поверхностным свойствам в системах, содержащих агрегаты растительных белков, была опубликована авторами данного проекта [47].
Медленный прогресс в исследовании поверхностных свойств водных систем, содержащих растительные белки и их агрегаты, связан, прежде всего, с экспериментальными трудностями, имеющими две основные причины. Во-первых, число экспериментальных методов, пригодных для исследования поверхности растворов биомакромолекул и их агрегатов относительно невелико. Во-вторых, получения достаточно чистых образцов представляет трудную задачу. Так, например, гидролиз белка в процессе образования агрегатов приводит к возникновению полипептидов низкой молекулярной массы и высокой поверхностной активности. Традиционные методы очистки обычно не позволяют избавиться от этих примесей, сильно влияющих на поверхностные свойства [37, 38].
В работах авторов данного проекта были найдены способы получения относительно чистых растительных белков и тщательной очистки их агрегатов [45-47]. С другой стороны, оказалось, что комплекс методов дилатационой поверхностной реологии вместе оптическими методами (инфракрасная спектроскопия отражения - поглощения, эллипсометрия, микроскопия при угле Брюстера) и атомно-силовой микроскопией позволяет получить информацию о структуре и механизме образования сложных адсорбционных и нанесенных слое на поверхности жидкости, содержащих белки различной структуры, их смеси с другими высокомолекулярными веществами и их агрегаты. В следующих разделах предлагаемого проекта эти экспериментальные методы описаны подробнее.
Литература
40. T. P. Knowles and R. Mezzenga, Adv. Mater. 28 (2016) 6546–6561.
41. C. Li, R. Qin, R. Liu, S. Miao, P. Yang, Biomater. Sci. 6(3) (2018) 462–472.
42. Y. P. Cao and R. Mezzenga, Adv. Colloid Interface Sci. 269 (2019) 334–356.
43. P. C. Ke, R. H. Zhou, L. C. Serpell, R. Riek, T. P. J. Knowles, H. A. Lashuel, E. Gazit, I. W. Hamley, T. P. Davis, M. Fandrich, D. E. Otzen, M. R. Chapman, C. M. Dobson, D. S. Eisenberg and R. Mezzenga, Chem. Soc. Rev. 49 (2020) 5473–5509.
44. L. Wang, F.G. Backlund, Y. Yuan, S. Nagamani, P. Hanczyc, L. Sznitko, N. Solin, ACS Sustain. Chem. Eng. 9(28) (2021) 9289–9299.
45. B.A. Noskov, A.R. Rafikova, Yu, O. Milyaeva, J. Mol. Liq. 351 (2022), 118658.
46. B.A. Noskov, A.V. Akentiev, A.G. Bykov, G. Loglio, R. Miller, O.Yu. Milyaeva, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 220 (2022) 112942.
47. N.A. Isakov, М.V. Belousov, A. Nizhnikov, B.A. Noskov, Biophys. Chem. 10716 (2024) 107166.
4.3.7.5. Современное состояние исследований по данной проблеме.
Растительные белки были исследованы в значительно меньшей степени, чем белки животного происхождения. Хотя в последние годы число публикаций по структурным и функциональным свойствам этих белков заметно увеличивается, информация по поверхностным свойствам водных систем, содержащих эти белки, продолжает оставаться очень ограниченной [35, 38].
Из большого числа растительных белков в последние годы поверхностные дилатационные свойства определялись только для растворов изолятов или концентратов белков гороха [48], сои, риса [36, 39], конопли [39] и фасоли [36]. Наиболее подробно были исследованы поверхностные свойства растворов глиадина и белка семян подсолнечника [2, 3, 49]. Оказалось, что эти два белка характеризуются различным поведением на межфазной границе. Измерения кинетических зависимостей динамического поверхностного натяжения, динамической поверхностной упругости и эллипсометрических углов показали, что глиадин может сильно деформироваться на межфазной границе, в отличие от более жесткого белка семян подсолнечника. Зависимости поверхностного давления от возраста поверхности и поверхностной упругости от поверхностного давления имели несколько особенностей, которые были связаны с переходом между различными механизмами образования адсорбционного слоя и изменениями конформации белка у межфазной границы. Области плато перед и после вторичного увеличения поверхностного давления слабо различимы для растворов глиадина, в отличие от растворов белка семян подсолнечника. Особенности изменения поверхностных свойств с возрастом поверхности для растворов глиадина указывают на различные конформационные переходы в адсорбционном слое этого белка. Большая величина модуля упругости для слоя белка подсолнечника, чем для слоя глиадина при данном поверхностном давлении, указывает на адсорбцию более жестких наночастиц. Индукционный период в начале кинетических кривых поверхностных свойств оказывается более длительным для белка семян подсолнечника, чем для глиадина, несмотря на близкие коэффициенты диффузии. Это можно объяснить более высокой поверхностной активностью глиадина и его способностью распространяться по поверхности при низкой степени заполнения поверхности. Кроме того, оказывается, что слой глиадина может быть легко сжат благодаря гибкости этого белка.
Адсорбционные и нанесенные слои агрегатов растительных белков на водной поверхности до настоящего времени практически не изучались. Кроме приведенной выше работы авторов данного проекта [47], можно еще отметить работу группы профессора Мезенга, показавших, что биодеградируемую пластмассу можно получить, создавая пленку белка рапсового жмыха на водном растворе амфифильного вещества [9].
Важно отметить, что хотя в целом растительные белки оказываются менее поверхностно-активными, чем животные белки, их поверхностную активность можно увеличить. Во-первых, поверхностная активность зависит от способа экстрагирования белка из растений [6]. Во-вторых, белки можно модифицировать, применяя физические методы [51] или образуя комплексы с амфифильными веществами [6].
Литература.
48. E.B.A. Hinderink, L. Sagis, K. Schroën, C.C. Berton-Carabin, Colloids Surf. B 192 (2020) 111015.
49. A. Poirier, A. Banc, R. Kapel, M. In, A. Stocco, L. Ramos, Colloids Surf. A 648 (2022) 129317.
50. M. Nikbakht Nasrabadi, A. Sedaghat Doost, R. Mezzenga Food Hydrocoll 118 (2021) 106789.
51. J. Feng, C.C. Berton-Carabin, B.A. Mogol, K. Schroen, V. Fogliano Food Chem. 343 (2021) 128556.
4.3.7.6. Предлагаемые методы и подходы, общий план работы на весь срок выполнения проекта.
В ходе выполнения проекта будет использован новый подход, разработанный недавно для исследования поверхностных свойств сложных жидкостей, содержащих макромолекулы. Большинство традиционных методов исследования поверхности жидкости малочувствительно к локальной структуре поверхности. Например, зависимости поверхностного натяжения от концентрации и возраста поверхности практически всегда монотонны и обычно почти не меняются при изменении конформации макромолекул в поверхностном слое, что не позволяет выделить основные стадии адсорбции. Хотя более мощные экспериментальные методы физической химии поверхности жидкости, такие как, например, нейтронная рефлектометрия, позволяют оценить распределение сегментов в Z-направлении, двумерная структура поверхностного слоя остается неопределенной из-за макроскопического сечения падающего и отраженного лучей. В то же время методы дилатационной поверхностной реологии, использование которых предполагается в данном проекте, позволяют определить более тонкие поверхностные свойства, в частности, переход от двумерно однородной к микрогетерогенной поверхностной пленке и оценить кинетические характеристики этого перехода. Так, например, если поверхностное натяжение растворов агрегатов белков и их мономеров может быть близким, то результаты авторов проекта показывают, что значения модуля динамической поверхностной упругости для этих систем могут отличаться в несколько раз. При этом кинетические зависимости дилатационной динамической поверхностной упругости имеют экстремумы, соответствующие изменению конформации макромолекул или образованию агрегатов в поверхностном слое. Помимо методов дилатационной поверхностной реологии данный проект предполагает использование оптических методов исследования межфазной границы (эллипсометрия, инфракрасная спектроскопия отражения – поглощение, микроскопия при угле Брюстера), а также атомно-силовой микроскопии (АСМ) и сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Различные виды микроскопии должны позволить определить микро- и мезомофологию пленок растительных белков, их агрегатов и их комплексов с амфифильными молекулами на межфазной границе. Сочетание эллипсометрии, позволяющей оценить изменения суммарной поверхностной концентрации, и спектроскопии инфракрасного отражения-поглощения (IRRAS), позволяющей оценить изменение полос в инфракрасном спектре, характерных для отдельных компонентов, должно привести к оценке состава поверхностного слоя в процессе адсорбции отдельных компонентов или при сжатии нанесенной пленки. Таким образом, планируемый в данном проекте комплексный подход к исследованию смешанных пленок растительных белков с другими макромолекулами различной структуры позволит определить механизм их образования, свойства этих пленок и основные условия создания биосовместимых материалов на их основе.
Первый год выполнения проекта будет в основном посвящен определению статических и динамических свойств адсорбционных и нанесенных слоев нескольких различных растительных белков на водной поверхности. Планируется использовать различные методы выделения и очистки этих белков. Для определения механизма образования смешанной адсорбционной пленки будут измеряться поверхностное натяжение, динамическая поверхностная упругость, эллипсометрические углы в зависимости от возраста поверхности. Параллельно будут определяться свойства нанесенных на водную поверхность пленок растительных белков. Планируется определить морфологию нанесенных и адсорбционных пленок как функцию поверхностного давления. Предполагается, что полученные измерения позволят оценить влияние различных параметров, прежде всего, поверхностного давления, рН и ионной силы раствора, на характеристики образующейся пленки и на кинетику ее образования. Сравнение результатов для пленок, полученных разными способами, должно позволить определить особенности упаковки макромолекул в поверхностном слое и влияние на эту упаковку локальной концентрации и различных внешних факторов. Будут определены условия получения устойчивой пленки, необходимые для ее переноса на твердую подложку.
Зависимости действительной и мнимой частей дилатационной поверхностной упругости от возраста поверхности и концентраций компонентов будут определяться с помощью нескольких экспериментальных методов в области частот от 0.001 до 500 Гц. В области низких частот (< 0.2 Гц) планируется использовать методы осциллирующего барьера и осциллирующего кольца. В области более высоких частот будет использован метод капиллярных волн, в котором волны на поверхности раствора возбуждаются под действием электрического поля. В этом случае характеристики капиллярных волн, на основе которых рассчитывается поверхностная упругость, определяются по отражению луча лазера от поверхности жидкости на различных расстояниях от источника волн.
Во второй год выполнения проекта планируется определить механизм образования и свойства пленок различных агрегатов растительных белков, включая амилоидные фибриллы. Для выбора оптимальных условий создания таких пленок будут использованы результаты, полученные в первый год выполнения проекта. Как и на первом этапе выполнения проекта предполагается исследование адсорбционных и нанесенных пленок.
Для адсорбционных пленок предполагается также измерение зависимостей поверхностного натяжения, динамической поверхностной упругости, эллипсометрических углов от возраста поверхности. Параллельно планируется определение микро- и мезоскопической морфологии нанесенных и адсорбционных пленок с помощью микроскопии при угле Брюстера, атомно-силовой и электронной микроскопии. Для исследования особенностей формирования пленки агрегатов растительных белков планируется также использование инфракрасной спектроскопии отражения-поглощения (IRRAS).
В третий год выполнения проекта будут исследованы смешанные пленки растительных белков и амфифильных веществ (поверхностно-активных веществ, других белков, полиэлектролитов и незаряженных полимеров) с целью изменения свойств пленок и создания биоразлагаемых и биосовместимы пленок для применения в различных областях промышленности и медицине. В этом случае также планируется определение зависимостей поверхностного натяжения, динамической поверхностной упругости, эллипсометрических углов, интенсивности амидных полос инфракрасного спектра отражения – поглощения от состава пленки и возраста поверхности, а также параллельное определение микро- и мезоскопической морфологии смешанной пленки с помощью микроскопии при угле Брюстера, атомно-силовой и электронной микроскопии. Планируется перенос полученных пленок на твердую подложку. Предполагается оценка возможности использования полученных биосовместимых материалов для медицинских целей и практического использования полученных биодеградирумых пластических материалов на основе амилоидных фибрилл.
4.3.7.7. Имеющийся у коллектива исполнителей научный задел по проекту (в данном пункте заполняется текстовое описание задела, а размещение прочей подтверждающей информации описано в п. 4.3.20).
Авторами данного проекта был разработан новый подход для исследования слоев биомакромолекул на поверхности жидкости, основанный на применении методов дилатационной поверхностной реологии совместно с рядом оптических методов и микроскопией атомных сил. С помощью развитых методов был определен механизм формирования адсорбционных пленок глобулярных белков и влияние на этот процесс химических денатурантов. В системах, содержащих глобулярные белки, кинетические зависимости динамического поверхностного давления и модуля динамической поверхностной упругости совместно с данными других экспериментальных методов позволили оценить изменения третичной структуры белка на межфазной границе. Если глобулы белков разворачиваются на поверхности раствора, то кинетическая зависимость поверхностной упругости становится немонотонной. В этом случае образование петель и хвостов макромолекул в поверхностном слое приводит к возникновению нового механизма релаксации поверхностных напряжений за счет обмена сегментами между различными областями поверхностного слоя. Форма полученных кинетических кривых дает информацию о стабильности глобулярной структуры белка, степени разворачивания глобул и гибкости макромолекул в поверхностном слое. С другой стороны, образование микро- и наноагрегатов на межфазной границе может также приводить к возникновению локальных максимумов динамической поверхностной упругости. Такого рода явления были подробно исследованы авторами проекта на примере образования наночастиц на границе растворов комплексов полиэлектролитов и поверхностно-активных веществ с воздухом. В этом случае отклик системы на синусоидальные колебания площади поверхности становится нелинейным и фурье-анализ индуцированных колебаний поверхностного натяжения позволяет обнаружить высшие гармоники, амплитуда которых определяется скоростью массообмена между поверхностными агрегатами и окружающей их поверхностной пленкой.
Авторами проекта был также определен механизм формирования адсорбционных пленок комплексов белков и синтетических полиэлектролитов на границе жидкость – газ. Хотя основную роль в образовании комплексов играют электростатические взаимодействия, комплексы могут образовываться и в случае одноименно заряженных молекул, если основная цепь полиэлектролита характеризуется высокой степенью гидрофобности, как, например, в случае полистиролсульфоната натрия (ПСС). Для растворов смеси ПСС и отрицательно заряженных глобул различных белков в растворе образуются комплексы, кинетика адсорбции которых сильно отличается от соответствующих результатов для растворов чистого белка. Если полиэлектролит и белок противоположно заряжены, то для ряда систем, например, для растворов смеси бычьего сывороточного альбумина и ПСС при рН < 4 на кинетических зависимостях динамической поверхностной упругости возможно появление локальных максимумов, свидетельствующих о разрушении третичной структуры белка в поверхностном слое. Для противоположно заряженных комплексов ПСС и лизоцима, глобулы которого более устойчивы к внешним воздействиям, третичная структура разрушается незначительно, и кинетические зависимости остаются монотонными. Однако одновременное добавление в раствор лизоцима, ПСС и гидрохлорида гуанидина приводит к немонотонным кинетическим зависимостям динамической поверхностной упругости, что свидетельствует о полном разрушении третичной структуры комплексов.
В последние годы авторами данного проекта были также начаты исследования поверхностных явлений в системах, содержащих агрегаты растительных белков. Были исследованы нанесенные слои аморфных агрегатов структурного домена белка вицилина, купина-1.1, с помощью нескольких методов химии поверхности жидкости. Свойства слоев сильно отличались от результатов для слоев, исследованных ранее белков животного происхождения. Зависимость динамической поверхностной упругости от поверхностного давления имела два локальных максимума. В области первого максимума результаты близки полученным ранее для дисперсий полимерного микрогеля с мягкой «короной». Второй локальный максимум поверхностной упругости связан с взаимодействием жестких ядер агрегатов, приводящему к образованию полислойных структур при высоких поверхностных давлениях.
4.3.7.8. Детальный план работы на первый год выполнения проекта.
В первый год выполнения проекта планируется:
1. С помощью аффинной хроматографии выполнить очистку вицилина, полученного экспрессией в штамме E. coli BL21 (DE3).
2. Получить несколько растительных белков (зеин, глобулин овса и др.) путем экстракции из зерен растений, выполнить их очистку и оценить содержание глобулинов с помощью SDS-PAGE.
3. Провести измерения динамического поверхностного натяжения как функции возраста поверхности для растворов полученных белков (вицилин, зеин, глобулин овса и др.) на границе раствор - воздух при различных значениях рН, ионной силы и концентрации раствора.
4. Провести измерения дилатационной динамического поверхностной упругости как функции возраста поверхности для растворов полученных белков (вицилин, зеин, глобулин овса и др.) на границе раствор - воздух при различных значениях рН, ионной силы и концентрации раствора.
5. Провести измерения эллипсометрических углов как функции возраста поверхности для растворов полученных белков (вицилин, зеин, глобулин овса и др.) на границе раствор - воздух при различных значениях рН, ионной силы и концентрации раствора.
6. Определить микроскопическую морфологию адсорбционных пленок полученных белков (вицилин, зеин, глобулин овса и др.) при различных поверхностных давлениях с помощью атомно-силовой микроскопии.
7. Определить мезоскопическую и макроскопическую морфологию адсорбционных пленок полученных белков (вицилин, зеин, глобулин овса и др.) при различных поверхностных давлениях с помощью микроскопии при угле Брюстера.
8. Определить инфракрасные спектры отражения-поглощения адсорбционных пленок полученных белков при различных поверхностных давлениях.
9. На основе найденных кинетических зависимостей поверхностных свойств определить механизм адсорбции исследованных растительных белков и сравнить результаты с соответствующими данными для растворов белков животного происхождения.
10. Провести измерения поверхностного давления нанесенных пленок растительных белков как функции площади поверхности в ванне Ленгмюра при различных значениях рН и ионной силы подложки.
11. Провести измерения динамической поверхностной упругости нанесенных пленок растительных белков как функции площади поверхности в ванне Ленгмюра при различных значениях рН и ионной силы подложки.
12. Определить микроскопическую морфологию полученных нанесенных пленок растительных белков при различных поверхностных давлениях с помощью атомно - силовой микроскопии.
13. Определить мезоскопическую и макроскопическую морфологию полученных нанесенных пленок растительных белков при различных поверхностных давлениях с помощью микроскопии при угле Брюстера.
14. Для нескольких растительных белков (вицилин, зеин, белок зерен овса) получить аморфные агрегаты (микрогели, сферулиты) и выполнить их очистку диализом и с помощью центрифугирования.
15. Для вицилина и белка зерен овса получить фибрилярные агрегаты и выполнить их очистку диализом и с помощью центрифугирования.
16. Для водных дисперсий аморфных и фибриллярных агрегатов растительных белков начать измерения динамических поверхностных свойств, также как это предполагается сделать для адсорбционных и нанесенных пленок самих белков.
17. Выполнить сравнение между собой поверхностных свойств для всех систем, исследование которых планируется на первый год выполнения проекта.
18. Выполнить сравнение исследованных поверхностных свойств с соответствующими результатами для растворов белков животного происхождения.4.3.7.9. Ожидаемые научные и (или) научно-технические результаты (без перечисления указанных в пп. 4.3.11, 4.3.13, 4.3.14) и их научная новизна и значимость (например, оценка соответствия запланированных результатов мировому уровню исследований, возможность практического использования запланированных результатов).Прежде всего необходимо отметить, что в настоящее время информация о поверхностных свойствах водных систем, содержащих растительные белки, оказывается крайне скудной. Так, например, среди систем, исследование которых планируется в первый год выполнения проекта, насколько известно из литературы, только для растворов вицилина измерялось поверхностное натяжение. Другие поверхностные свойства не определялись. Для других систем(второй и третий год выполнения проекта) какая-либо информация по поверхностным свойствам практически отсутствует. Таким образом, новизна ожидаемых фундаментальных научных результатов не может вызывать сомнения. Водные системы, содержащие растительные белки, распространены в природе и все чаще используются при решении практических задач. В то же время, как уже отмечалось в других разделах данной заявки, поверхностные свойства растворов растительных белков и дисперсий их агрегатов заметно отличаются от свойств растворов и дисперсий, содержащих белки животного происхождения. Их определение и изучение поведения растительных белков на границе между двумя флюидными фазами представляет важную научную задачу. В последние годы было показано, что растительные белки могут эффективно заменять белки животного происхождения, например, в фибриллах при создании биопластмасс или адсорбентов для очистки воды от тяжелых металлов Информация о поверхностных свойствах водных систем, рассматриваемых в данной заявке, оказывается необходимой при решении ряда глобальных задач (раздел 4.3.7.2.), и будет в дальнейшем использоваться. Предполагается, что результаты планируемого исследования, в частности, позволят создать пленки биодеградируемых пластмасс (третий год выполнения проекта).4.3.7.10. Планируемый объем дополнительно привлеченных средств из внешних по отношению к СПбГУ источников за весь период выполнения проекта. Допустимо размещение всех указанных сведений в файле типа «Заявка», прикрепленном в разделе «Документы», в таком случае в данной графе указывается название файла. Планируется привлечение дополнительных средств, в частности, из планируемых грантов РНФ. За весь период выполнения проекта объем привлеченных средств должен составить 8,75 – 12 млн рублей.