Проект направлен на изучение механизма предотвращения образования амилоидных (в том числе прионных) агрегатов в процессе аутофагии. Такая информация имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, так как позволяет выявлять ключевые механизмы предотвращения образования токсичных белковых агрегатов, играющих важную роль в возникновении, развитии или ремиссии болезней, связанных с неправильной укладкой белка (коровье бешенство, болезнь Альцгеймера и Паркинсона, диабет 2 типа и др.). Накапливается все больше данных, что усиление аутофагии приводит к снижению уровня накопления агрегатов белков с неправильной укладкой, в том числе амилоидных, поэтому модулирование этого процесса является перспективной стратегией для лечения этих заболеваний.
Исследования будут проводиться в дрожжах S. cerevisiae, так как эксперименты на дрожжах хорошо себя зарекомендовали для изучения процессов аутофагии и амилоидной агрегации. Все основные механизмы аутофагии были открыты на дрожжах и впоследствии были показаны и у других эукаритотических организмов, включая человека. За эту работу, выполненную на дрожжах, была дана Нобелевская премия в области медицины в 2016 году. Кроме того, дрожжи широко используются для изучения свойств амилоидных белков. Благодаря легкости культивирования, доступности эффективных генетических методов и способности легкой детекции наличия прионов (инфекционных амилоидов), дрожжи являются превосходным модельным объектом.
Проект отражает совместные научные интересы обоих лабораторий и базируется на взаимодополняющем обширном научном заделе.
Доктор Чернов Ю.О., возглавляющий Научную лабораторию биологии амилоидов СПбГУ, является признанным экспертом мирового уровня в области биологии прионов дрожжей. В лаборатории налажены методы дрожжевой трансформации и фенотипической детекции приона в дрожжах, а также биохимические и флуоресцентные методы изучения свойств прионов и других белковых агрегатов. В проекте основные исследования будут проводиться на основе дрожжевого белка Sup35 (фактор терминации трансляции), который хорошо себя зарекомендовал как модельный белок для изучения свойств прионных агрегатов (имеют амилоидную структуру). Кроме того Гризель А.В. были оптимизированы методы получения агрегатов прионного белка Sup35 с различными свойствами (обратимые биомолекулярные конденсаты или необратимые амилоидные агрегаты) и охарактеризованы их свойства. Было показано, что конденсирование белка Sup35 при стрессовых воздействиях способствует их дальнейшему переходу в амилоидные агрегаты.
Доктор Вилфлинг, который возглавляет научную группу в институте биофизики Макса Планка (Франкфурт-на-Майне, Германия) имеет большой опыт в изучении процесса аутофагии в дрожжах и недавно охарактеризовал новый путь аутофагии для удаления биомолекулярных конденсатов белков эндоцитоза. В лаборатории доктора Вилфлинга используется множество передовых методов, включая биохимию, современную микроскопию живых клеток, количественную масс спектрометрию и другие общесистемные подходы для изучения аутофагии.
В работе будет использована коллекция штаммов дрожжей с делециями ключевых генов аутофагии (atg5∆, atg7∆, atg8∆, atg15∆, atg22∆, cue5∆), с разным прионным составом и уровнем продукции шаперонов, которая была получена в лаборатории доктора Ю.О. Чернова. Используя эти делеционные штаммы, будет исследовано влияние различных белков аутофагии на агрегацию прионного белка Sup35 с использованием передовых методов, которыми располагает лаборатория доктора Вилфлинга.
В результате совместной работы планируется определить мишень аутофагии в пути образования амилоидных агрегатов и выявить, какие ключевые белки аутофагии задействованы в этом процессе.
Взаимодополняющее сочетание методического потенциала двух лабораторий и имеющегося научного задела является несомненным преимуществом проекта, позволяющим выполнить исследование на высоком уровне. Результаты исследования планируется оформить в виде статьи(ей), которые будут поданы в высокорейтинговые научные журналы.
Большинство нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.) связаны с накоплением белковых агрегатов – амилоидов. Инфекционные формы амилоидов (прионы) способны распространяться между организмами или клетками одноклеточных организмов (прионы дрожжей). Несмотря на активное изучение образования амилоидов, механизм их формирования и разрушения до конца не ясен. В норме агрегаты белков разрушаются в клетке посредством систем деградации, в том числе аутофагией. Исследования указывают, что аутофагия напрямую связана с образованием амилоидов. Однако механизм действия аутофагии на формирование амилоидов не ясен. Целью проекта является определить роль аутофагии в предотвращении образования амилоидных агрегатов в дрожжах.
Исследования проводятся в дрожжах S. cerevisiae, так как эксперименты на дрожжах хорошо себя зарекомендовали для изучения процессов аутофагии и амилоидной агрегации. Все основные механизмы аутофагии были открыты на дрожжах и впоследствии были показаны и у других эукаритотических организмов, включая человека.
В работе создана и использована коллекция штаммов дрожжей с удаленными ключевыми генами аутофагии, что дает возможность исследования влияния различных белков аутофагии на агрегацию прионного белка Sup35 с использованием передовых методов, которыми располагает лаборатория доктора Вилфлинга.
В результате совместной работы была показана различная роль доменов белка Sup35 в его деградации путем аутофагии, а также проведена оценка влияния белков аутофагии на образование неамилоидных и амилоидных агрегатов белка Sup35. Кроме того было выявлено влияние типа агрегированного состояния Sup35 на эффективность аутофагии, то есть определено, на каком этапе формирования амилоидов белка Sup35 аутофагия действует наиболее эффективно.
Результаты исследования планируется оформить в виде научной статьи.
Принимающий институт: Институт биофизики Макса Планка
ФИО принимающего исследователя: доктор Флориан Вилфлинг
В результате работы были получены следующие результаты:
1.Была создана обширная коллекция штаммов дрожжей S. cerevisiae, содержащих различные делеции генов аутофагии (atg1∆, atg8∆, atg9∆, atg11∆, atg15∆), а также имеющие разнообразный прионный состав: [PIN+][PSI+]; [PIN+][psi-]; [pin-][psi-]. В дополнение были созданы штаммы для изучения вакуолярной деградации прионного белка Sup35, содержащие следующие модификации: atg15∆, vph1-MARS; vph1-MARS; atg15∆, atg8∆, vph1-MARS. Всего было создано 30 штаммов.
2.С помощью методов флуоресцентной микроскопии была исследована способность к образованию биоконденсатов и амилоидных агрегатов прионными доменами белка Sup35 в штаммах с делециями различных генов аутофагии. В результате было показано, что отсутствие отдельных генов аутофагии не приводит к значимым отличиям в формировании биоконденсатов и амилоидных агрегатов прионными доменами белка Sup35 при различных уровнях их сверхпродукции.
3.Была исследована частота индукции приона [PSI+] при различном уровне сверхпродукции прионных доменов белка Sup35 в штаммах с делециями генов аутофагии (atg1∆ и atg8∆). Для этого был использован метод высева серийных разведений культуры дрожжей и подсчета колоний, содержащих прион [PSI+] (метод фенотепической детекции нонсенс супрессии).
4.Был проведено исследование наличия вакуолярной деградации прионных доменов белка Sup35 при их сверхпродукции в различных штаммах ([PIN+][PSI+]; [pin-][psi-]) с делецией либо одного гена аутофагии (atg15∆), либо двух (atg15∆, atg8∆). Делеция atg15∆ - приводит к накоплению белков, подверженных аутофагии, а вакуолях клеток. Такие белки, слитые с GFP, легко детектируются по свечению флуоресцентного белка. Добавление второй делеции (atg8∆) приводит к полной блокировке аутофагии и транспорта таких белков в вакуоли. Для облегчения детекции флуоресцентного сигнала в вакуолях, их мембрана была помечена путем слияния белка Vph1 c красным флуоресцентным белком MARS.
В результате работы определено, на каком этапе формирования амилоидов Sup35 действует аутофагия. Кроме того определена роль различных белков аутофагии в образовании различных агрегатов белка Sup35. Эти результаты вносят клад в понимание процесса удаления неправильно свернутых белков в процессе аутофагии. Эта информация имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, так как позволяет выявлять факторы, влияющие на образование и удаление амилоидогенных агрегатов, играющих важную роль в возникновении, развитии или ремиссии болезней, связанных с неправильной укладкой белка (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона и др.).
| Acronym | D. Mendeleev 2021 |
|---|
| Status | Finished |
|---|
| Effective start/end date | 20/09/21 → 15/12/21 |
|---|
