Основная часть отчета о НИР
1. Картирование участка белка NOS1AP, отвечающего за его агрегацию.
Для определения амилоидогенного участка в белке NOS1AP мы воспользовались программой ArchCandy. Выбор программы был основан на серии статей, в которых была продемонстрирована её высокая точность по сравнению с аналогами (Ahmed et al., 2015, PMID: 25150734; Bondarev et al., 2015, PMID: 26030475; Roche et al., 2017, PMID: 28685932). С помощью ArchCandy мы провели поиск потенциальных бета-арок в белке NOS1AP (пороговое значение 0,575, без дополнительных встроенных фильтров). Согласно оригинальной статье (Ahmed et al., 2015, PMID: 25150734), наличие хотя бы одной такой структуры свидетельствует о способности белка формировать амилоидные агрегаты. Мы также проанализировали аминокислотную последовательность белка NOS1AP на наличие потенциальных амилоидогенных участков с помощью других алгоритмов, таких как Waltz (Maurer-Stroh et al, 2010, PMID: 20154676), AGGRESCAN (Conchillo-Solé et al., 2007, PMID: 17324296) и FoldAmyloid (Garbuzynskiy et al., 2009, PMID: 20019059). Все инструменты предсказывали амилоидогенный фрагмент в N-концевой части белка в позициях 1–291. Центральная область (аминокислотные позиции 292–390) NOS1AP и его С-концевая часть (позиции 391–506) являются амилоидогенными, согласно Waltz и FoldAmyloid. По результатам проведённого анализа мы выдвинули предположение, что фрагмент NOS1AP с 292 по 390 аминокислоту является амилоидогенным. Для гена NOS1AP экспериментально показано существование двух транскриптов, один из которых соответствует полноразмерному белку, а второй его C-концевому участку (начиная с 295 аминокислоты), который захватывает амилоидогенный фрагмент белка (см. обзоры (F. Freudenberg et al., 2015, PMID: 25612209; Wang et al., 2016, PMID: 27237129)).
Для дальнейшего анализа мы выбрали три участка NOS1AP: 1-291, 292-390 и 391-506. Выбор именно этих участков в первую очередь был основан на результатах программы ArchCandy. Для дальнейшей работы были получены плазмиды серии pDONR221, несущие кодирующие последовательности этих фрагментов. Эти конструкции в дальнейшем были использованы для получения экспрессионных векторов для различных тест систем. Все плазмиды были проверены с помощью рестрикционного анализа, а также методом ПЦР. Для проверки агрегации NOS1AP и его фрагментов мы использовали три модельные системы: система C-DAG для бактерий, клетки дрожжей S. cerevisiae, а также культуры клеток человека. В плазмидах серии pVSGW, которые используются в системе C-DAG, исследуемый белок слит с последовательностью, кодирующей сигнальный пептид белка CsgA (CsgAss). Этот пептид необходим для экспорта белка на поверхность клеток. Продукция химерного белка находится под контролем промотора, индуцируемого арабинозой. Плазмида pVSGW была ранее получена в нашей лаборатории и является модификацией оригинальных конструкций pVS105 и pVS72 (Sivanathan and Hochschild, 2013; PMID:23787895). Для последующих проверок в системе C-DAG мы использовали бактериальный штамм E. coli VS39 (Sivanathan and Hochschild, 2013; PMID:23787895), который трансформировали полученными векторами. Эти клетки также содержат вспомогательную плазмиду для сверхпродукции белков, отвечающих за экспорт СsgA на поверхность клеток. Соответствующая конструкция находится под контролем лактозного промотора, индуцируемого изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG). Клетки, несущие на поверхности амилоидные агрегаты, окрашиваются в красный цвет на среде с Конго красным в результате связывания амилоидов красителем. Согласно полученным результатам, ни NOS1AP, ни его укороченные варианты не формируют амилоидных агрегатов на поверхности клеток бактерий. Цвет исследуемых колоний не отличался от отрицательного контроля (Sup35M). Клетки, сверхпродуцирующие Sup35NM (положительный контроль), окрашиваются Конго красным в тех же условиях.
С помощью поляризационой микроскопии мы выяснили, что клетки с конструкциями с NOS1AP или его фрагментами, выросшие на среде с Конго красным, не обладают характерным для амилоидов яблочно-зеленым свечением в поляризованном свете. Таким образом, мы можем заключить, что NOS1AP не формирует амилоидных агрегатов с системе C-DAG. Из-за полученных отрицательных результатов дальнейшие проверки в этой бактериальной системе были признаны нецелесообразными.
Дрожжи S. cerevisiae являются популярной эукариотической моделью для изучения агрегации белков. Для исследования агрегации NOS1AP в клетках дрожжей нами был получен набор конструкций на основе pAG416-EGFP, в котором продукция химерных белков (NOS1AP, либо его фрагментов, слитых с EGFP) находится под контролем конститутивного дрожжевого промотора гена TDH3 (GAP). Этими конструкциями мы трансформировали штамм 74-D694. Одной из его особенностей является наличие приона [PIN+] (агрегатов белка Rnq1). Ранее было показано, что присутствие фактора [PIN+] может способствовать агрегации некоторых белков в клетках дрожжей (Halfmann et al., 2012, 22561191; Meriin et al., 2003, 14560003). Мы также использовали штамм 2-74-D694, в котором отсутствует фактор [PIN+]. Локализацию исследуемых белков в клетках мы проанализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Присутствие агрегатов Rnq1 в клетках дрожжей по нашим данным не влияет на агрегацию NOS1AP. В дальнейшем представлены результаты только для штамма [pin-].
Белки NOS1AP и NOS1AP(1-291) образуют агрегаты в штамме дрожжей 2-74-D694. В то же время фрагмент NOS1AP(292-390), который является амилоидогенным, согласно предсказанию ArchCandy, не образует скоплений в этих клетках. Отдельно необходимо отметить, что сверхпродукция фрагмента NOS1AP(391-506), который формирует аморфные скопления, приводит к увеличению размера клеток дрожжей. Можно предположить, что С-концевой PDZ-связывающий домен, присутствующий в этом фрагменте, взаимодействует с дрожжевыми белками с доменом PDZ. Белки с таким доменом находят у разных организмов, в том числе и у дрожжей S. cerevisiae. Известно, что эта часть белка содержит мотивы, необходимые для взаимодействия NOS1AP с nNOS в клетках человека. Возможно, эти последовательности могут взаимодействовать с некоторым дрожжевыми белками, что и лежит в основе наблюдаемого фенотипа.
Последней системой, в которой была проанализирована агрегация NOS1AP, стали клетки млекопитающих. Линия HEK293T была трансфицирована плазмидами на основе вектора pgLAP1. С помощью этого вектора возможно получить конструкцию, кодирующую белок интереса, слитый с флуоресцентным белком EGFP, а сама конструкция будет находиться под контролем сильного конститутивного промотора CMV. Флуоресценцию EGFP детектировали на микроскопе через 24 часа после трансфекции. Сверхпродукция NOS1AP, а также фрагментов NOS1AP(1-291) и NOS1AP(292-390), приводит к их агрегации в клетках. В то же время локализация фрагмента NOS1AP(391-506) в клетке неотличима от EGFP, и, судя по данным микроскопии, он не агрегирует. Стоит отметить, что при сверхпродукции белков NOS1AP, NOS1AP(1-291) и NOS1AP(292-390) клетки становились более округлыми, что может говорить о снижении жизнеспособности клеток. Тем не менее, судя по результатам окрашивания культур красителем трипановым синим клетки оставались живыми (данные не представлены). Аналогичные результаты были получены для полноразмерного белка NOS1AP и его фрагмента NOS1AP(292-390) в культуре клеток нейробластомы (IMR-32), однако из-за низкой эффективности трансфекции этой линии дальнейшие эксперименты с ней не проводились.
С помощью метода SDD-AGE мы обнаружили высокомолекулярные агрегаты NOS1AP и его фрагментов 1–291 и 292–390 в клетках HEK293T, устойчивые к SDS. Судя по всему, эти комплексы стабилизированы дисульфидными связями, поскольку добавление β-меркаптоэтанола (BME) приводило к растворению этих комплексов . Мы также обнаружили небольшие агргретагы (олигомеры) NOS1AP(391–506), которые не были идентифицированы с помощью флуоресцентной микроскопии. NOS1AP в клетках дрожжей присутствует в виде димеров и небольших олигомеров, устойчивых к обработке SDS. По-видимому, все агрегаты фрагментов NOS1AP демонстрируют одинаковую чувствительность к BME. Это совпадает с распределением цистеинов в белке; все проанализированные фрагменты содержат такие остатки. В совокупности наши результаты показывают, что NOS1AP может образовывать устойчивые к SDS агрегаты при сверхпродукции.
Учитывая наши данные в системе C-DAG, NOS1AP, скорее всего, не является амилоидом, но способен образовывать стабильные высокомолекулярные агрегаты в клетках эукариот. Это также подтверждается другими нашими результатами. Для фрагментов NOS1AP (включая центральный) нам не удалось получить амилоидные агрегаты in vitro (данные представлены в разделе 2.2). Таким образом, мы можем заключить, что белок NOS1AP хоть и является амилоидогенным судя по биоинформатическим предсказаниям, но таковым не явлется. Тем не менее, полноразмерный белок, а также некоторые его фрагменты, способны агрегировать и образовывать детергент-устойчивые комплексы.
2. Изучение влияния белка NOS1AP и его укороченных вариантов на формирование амилоидных агрегатов альфа-синуклеина.
2.1. Проверка взаимодействия NOS1AP и альфа-синуклеина в клетках дрожжей и млекопитающих.
Интерес к NOS1AP был связан с его потенциальной склонностью к агрегации, а также с возможностью физически взаимодействать с альфа-синуклеином, известным патологическим амилоидом. Данные о формировании комплекса из этих двух белков получены методом высокопроизводительного протеомного скрининга, но последующая направленная проверка этого факта отсутствовала. В нашей работе мы восполнили этот пробел. Для исследования физического взаимодействия двух белков в культуре клеток HEK293T был использован метод бимолекулярной флуоресцентной комплементации (BiFC) (Kodama & Hu, 2012, 23148879). Клетки млекопитающих HEK293T были трансфицированы одновременно двумя плазмидами на основе векторов pDEST-V1-ORF и pDEST-V2-ORF, каждый из которых кодировал один из двух белков интереса, слитый с фрагментом флуоресцентного белка Venus (V1 и V2). Сами по себе эти фрагменты не обладают флуоресцентными свойствами. Однако их сближение в результате взаимодействия исследуемых белков приводит к реассоциации V1 и V2 в функциональный белок. Фрагменты V1 и V2, слитые с одним из анализируемых белков, а также совместная продукция свободных V1 и V2 не приводили к свечению. В то же время, полноразмерный белок NOS1AP при взаимодействии с альфа-синуклеином (αSyn) в клетках HEK293T приводил к появлению ярких флуоресцентных скоплений, что говорит о физическом взаимодействии двух целевых белков, а также позволяет предположить их коагрегацию.
При работе с конструкциями, кодирующими фрагменты NOS1AP, было также отмечено физическое взаимодействия соответствующих белков с альфа-синуклеином. Примечательно, что альфа-синуклеин взаимодействовал с каждым из трех исследуемых фрагментов. Это не соответствует предположению о том, что в аминокислотной последовательности белка NOS1AP есть специфический участок, отвечающий за взаимодействие с альфа-синуклеином. Возможно, мы смогли зафиксировать пример неспецифической коагрегации двух белков.
Мы также проанализировали взаимодействие NOS1AP и альфа-синуклеина в клетках дрожжей S.cerevisiae. Для исследования этого взаимодействия клетки дрожжей S. cerevisiae были трансформированы одновременно двумя плазмидами на основе векторов pAG416GPD-EYFP и pAG415GPD-Cerulean. В этой системе в клетке синтезируются два целевых белка, один из которых слит с флуоресцентным белком EYFP, а второй – с белком Cerulean. В полученых трансформантах полноразмерный белок NOS1AP колокализуется с альфа-синуклеином. Также колокализация была отмечена для фрагментов NOS1AP(1-291) и NOS1AP(292-390). В случае фрагмента NOS1AP(391-506) мы не смогли обнаружить явную колокализацию двух белков. Можно предположить, что этот фрагмент попадает в определенное клеточное окружение и взаимодействует с некоторыми белками дрожжей, что препятствуют его взаимодействию с альфа-синуклеином, отмеченному в клетках HEK293T. При этом сами флуоресцентные белки EYFP и Cerulean, не слитые с целевыми белками, фокусов флуоресценции не образуют и светятся диффузно.
В ходе работы были также исследованы варианты альфа-синуклеина с заменами (A53T, A53E, A30P, E46K) на предмет взаимодействия с белком NOS1AP. Эти замены возникают в результате точечных мутаций в гене SNCA и связаны с наследственными формами паркинсонизма (Guan et al., 2020, PMID: 32595456). Соответствующие мутации были внесены в плазмиду pDONR221-SNCA с помощью сайт-направленного мутагенеза. Затем мутантные аллели SNCA были клонированы в вектор pAG415GPD-Cerulean. Эксперимент по анализу взаимодействия белков в дрожжевой системе был проведен по аналогии с предыдущим. Согласно полученным данным, белки ведут себя неодинаково: в случае замен A30P и A53E все еще можно предположить коагрегацию альфа-синуклеина и NOS1AP, но в случае остальных вариантов мы не наблюдали взаимодействия между белками. Нами было также отмечено, что в некоторых случаях альфа-синуклеин и NOS1AP не колокализовались. В частности, это наблюдалось в случае альфа-синуклеина с заменой E46K.
2.2. Изучения влияния агрегации NOS1AP на агрегацию альфа-синуклеином in vitro.
Перед получением препаративных количеств белков мы провели поиск оптимальных условий для их сверхпродукции в клетках бактерий. Штаммы BL21(DE3), BL21(DE3)pLysS, T7 и Origami были трансформированы конструкциями на основе вектора pDest527 для наработки белка NOS1AP и его фрагментов. В этих конструкциях последовательность белка интереса слита с последовательностью из шести гистидинов. Для штаммов с конструкциями, кодирующими фрагменты NOS1AP(292-390) и NOS1AP(391-506), был проведен сравнительный анализ уровня продукции целевых белков. В результате пробной индукции синтеза целевых белков был выбран штамм T7 для обоих фрагментов в связи с его высокой скоростью накопления биомассы и большим уровнем продукции белков интереса. К сожалению, подобрать условия индукции и выделить полноразмерный белок NOS1AP и его фрагмент NOS1AP(1-291) в препаративных количествах не удалось.
Для штамма T7, трансформированного плазмидой для наработки фрагментов NOS1AP(292-390) или NOS1AP(391-506), были подобраны условия культивирования и индукции синтеза целевого белка. Культуры растили при температуре 37 °C до достижения OD(600 нм) = 0,5. IPTG добавляли до концентрации 1 мM и продолжали растить культуры при 26 °С в течение 5 часов. В дальнейшем оба белка были очищены с помощью аффинной хроматографии.
Для исследования возможности амилоидогенного фрагмента NOS1AP(292-390) образовывать агрегаты in vitro очищенный белок растворяли в буфере PBS до концентрации 1 мг/мл и инкубировали при 37 °C на ротаторе при перемешивании “через голову”. Через 7 дней к образцу белка добавляли тиофлавин Т и измеряли интенсивность его флуоресценции. По нашим результатам фрагмент NOS1AP(292-390) не образует агрегатов, способных связывать тиофлавин Т. Аналогичные результаты мы получили сравнивая количество белка в кипяченых и не кипяченых пробах с помощью SDS-PAGE. При наличии высокомолекулярных агрегатов, которые не способны входить в полиакриламидных гель, такие пробы должны существенно отличаться. Однако, мы этого не зафиксировали (данные не приведены). Эти результаты совпадают с полученными результатами в системе C-DAG, это позволяет предположить, что NOS1AP не формирует амилоидных агрегатов при физиологических условиях.
Поскольку нам не удалось получить амилоидные агрегаты NOS1AP, мы решили проанализировать влияние этого белка на агрегацию мономерного альфа-синуклеина. Можно отметить, что NOS1AP(292-390) ускоряет агрегацию альфа-синуклеина, хотя и увеличивает время начала агрегации (лаг-фазу). Величина dx (величина обратная скорости агрегации альфа-синуклеина) значимо отличается при добавлении NOS1AP(292-390), что говорит о воспроизводимом влиянии этого фрагмента на агрегацию альфа-синуклеина. Оба проанализированных фрагмента NOS1AP увеличивают время лаг-фазы, однако нам не удалось статистически подтвердить это наблюдение. Возможно, увеличение количества повторностей эксперимента позволит подтвердить и эти различия. В случае BSA заметных изменений ни в случае скорости агрегации, ни в случае времени lag-фазы не наблюдалось.
Повышенная экспрессия и сверхпродукция белка NOS1AP были показаны в образцах мозга пациентов с психическими расстройствами, например, с шизофренией (Wang et al., 2016, PMID: 27237129). Похожие результаты были получены в другой работе для короткого транскрипта гена NOS1AP (Xu et al., 2005, PMID: 16146415). Эта изоформа включает последовательность, кодирующую фрагмент 292–390, способный агрегировать согласно нашим результатам, а также PDZ-связывающий мотив. Было высказано предположение, что при сверхпродукции NOS1AP его мономеры избыточно связывают nNOS, что, возможно, приводит к уменьшению функциональных комплексов NMDA-рецепторов с nNOS. Это в свою очередь может приводить к уменьшению притока кальция в клетку и ферментативной инактивации nNOS. Мы показали, что NOS1AP и его фрагменты 1–291 и 292–390 способны образовывать стабильные агрегаты. Можно предположить, что агрегаты NOS1AP способны титровать nNOS, что препятствует реализации его функциональной роли в клетке и последующей инактивации NMDA-рецепторов. Существует предположение, что снижение активности этих рецепторов связано с развитием шизофрении (Moghaddam and Javitt, 2012, PMID: 21956446). Таким образом, наши данные позволяют предложить новый молекулярный механизм развития симптоматики этого заболевания, основанный на агрегации NOS1AP.
Ген NOS1AP ассоциирован с развитием психических расстройств, в частности, шизофрении (Wang et al., 2016, PMID: 27237129). Ранее были описаны случаи сосуществования болезни Паркинсона, известной синуклеинопатии, и шизофрении (Winter et al., 2006, PMID: 16958952). Кроме того, есть данные о том, что пациенты с расстройствами шизофренического спектра имеют повышенный риск развития болезни Паркинсона (Kuusimäki et al., 2021, PMID: 33405293). Таким образом, можно предположить, что белок NOS1AP участвует в развитии синуклеинопатий. Наши данные о взаимодействии и совместной агрегации этих двух белков впервые позволяют предположить молекулярный механизм, лежащий в основе сосуществования двух патологий: болезни Паркинсона и шизофрении. Повышение локальной концентрации альфа-синуклеина в агрегатах NOS1AP может способствовать его агрегации и развитию синуклеинопатий.