Центр трансгенеза и редактирования генома ИТБМ СПбГУ был создан по приказу №37 от 10.01.2020 ректора СПбГУ Кропачева Н.В. Руководителем центра с момента его создания является Леонова Елена Ивановна, назначенная на должность директора центра этим же приказом. Создание научного коллектива началось с приказа о приеме на работу Леоновой Е.И. от 21.04.2020 № 7866/2 и последующего приказа № 7476/1 от 28.08.2020г. «Об утверждении состава научного коллектива». С момента создания Центра под руководством Леоновой Е.И. ведется активная работа по получению новых трансгенных и нокаутных линий мышей, востребованных в различных научных лабораториях. Используемые в центре методики криоконсервации мышиных эмбрионов и гамет позволяют успешно сохранять полученные линии для дальнейшего использования. Разработаны методики получения рекомбинантных Cas нуклеаз, проведена апробация новых систем генотипирования мышей с короткими делециями в геноме, основанных на оценке коллатеральной активности нуклеазы Cas12a с помощью флуоресцентных зондов.
В результате исследования в 2024 году были получены следующие научные результаты:
Мы провели биоинформатический анализ, который позволил выбрать оптимальную направляющую РНК для внесения делеций в кодирующую последовательность первого экзона гена comt. Эффективность выбранной направляющей РНК была подтверждена in vitro, после чего были проведены микроинъекции в зиготу смеси направляющей РНК и белка Cas9. Для дальнейшей работы была выбрана мышь F0, мозаичная по делеции 17 п.н. После ряда скрещиваний мы получили линию мышей, гомозиготных по выбранной мутации. У полученной нами линии мышей полностью отсутствуют обе формы КОМТ, так как полученная нами делеция со сдвигом рамки считывания возникла в первом кодирующем экзоне в районе второго стартового кодона, с которого начинается трансляция Р-КОМТ. Было показано, что у мышей данной линии за счет инактивации фермента катехол-О-метилтрансферазы происходит изменение баланса метаболитов нейротрансмиттеров в мозге. В частности, уровень 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), ключевого метаболита дофамина, продуцируемого моноаминоксидазой (МАО), был выше в префронтальной коре и в стриатуме у мышей СОМТ КО по сравнению с мышами дикого типа.
Для проведения направленной интеграции трансгена Voltron в геном мыши мы сконструировали плазмиду pVoltron-R26, в которой ген Voltron находится под контролем гибридного промотора CAG, фланкирован последовательностями ROSA26 для проведения гомологичной рекомбинации, а также содержит стоп кассету в промоторной области, фланкированную сайтами LoxP. Эту конструкцию мы инъецировали в цитоплазму зигот мышей вместе с рибонуклеиновым комплексом направляющей sgRNA к локусу ROSA26 и белка Cas9. В итоге родилось 6 детенышей, у двух из которых была выявлена вставка гена с помощью ПЦР анализа, с последующим секвенированием амплифицированнного фрагмента ДНK. Далее полученная нами линия мышей была скрещена с линиями мышей, нокаутных по гену grin3a для получения модельной линии мышей с возможностью оценки изменения активности отдельных нейронов в условиях нарушения кальциевого обмена. Также эта трансгенная линия была использована в качестве исходной для получения мыши с нокаутом гена NOS3. Полученные нами мыши с нокаутом гена NOS3 несли делецию одного нуклеотида, приводящую к возикновению стоп-кодона через два триплета
Была разработана тест система для экспресс-генотипирования мышей, несущих мутации в генах nos3 и pde6b. Данная тест-система основана на in vitro регистрации коллатеральной активности белка Cas12 по эффективности расщепления флуоресцентных репортеров. Полученные нами модели мышей будут использованы в экспериментах по изучению нейрональной активности при нейродегенеративных заболеваний. Создана биоресурсная коллекция криоконсервированных эмбрионов и спермы созданных нами генетически модифицированных нокаутных и трансгенных линий мышей.