Центр трансгенеза и редактирования генома: 2021 г. этап 2

Project: Grant fulfilmentTotal grant fulfilment

Project Details

Description

Деятельность центра направлена на разработку и создание генетических конструкций на основе CRISPR/Cas технологии для выключения генов (knockout), встраивания новых генов (knock in), блокировки трансляции мРНК (knockdown), тканеспецифичной детекции экспрессии генов и других задач, связанных с введением мутаций или редактированием генома млекопитающих. Традиционно для поломки гена используют направленную систему редактирования генома CRISPR/Cas9, а для подавления трансляции мРНК малые интерферирующие РНК. В обоих случаях суть заключается в том, чтобы быстро и точно определить целевую последовательность нуклеиновых кислот с помощью направляющей РНК по принципу комплементарности и внести разрыв с помощью нуклеаз. Однако, специфичность связывания как направляющих РНК для Cas9, так и малых интерферирующих РНК не очень точная, что зачастую вызывает побочные эффекты, а именно нецелевое уничтожение генов или их транскриптомов в клетке.
Задача данного проекта - оценить in vitro эффективность и специфичность новой одноэффекторной РНК-управляемой нуклеазы PguCas13b, выделенной из микроорганизма Porphyromonas gulae. Нуклеаза PguCas13b относится к системе CRISPR/Cas типа VI и является одним из ортологов Сas13b. Системы CRISPR-Cas типа VI содержат один эффекторный белок Cas- нуклеазу, управляемый РНК. На данный момент в системе CRISPR/Cas типа VI идентифицировано четыре эффекторных Cas13: Cas13a (ранее известный как C2c2), Cas13b, Cas13c, Cas13d, каждый из которых имеет ряд ортологов, свойства которых может отличаться, несмотря на общий принцип строения: два нуклеотид-связывающих доменов (HEPN), которые обеспечивают расщепление РНК. Предположительно, что все нуклеазы системе CRISPR/Cas типа VI проявляет две различные активности рибонуклеазы: одну для процессинга пре-кРНК, а другую для расщепления цис- и транс-РНК-мишенью. Программируемая природа ферментов Cas13 делает их привлекательной отправной точкой для разработки инструментов распознавания, связывания и разрушения РНК в клетках млекопитающих. Недавние исследования ортолога PspCas13b, выделенного из микроорганизма из Prevotella sp. продемонстрировали высокую эффективность и специфичность расщепления РНК в клетках млекопитающих, что предполагает, что еще не исследованный ортолог PguCas13b будет обладать такой-же высокой эффективностью и специфичностью.
Результаты работы позволят оценить точность взаимодействия PguCas13b с таргетным РНК субстратом. Если результаты эксперимента выявят 100% специфичность направляющей РНК Pgu Cas13b в РНК-мишени, то это откроет новые направления использования данной нуклеазы для быстрого и точного распознавания нуклеиновых кислот в клетке, что важно при программируемом подавлении трансляции мРНК, разработки тест-систем диагностики нуклеиновых кислот и исследования новых инновационных препаратов генной терапии. Каталитически неактивный PguCas13b можно будет также использовать в качестве программируемого РНК-связывающего белка, который мы адаптировали для отслеживания транскриптомов в реальном времени. То, что выбранная нами изоформа PguCas13b к данному моменту не была исследована на эффективность и специфичность, дает нам преимущество в возможности как публикации, так и патентования результатов.
Short titleGZ-2021
AcronymITBM_2020 - 2
StatusActive
Effective start/end date1/01/2131/12/21