Физиологическая и биохимическая характеристика инфекционных цитоплазматических белковых агрегатов

    Project

    Project Details

    Description

    Исследование свойств нового штамма приона может дать ключ к пониманию сходств и отличий механизмов агрегации амилоидогенных белков в клетках дрожжей и в клетках млекопитающих. Такая информация имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, с точки зрения выявления факторов, влияющих на агрегацию амилоидогенных белков, и, таким образом, влияющих на возникновение, развитие или ремиссию болезней, связанных с неправильной укладкой белка (болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, болезнь Паркинсона).
    В научной группе проф. Форберг в Германском Центре Нейродегенеративных Заболеваний была разработана уникальная модельная система анализа агрегации прионогенных белков, в частности, Sup35NM, в клетках млекопитающих. Именно здесь было показано, что прионогенные участки дрожжевых белков ведут себя в клетках млекопитающих как настоящие прионы. Лаборатория располагает передовым оборудованием для микроскопического и биохимического анализа внутриклеточной агрегации белков и межклеточной передачи приона.
    Проф. Чернов Ю.О., возглавляющий лабораторию Геномных и протеомных исследований, является признанным экспертом мирового уровня в области биологии прионов дрожжей. В лаборатории налажены методы дрожжевой трансформации и фенотипической детекции приона в дрожжевых клетках. Кроме того, отработаны все методические подходы для анализа агрегации белка Sup35NM in vitro, а именно:
    - отработан метод очистки рекомбинантного Sup35NM c минимальным уровнем спонтанной агрегации;
    - отработан метод затравления агрегации мономерного Sup35NM дрожжевыми лизатами, содержащими прионизированный Sup35NM.
    Отработанные методы являются ключевыми для проведения исследования, т.к. минимальный уровень спонтанной агрегации рекомбинантного белка позволяет воспроизводить в системе in vitro конформацию приона, присутствующего в дрожжевом лизате. Сочетание методического потенциала двух лабораторий является несомненным преимуществом данного проекта, позволяющем провести исследование на высочайшем уровне. Результаты исследования планируются к оформлению в виде статьи(ей), которые будут поданы в высокорейтинговые научные журналы.

    Layman's description

    Прионные заболевания (губчатые энцефалопатии млекопитающих) и амилоидогенные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, диабет второго типа) это группа неизлечимых и летальных болезней млекопитающих и человека, характеризующихся накоплением в тканях и органах амилоидов – полимерных белковых агрегатов, возникающих за счет образования межмолекулярных кросс-бета структур. В образовании агрегатов участвует белок, специфический для каждого конкретного заболевания и в норме присутствующий в клетке в растворимом состоянии. Агрегация запускается при появлении в клетке молекул белка, имеющих третичную структуру, альтернативную растворимой форме и обладающих способностью к агрегации. Кроме того, они способны взаимодействовать с молекулами в растворимой форме, меняя их конформацию на альтернативную. Поэтому, такие заболевания называют также «болезнями неправильной укладки белков».
    В научной группе проф. Форберг в Германском Центре Нейродегенеративных Заболеваний была разработана уникальная модельная система анализа агрегации прионогенных белков, в частности, дрожжевого белка Sup35NM, в клетках млекопитающих. Выявлено, что прионогенные участки дрожжевых белков ведут себя в клетках млекопитающих как настоящие прионы. В лаборатории проф. Форберг, в клетках млекопитающих был получен новый штамм приона Sup35NM, не характерный для клеток дрожжей. Исследование физиологических и биохимических свойств нового штамма приона может дать ключ к пониманию сходств и отличий механизмов агрегации амилоидогенных белков в клетках дрожжей и в клетках млекопитающих. Это имеет важное фундаментальное и прикладное (биомедицинское) значение, с точки зрения выявления факторов, влияющих на агрегацию амилоидогенных белков, и, таким образом, влияющих на возникновение, развитие или ремиссию болезней, связанных с неправильной укладкой белка.
    Лаборатория проф. Форберг располагает передовым оборудованием для микроскопического и биохимического анализа внутриклеточной агрегации белков и межклеточной передачи приона. В лаборатории Геномных и протеомных исследований ИТБМ СПбГУ (руководитель - проф. Чернов Ю.О.) налажены методы дрожжевой трансформации и фенотипической детекции приона в дрожжевых клетках и анализа агрегации белка Sup35NM in vitro. Сочетание методического потенциала двух лабораторий позволит провести исследование на высочайшем уровне. Результаты исследования планируются к оформлению в виде статьи(ей), которые будут поданы в высокорейтинговые научные журналы.

    Key findings for the project

    На начальных этапах проекта были сконструированы плазмиды для наработки рекомбинантного белка в клетках бактерий, а также получены препараты полноразмерной и укороченной форм Sup35NM для экспериментов in vitro.
    Приоритетным направлением во время работы в лаборатории DZNE был анализ инфекционности агрегатов полноразмерного и укороченного Sup35NM из лизатов клеток млекопитающих для клеток дрожжей. В отличие от экспериментов in vitro, где может быть оценена только затравляющая способность агрегатов по отношению к мономерному белку, дрожжевая трансформация позволяет также оценить насколько такие агрегаты могут сохраняться и поддерживаться в клетках дрожжей. Для трансформации использовали лизаты клеток млекопитающих, несущие агрегаты полноразмерного Sup35NM, либо агрегаты укороченной формы этого белка с делецией Nтерминального участка N-домена - с 1-го по 39-й аминокислотные остатки - ключевого для агрегации в клетках дрожжей. Такой делеционный вариант Sup35NM не способен к агрегации в клетках дрожжей, а его агрегация в клетках нейробластомы происходит за счет С-терминальной части N-домена (с 98-го по 123-й аминокислотные остатки), ключевой для агрегации в клетках млекопитающих. Результаты эксперимента показывают, что агрегаты укороченной формы Sup35NM эффективно агрегирующей в клетках млекопитающих, но не способной к агрегации в клетках дрожжей, способны затравлять агрегацию Sup35 в клетках дрожжей и вызывать супрессию нонсенс-мутации ade1-14, что фенотипически проявляется в появлении способности у трансформированных клеток расти на минимальной среде без добавления аденина. При искусственном повышении концентрации Sup35NM в клетках дрожжей за счет его сверхпродукции эффективность трансформации возрастала, но только в случае сверхпродукции полноразмерного Sup35NM. Эффективность трансформации дрожжевых клеток при сверхпродукции в них укороченной формы белка не отличалась от варианта, где количество Sup35NM искусственно не модифицировалось. По-видимому, агрегаты укороченной формы Sup35NM из клеток млекопитающих вызывают в клетках дрожжей агрегацию полноразмерных белков Sup35/Sup35NM по С-терминальной части N-домена, что, в свою очередь может дополнительно индуцировать агрегацию и N-терминальной части N-домена, присутствующую в эндогенном Sup35/Sup35NM и являющуюся ключевой для агрегации в дрожжах. Следует отметить, что агрегаты полноразмерного Sup35NM из клеток млекопитающих не обладали способностью затравлять агрегацию эндогенного Sup35 в клетках дрожжей. Этот феномен требует дальнейшего исследования. Причиной невозможности воспроизводства и поддержания таких агрегатов может являться, например, токсичность этих форм приона для дрожжевых клеток, либо пострансляционная модификация Sup35NM в клетках млекопитающих, препятствующая передачи прионной структуры неагрегированному белку в клетках дрожжей. В результате экспериментов по трансформации дрожжей агрегатами укороченной формы Sup35NM из клеток млекопитающих было отобрано более 70 дрожжевых клонов, несущих различные штаммы приона Sup35. В настоящий момент проводится классификация штаммов приона по эффективности нонсенс-супрессии, свойства вариантов приона различной силы будут проанализированы по плану, представленному ниже. В ходе командировки были освоены приемы работы с культурами клеток млекопитающих. Был наработан, собран и заморожен клеточный материал культур нейробластомы, экспрессировавших полноразмерный и различные укороченные варианты Sup35NM и несущие агрегированные или растворимые формы этих белков. Собранный материал будет использован в экспериментах in vitro для приготовления клеточных лизатов, несущих агрегаты различных форм Sup35NM, а именно:
    1. При проверке агрегирующей способности лизатов по отношению к растворам полноразмерного и укороченного мономерного рекомбинантного белка.
    2. Для физико-химического анализа амилоидных фибрилл, образованных при затравке полноразмерного и укороченного мономерного Sup35NM клеточными лизатами, включающего в себя
    - сравнительный анализ термолабильности и устойчивости к детергентам агрегатов полноразмерного или укороченного Sup35NM, полученных при затравлении мономеров лизатами клеток дрожжей или млекопитающих, соответственно, при помощи гель-электрофореза;
    - анализ способности агрегатов, образованных полноразмерным белком, вызывать агрегацию мономеров укороченного фрагмента и наоборот. - оценку размеров образующихся агрегатов с использованием таких методик, как полуденатурирующий электрофорез в агарозном геле;
    - ограниченный протеолиз фибрилл и анализом протеолитических фрагментов для идентификации участков аминокислотной цепи, образующих амилоидный кор.
    Наряду с лизатами клеток нейробластомы, в этих экспериментах планируется использовать лизаты клеток дрожжевых клонов, несущих различные по силе штаммы приона, полученные при трансформации клеток дрожжей агрегатами Sup35NM из клеток млекопитающих.
    AcronymD. Mendeleev 2018
    StatusFinished
    Effective start/end date3/09/183/12/18