Получение проб к локусам хромосом когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis методом механической микродиссекции хромосом

Project

Project Details

Description

Ядерные домены представляют собой сложные РНК-белковые комплексы, часть из которых обнаруживается в ассоциации с определенными геномными локусами и принимает участие во внутриядерном метаболизме РНК. Некоторые ядерные домены, например ядрышки, формирующиеся в локусах ядрышковых организаторов, являются универсальными компонентами ядер и присутствуют в большинстве соматических клеток разных типов.Другие ядерные домены, такие как ядерные стресс-тельца, обнаруживаются только в конкретных типах клеток и/или в определенных условиях, например, при тепловом шоке. К отдельному типу (или типам) ассоциированных с хромосомами ядерных доменов, по-видимому, можно отнести ранее охарактеризованные «сложные» и «маркерные» петли, сферы и гранулы, встречающиеся на диплотенных хромосомах типа ламповых щеток из ооцитов амфибий и птиц. В настоящее время геномная композиция, состав транскрибируемых последовательностей и функции этих структур остаются невыясненными. Вместе с тем, характеристика локусов формирования этих морфологически-разнообразных доменов необходима для исследования механизмов сборки ассоциированных с хромосомами ядерных доменов в половых и соматических клетках, что представляет актуальную проблему современной биологии клеточного ядра.
Одним из подходов к определению геномных координат и РНК-компоненты локусов формирования ядерных доменов является механическая микродиссекция локусов формирования ядерных структур и высокопроизводительное секвенирование. Механическая микродиссекция с использованием стеклянных капилляров позволяет изолировать субхромосомные районы, соответствующие «бэнду» метафазных хромосом и хромомерам и индивидуальным петлям хромосом типа ламповых щеток. Ранее данный метод был успешно применен нашей группой для микродиссекции участков хромосом курицы в основании ядерных структур с последующей амплификацией invitro, флуоресцентной гибридизацией in situ и секвенированием следующего поколения (NGS) (Zlotina et al., 2016).
В качестве объекта исследования в данном проекте будут использованы хромосомы типа ламповых щеток, выделенные из ядер ооцитов когтистой шпорцевой лягушкиXenopus tropicalis. Xenopus tropicalis является классическим модельным объектом, многие аспекты физиологии, генетики и развития которого детально изучены (см. http://www.xenbase.org). Метод получения хромосом типа ламповых щеток, а также сами хромосомы ламповых щеток, несущие разнообразные маркерные структуры (такие как сложные боковые петли, разнообразные сферы и гранулы) подробно описаны ранее (Penrad-Mobayed et al., 2009). Кроме того, геном Xenopus tropicalis секвенирован и размещен в базе геномных данных NCBI, что позволяет проводить выравнивание секвенированных последовательностей на референсный геном.
Цель проекта (поездки): Получение проб к локусам хромосом когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis методом механической микродиссекции хромосом.
Задачи и этапы выполнения проекта:
1) получение препаратов хромосом типа ламповых щеток Xenopus tropicalis, отбор препаратов для диссекции;
2) транспортировка препаратов хромосом в Университете г. Йены;
3) Механическая микродиссекция локусов хромосом когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis;
4) получение первичного амплификата диссектированных локусов методом DOP-PCR;
5) транспортировка проб диссектированного материала в СПбГУ
В результате выполнения проекта планируется получить панель проб к локусам формирования ядерных доменов хромосом когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis с целью последующего анализа их состава методом NGS, а также транскрипционной активности и специфичности методом FISH и RT-PCR. Полученные панели проб будут использованы при выполнении квалификационной работы студента магистратуры, специализирующегося на кафедре Цитологии и гистологии СПбГУ.
Механическая микродиссекция и получение первичного амплификата диссектированных локусов будут проведены в Лаборатории молекулярной цитогенетики, Института генетики человека, Университета им. Фридриха Шиллера г. Йена (Германия) (http://www.humangenetik.uniklinikum-jena.de/en/Research/Molecular+Cytogenetics/Co_workers.html) совместно с нашими партнерами -проф. Томасом Лиром и пост-доком Ахмедом Хамид Аль-Рикаби. Лаборатория молекулярной цитогенетики - одна из ведущих лабораторий, специализирующихся на получении уникальных зондов для проведения флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в разных технологических вариантах, в том числе многоцветной FISH. Лаборатория Томаса Лира (Университет г. Йены, Германия) обладает всем необходимым оборудованием для проведения микродиссекции и цитогенетических исследований. В лаборатории имеется 5-канальный флуоресцентный микроскоп (Axioplan2, Zeiss), 8-канальный флуоресцентный микроскоп (Axioplan2, Zeiss - дополнительно оборудованный SKY-устройством и программным обеспечением для 3D-анализа), каждый с CCD-камерой и соответствующим программным обеспечением кампании MetaSystems. Также имеются два инвертированных микроскопа (IM 135, Zeiss), доступные для микродиссекции на основе стеклянных игл. Для проведения ПЦР с вырожденными праймерами (для реамплификации образцов и мечения) имеются два амплификатора.
Данная работа является продолжением предыдущего успешного сотрудничества двух лабораторий в рамках межвузовского обмена, завершившегося публикацией совместных статей в журналах и ряда тезисов докладов (сотрудники лаборатории-партнера N.Kosyakova (Косякова Н.) и T.Liehr (Лир Т.)):
1. A. Maslova, A.Zlotina, N.Kosyakova, M.Sidorova, A.Krasikova Three-dimensional architecture of tandem repeats in chicken interphase nucleus. Chromosome Research 2015 23 (3): 625-639. 10.1007/s10577-015-9485-5
2. Anna Zlotina, Nadezda Kosyakova, Thomas Liehr, Alla Krasikova Microdissection as an approach for investigation of genomic context of chromomeres in lampbrush chromosomes. Chromosome Res (2016) 24 (Suppl 1):S1–S48.
3. Anna Zlotina, Tatiana Kulikova, Nadezda Kosyakova, Thomas Liehr and Alla Krasikova Microdissection of lampbrush chromosomes as an approach for generation of locus-specific FISH-probes and samples for high-throughput sequencing. BMC Genomics (2016) 17:126. DOI 10.1186/s12864-016-2437-4
4. Злотина А.М., Куликова Т.В., Косякова Н., Лир Т., Красикова А.В. Микродиссекция хромосом типа ламповых щеток как подход к изучению гетерохроматиновых районов хромосом. Сборник тезисов V молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (18-21 сентября 2016, Санкт-Петербург, Россия). С.21.
5. Красикова А.В., Маслова А.В., Фишман В.С., Баттулин Н.Р., Серов О.Л., Злотина А.М., Косякова Н., Лир Т., Дедух Д.В., Червякова Д.А., Куликова Т.В. Трехмерная архитектура генома и локус-специфичные домены в клеточном ядре. Сборник тезисов V молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (18-21 сентября 2016, Санкт-Петербург, Россия). С.33-34.
6. Anna Zlotina, Nadezda Kosyakova, Antonina Maslova, Thomas Liehr, Alla Krasikova Lampbrush chromosome microdissection as an approach to comprehensive investigation of heterochromatic chromosome regions. Molecular Cytogenetics 2017, 10(Suppl 1):20.
7. Anna M. Zlotina, Antonina V. Maslova, Nadezda V. Kosyakova, Thomas Liehr, Alla V. Krasikova 3D architecture of japanese quail DNA repeats in interphase nucleus. CompCytogen 12(3): 299–360 (2018). Р.359-360.
8. Tatiana V. Kulikova, Lyudmila V. Kazakova, Antonina V. Maslova, Dmitry V. Dedukh, Irina L. Trofimova, Thomas Liehr, Alla V. Krasikova Loci-specific RNP-rich nuclear domains on lampbrush chromosomes: data pointing at RNA editing. CompCytogen 12(3): 299–360 (2018). Р.338-339.

Проф. Томас Лир (Thomas Liehr), приглашающий ученый, Scopus Author ID: 55130171800. Индекс Хирша (по Scopus Author ID) – 41. Является автором более 650 работ по молекулярной цитогенетике и ряда монографий, посвященных методу флуоресцентной in situ гибридизации.
Входит в состав редакционных коллегий следующих журналов:
Molecular Cytogenetics (Scopus, Q3)
Journal of Histochemistry & Cytochemistry (Scopus, WoS, Q1)
European Journal of Medical Genetics (EJMG) (Scopus, Wos, Q1)
Journal of Genetics and Genomes
Oncology Letters (Scopus, WoS, Q3)
Journal of Science and Technology (RMU)
BioMed Research International (Scopus, Wos, Q1)
Journal of Pediatric Neurology (Scopus, Q4)
Balkan Journal of Medical Genetics (Scopus, Q4)

Layman's description

Проект направлен на получение проб к локусам особых (маркерных) петель и локусам формирования ядерных доменов на хромосомах типа ламповых щеток из ооцитов когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis методом механической микродиссекции.

Key findings for the project

В результате выполнения проекта получены препараты хромосом типа ламповых щеток когтистой шпорцевой лягушки Xenopus tropicalis, препараты хромосом в количестве 6 штук перевезены в Университет им. Фридриха Шиллера, г.Йена, Германия. В лаборатории Молекулярной цитогенетики Института генетики человека проведена механическая микродиссекция локусов формирования ядерных доменов с разных хромосом кариотипа (хромосомы 1-10) на доставленных препаратах. Всего диссектировано и подготовлены библиотеки (пробы) 36 различных хромосомных локусов, включая терминальные гранулы, тельца гистонового локуса, глыбчатые петли, гигантские сливающиеся петли, мега-сливающиеся петли и «жемчужины» (pearls). Проведена первичная амплификация и реамплификация (R1) диссектированного материала методом DOP-PCR. Качество подготовленных проб проверено методом электрофореза в агарозном геле. Анализ гелей показал наличие амплифицированных продуктов во всех пробах. ДНК-пробы доставлены в Санкт-Петербургский государственный университет для проведения научно-исследовательской работы. В дальнейшем планируется оценка специфичности полученных панелей проб методом FISH.
Дополнительно, в результате поездки были получены пробы к 22 хромосомам Pelophylax lessonae (2n=26) с целью получения цельнохромосомных пэйнтов. Данные пробы планируется использовать в дальнейшем для сравнительного цитогенетического анализа близкородственных видов из комплекса зеленых лягушек в соответствующих НИР, выполняемых в лаборатории Структуры и динамики клеточного ядра кафедры Цитологии и гистологии СПбГУ. Полученные панели проб будут использованы при выполнении квалификационной работы студента магистратуры, специализирующегося на кафедре Цитологии и гистологии СПбГУ.
В ходе общелабораторного семинара в лаборатории Молекулярной цитогенетики (05.12.18) мною был сделан устный доклад «Lampbrush chromosome (LBC) microdissection:
analysing chromomeres, loops and heterochromatic chomosome regions».
Принимающий ученый: профессор Томас Лир (Thomas Liehr)
AcronymIMP 2018
StatusFinished
Effective start/end date26/11/1810/12/18